用于治疗与异常细胞迁移相关的诸如癌症等疾病的具有药学活性的肽的制作方法

专利名称：：用于治疗与异常细胞迁移相关的诸如癌症等疾病的具有药学活性的肽的制作方法用于治疗与异常细胞迁移相关的诸如癌症等疾病的具有药学活性的肽本发明涉及成盐或未成盐形式的线性肽及其功能等同衍生物，包含四或五个氨基酸残基，其中至少一个是疏水性的并且至少两个是碱性的，下文称作"PICM"(细胞能动性的肽抑制剂)，以及涉及包含它们作为活性成分的药物组合物。本发明的化合物可有效治疗和预防肺瘤，特别是具有高度侵袭性和/或易于转移的那些肿瘤，并且可有效治疗与新血管发生和新血管形成相关联的病症，以及与异常细胞能动性相关的病症诸如自身免疫疾病和慢性炎症像类风湿性关节炎和牛皮癣，慢性肉芽肿，视网膜病，黄斑变性和水肿，Kaposi氏肉瘤和与疱渗病毒感染相关联的疾病。
背景技术：
：目前的肿瘤治疗受到高度恶性细胞类型存在的限制，所述细胞类型在本性上不能对常规治疗起反应(神经胶质瘤，肉瘤等)，或者受到发生的选择性益处的限制，其在治疗期间促进耐受性胂瘤克隆的选择和随后的增殖(『o^//^"M,EC.爭乂，CVmcwM..J529-J537，7997)。常规的治疗主要设计来抑制肿瘤的生长而不是阻止其转移扩散，而转移扩散仍然是治疗失败的主要原因(57^v&丄v4爭人CWicw丄ert,/9S:MW)。目前肿瘤治疗的一般特征是使用高度细胞毒性的化合物，尽管它们选择性地作用于恶性细胞上，但其不可避免地对于机体具有破坏性地系统作用。造成的结果是，目前的治疗通常包括非常高的社会、人和经济成本。这种总体情况表明a)对于目前不能治疗的肿瘤迫切需要发展有效的治疗方法；b)非常有必要减少副作用，在用目前的抗肿瘤药物治疗患者时，所述副作用使得患者的生活质量降低到无法接受的程度，甚至能够引发衰弱患者的死亡；c)需要通过使用既干扰肿瘤生长过程也干扰肿瘤转移扩散6的药物，来提高治疗的效力；d)需要使肿瘤治疗的成本更加令人可以接受。最近有才艮告称源自人和鼠的肽Metastin的多种生物学作用(WO卵/2M卯，『OW/75JW，『002/S53")包括预防或治疗癌症的作用。涉及Metastin及其衍生物的^X^6/(9W499，要求保护非常宽泛的化合物系列，该化合物系列估计有超过10"种不同的结构，包含4到54个天然或非天然的氨基酸残基，对其报告了非常多的生物学活性，诸如抑制肿瘤的转移扩散和生长、控制胰腺功能和预防急性和慢性胰腺炎、控制胎盘功能以及用于治疗胎儿低常增生、葡萄糖代谢异常、脂代谢异常、不育症、子宫内膜异位症、青春期早熟、阿尔茨海默症、影响认知区域的病症、肥胖症、高脂血症、糖尿病II型、高血糖症、高血压、糖尿病性神经病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、水肿、泌尿系统病症、胰岛素抗性、不稳定型糖尿病、脂性萎缩、胰岛素变应性、动脉粥样硬化、血栓形成病症、脂毒症，以及用于提高性腺功能和刺激排卵的治疗中。考虑到这类分子的治疗应用，这些化合物每一种都同时存在的这些不同生物学作用当然代表了一种主要的限制，而不是益处。这种广泛的生物学作用与Metastin及其衍生物和特异性细胞受体GPR54(也称作Kiss-1R、Kissp印tins受体、Metastin受体、hypogonadotropin1或hOT7T175)的相互作用紧密相关(0/i似A:/7:爭人，7Vfl似/rW7.'6"-6J7,C7e附e"^M.A;爭乂，j&Zoc/^附.B/o/;/^s./e,s.CV朋w簡，//駒TO,慶/;編"./.爭人,J.C/w附.276:2M/;M.爭入，/J5"/.Oe附.276:200/;S麵"婦5，.i5.爭入，TV.E"g/.她dJ乾./6/"627，2,;GW""磨d/.爭乂，7Vfl/w/^42S.'529-5J5，20^/;CW/WgeWK凡，7>rwAEw^cr/wo/.A/e似6.95S-96J，2Q^/;/fl/iweflw爭人，丄C7/".EwdocW/io/.S7.'2Cft2;i/wge/MD.爭乂，/C7zw.五wctocW"o/.Me似6.S7,.2卵2;甴iV.爭入，7V"《/.Jc^^.Sc/.f/.5".A/卵柳72-譜76，2,;M.爭乂，丄C"戲f紐C7/".。歸/.，.'必編"M爭入，丄CV〃"7..2J79-2n2,;^由,丄A丄爭入，丄('//".E"f/簡Vi0/.飽W.紧/,-/《55，厕5)。关于Metastin及其衍生物的抗肿瘤活性，WW报道了一种限于实验动物模型的中度活性，剂量为70-140ng/kg,其以不超过20%减少肿瘤质量。其还表明长期施用Metastin的一种类似物Kisspeptin-54将引发大鼠性腺萎缩的副作用(五丄77^附mw爭乂，爿附./.发明描述发明涉及成盐或未成盐形式的四肽或五肽及其功能等同衍生物，其包含至少两个碱性以及至少一个疏水性氨基酸(下文以代号PICM表示)，其在体外以aM浓度(10—18M)抑制细胞迁移，并在体内具有强大的抗肿瘤作用，以低至15jig/kg的剂量将肿瘤质量减少30-70%。它们对于所有与新血管发生和新血管形成相关联的病症有效，并且在比治疗剂量高大约1000倍的剂量上不呈现任何急性或亚急性毒性。不像Metastin及其衍生物，本发明肽的活性并不与细胞受体GPR54相关联，而是与它们和FPR细胞受体的特异性相互作用密切关联。已知一些FPR受体拮抗剂(仏/w^y/s爭人Afo//Vmr附fl"/.6S.'它们全部在化学上都有别于PICM。因此PICM代表新的一类活性成分，其具有比Metastin及其衍生物以及FPR受体拮抗剂的活性强得多并且显著不同的生物学和药学活性。在临床实践中，PICM可低剂量起作用而有效对抗大量肿瘤，并且不呈现任何系统性毒性或副作用。PICM还可有效治疗与新血管发生和新血管形成相关联的病症，以及与异常细胞能动性相关的病症诸如自身免疫疾病和慢性炎症像类风湿性关节炎和牛皮癣，慢性肉芽肿，视网膜病，黄斑变性和水肿，Kaposi氏肉瘤和与疱渗病毒感染相关联的疾病。发明详述本发明的成盐或未成盐形式的肽及其功能等同衍生物具有通式L广X!-X2-X3-X4，其中L！是H或酰基或任选地N-酰基化或N-烷基化和/或Coc-烷基化的任何天然或非天然的氨基酸；优选地，1^是H或酰基或任选地N-酰基化或N-烷基化和/或Coc-烷基化的Glu、Gln,任选地N-酰基化和/或Ca-烷基化的Pro、羟基-Pro、硫代-Pro、Azt、Pip、pGlu，任选地N-酰基化或N-烷基化的Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c、Ac6c;甚至更加优选地Lj是H或酰基，任选地N-酰基化或N-烷基化的Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c或Ac6c;&和X3是相同的或不同的，为任选地N-烷基化和/或Ca-烷基化的任何天然或非天然的碱性氨基酸；优选地，X,和X3是任选地N-烷基化和/或Ca-烷基化的相同的或不同的氨基酸，选自任选地p瓜基化的Arg、Orn、Lys,以及在间位或对位由胺基或胍基所取代的苯丙氨酸；X2是任选地N-烷基化和/或Ca-烷基化的任何天然或非天然氨基酸，前提为其并非甘氨酸或在a^原子上由1-10个碳原子的线性或环状烷基单一取代的氨基酸，或在a^原子上由包含4-10个碳原子的线性或环状烷基单一取代的氨基酸，或在a^原子上由包含1-8个碳原子的烷基单一取代的氨基酸，任选地由氨基甲酰基，幾基或芳基所取代；X2优选地选自任选地N-烷基化和/或Cot-烷基化的Glu、Lys,任选地N-烷基化的Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c和Ac6c;更优选地，乂2选自任选地N-烷基化的Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c和Ac6c;X4是任选地Ca-烷基化和/或在C末端酰胺化的任何疏水氨基酸，或任选地N，-烷基化或N，-酰基化的任何疏水性氨基醇或任何疏水性偕二胺；X4优选地选自Phe、h-Phe、Tyr、Trp、l-Nal、2-Nal、h隱l-Nal、h-2-Nal、Cha、Chg和Phg，其任选地是Ca-烷基化的和/或在C末端酰胺化的。"天然氨基酸"指构成活体生物的蛋白质的氛基酸。9"非天然氨基酸"指D系列的oc-氨基酸或P-氨基酸；脱氢氨基酸；在a碳原子上由包含最多11个碳原子的烷基或芳基双取代的氨基酸；如上所定义的天然氨基酸，在其侧链上包含由含有1-11个碳原子的烷基、酰基、芳基或酰基芳基所官能化的羟基、M或硫基；如上所定义的天然氨基酸，在其侧链上包含由含有最多11个碳原子的伯胺或仲胺或脂族醇或芳香醇所官能化的氛基；环状氨基酸诸如Azt、硫代-Pro、Ac3c、Ac4c、Ac5c、Ac6c和pGlu酸；高氨基酸；由环烷基或芳基取代的氨基酸，诸如0-l-萘基-丙氨酸、P-2-萘基-丙氨酸、高-P-l-萘基-丙氨酸、高-P-2-萘基-丙氨酸、环己基-丙氨酸、环己基-甘氨酸和苯基-甘氨酸。其它非天然氨基酸在"Diversityofsyntheticpeptides",Konishi等人FirstInternationalPeptideSymposium,Kyoto,Japan,1997中有才艮道。术语"任何碱性氨基酸"指如上所定义的任何天然或非天然氨基酸，在侧链上包含至少一个咪唑，氨基，胍基，吡啶鐵或脲基团。术语"任何疏水性氨基酸"指一系列a-、P-和脱氢氨基酸Leu、n-Leu、Ue、allo-Ile、Val、n-Val、Phe、h-Phe、Tyr、Trp、l-Nal、2-Nal、h-l-Nal、h-2-Nal、Cha、Chg和Phg;如上所定义的天然和非天然氨基酸，在其侧链上包含由含有l-ll个碳原子的烷基、酰基、芳基或酰基芳基所官能化的羟基、氨基或硫基；如上所定义的天然和非天然氨基酸，在其侧链上包含由含有最多11个碳原子的伯胺或仲胺或脂族醇或芳香醇所官能化的羧基；在芳香环的邻位、间位和对位上由卣素或由烷基、O-烷基或S-烷基单和双取代的苯丙氨酸；P-2-和P-3-噻吩基丙氨酸、P-2-和P-3-呋喃基丙氨酸；由含有最多ll个碳原子的烷基、酰基、芳基或酰基芳基所官能化的2,3二氨基丙酸和2，4二氨基丁酸的衍生物。术语"任何疏水性氨基醇"指如上所定义的"任何疏水性氨基酸"，其中羧基官能团由OH基团所取代。术语"任何疏水性偕二胺"指如上所定义的"任何疏水性氨基酸"，其中絲官能团由NH2基团所取代。术语"酰基"意指包含l-9个碳原子的酰基基团。术语"N-酰基化的"意指向末端氛基氮上导入如上所定义的酰基。术语"N-烷基化的"意指向酰胺氮上导入包含1-9个碳原子的烷基残基。术语"酰胺化的"意指用包含总共0-14个碳原子的伯胺或仲胺酰胺化C-末端氛基。术语"Coc-烷基化的"意指向a碳原子上导入包含1-9个碳原子的烷基残基。术语"功能等同衍生物"意指具有通式I的化合物的衍生物，其特征是通过在肽化学中常用的结构修饰来调节它们的药物动力学或药物代谢动力学特性。这些包括假肽，其中一个或多个肽键由-CH2-NH-所取代(G〃/(力"/W(7爭乂,/J/o/C/m附./26057-9/995)，具有一个或多个反向肽键的4汙生物(CarottiA.等人，Biopolymers60，322-332，2001;Chorev,M.等人Science204，1210—12121979;Pallai，P.等人Biochemistry24，1933—1941.1985;RodriguezM.E.等人J.Med.Chem.30，758—7631987),P-肽衍生物(HomeW.S.等人J.Am.Chem.Soc.1294178-41802007)，其中一个或多个肽键由至少一个P-氨基酸形成，以及包含一个或多个脱氢氨基酸的衍生物(BusettiV.等人，Int.J.Biol.Macromol.14，23-281992)。具有从N-末端侧链延长的链的衍生物也是功能等同衍生物。下列是一些非天然氨基酸的常用缩写，这些非天然氨基酸可以包括在根据本发明的肽的通式中Azt=杂氮环丁酸，Aib=a-氨基-异丁酸，Ac3e=1-氨基环丙烷-l-羧酸，Ac4c=l-氨基环丁烷-l-羧酸，Ac5c-l-氨基环戊烷-l-羧酸，Ac6c=l-氨基环己烷-l-羧酸，Abu=a-氨基-正丁酸，n-Leu=正亮氨酸，n-Val-正缬氨酸，h-Phe=高苯丙氨酸，1-Nal=P-l-萘基-丙氨酸，2-Nal=P-2-萘基-丙氨酸，h-l-Nal=高-0-1-萘基-丙氨酸，h-2-Nal=高—P-2-萘基-丙氨酸，Cha=环己基-丙氨酸，Chg=环己基-甘氨酸，Phg=苯基-甘氨酸，pGlu-焦谷氨酸，Dap=2,3二氨基-丙酸，Dab=2,4二氨基丁酸，N(Me)Arg^N-甲基-精氨酸，ot(Me)Phe=C-ot-甲基-苯丙氨酸。优选地，Ll是乙酰基、Glu、pGlu、乙酰基-Aib,X！是Arg或N(Me)Arg，X2是Glu、Aib、Ac5c，乂3是Arg、IN(Me)Arg，而X4APhe-NH2、Tyr-NH2、Trp-NH2、oc(Me)Phe-NH2、Phe-OH、Tyr-OH、Trp-OH。根据本发明特别优选的肽选自Ace-Arg-Glu-Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Glu-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Aib-Arg-Phe-NH2;Ace画Arg-Aib-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Ac5c-Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Ac5c-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-N(Me)Arg-Aib-Arg-Phe-NH2;Ace誦N(Me)Arg-Aib-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Aib-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Arg國Aib-Arg-a(Me)Phe-NH2;Ace-N(Me)Arg-Aib-Arg-a(Me)Phe-NH2;Ace-N(Me)Arg-Aib-N(Me)Arg-a(Me)Phe-NH2;Ace-Arg-Aib-N(Me)Arg-oc(Me)Phe-NH2。本发明的肽可以用文献中报道的各种技术合成；参见例如，Schroeder等人"ThePeptides"vol1，AcademicPress,1965;Bodanszky等人"PeptideSynthesis"IntersciencePublisher,1966;Barany&Merrifield，"ThePeptides;Analysis,Synthesis,Biology"，2，第一章，AcademicPress,1980。这些技术包括固相肽合成，溶液中的肽合成，有机化学合成方法，或其任意组合。所选的合成方法显然将取决于特定肽的组成。优选地，所用的方法将基于固相技术和经典溶液中方法的适当结合，其生产成本低，特别是在工业M^莫上。详细地，这些方法包括i)在溶液中合成肽链片段，通过将适当活化的N-保护氨基酸连续偶联到氨基酸或C-保护的肽链上，分离中间产物，随后对所述片段的N和C末端进行选择性去保护，必要时对侧链去保护来进行合成，直到获得所需肽；ii)在不可溶的多聚物介质上从C-末端到N-末端固相合成肽链。在合适清除剂存在的情况下，通过用无水氢氟酸或三氟乙酸水解将肽从树脂上除去。本发明的肽可有效作用于许多类型的人和动物肿瘤，阻止其生长和转移扩散。关于抗肿瘤效果和有效剂量，本发明的化合物是有益的，特别是与12Metastin和在WO06/001499中报道的有关肽相比。在较低的浓度下，本发明的肽在减弱肺瘤方面诱导有效得多的反应(Metastin衍生物减弱20%，本发明产物减弱70。/。)。对于推荐的治疗用途，根据本发明的肽可以以其本身，或以盐的形式配制成口服、胃肠外、局部、喷雾或经皮给药用的药物组合物，也可以结合其它活性成分。人用单位剂量可以在很大范围内变化，一般从每剂O.l照到每剂lg，优选地为每剂O.lmg到每剂100mg，其可以由本领域技术人员根据待治疗的病症、其严重程度和患者的体重、性别和年龄容易地确定。下列实施例更加详细地阐明了本发明。实施例1通式I的化合物PICM1的制备，其中Lj是Ace,X，和X3是Arg，X2是Glu，且X4是Phe-NH2。所以PICM1的％式为Ace-Arg-Glu-Arg-Phe-NH2。使用自动肽合成仪进行合成，以相当于0.5mmol胺基的2.5gRink-酰胺树脂(0.2meq/g)起始。用30%哌啶的DMF溶液将Fmoc基团在两个连续的相中进行水解3min和7min。然后以列出的顺序对下列化合物进行反应Fmoc-Phe-OH(0.581g)，Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.974g),Fmoc-Glu(OtBu)-OH(0.638g)，Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.974g)和乙酸(0.090g)。酰基化作用的持续时间是lh;随后洗涤树脂并以Kaiser茚三酮测定法测试反应。如果反应是阴性的，则在下一个氨基酸偶联之前将Fmoc基团按如上所述进行水解。通过将1.5mmo1氨基酸溶解于4mlDMF中，并与活化剂混合物一起加入到去保护的树脂中而偶联所有氨基酸，所述混合物由含0.780gPyBop的2mlDMF溶液、含0.230gHOBT的2mlDMF溶液和250mlDIEA溶液组成。为了将肽从树脂上分离并同时将侧链去保护，将干燥树脂置于反应器中，向所述反应器中加入重量比为9:0.5:0.3:0.2的TFA,笨琉基甲烷，巯基乙醇和茴香醚的溶液20ml。将反应混合物在13搅动下放置2h。将过滤物减少到小体积并通过用醚沉淀抽提肽。将沉淀物溶于水并冻干。最后，通过反相色语纯化肽并通过分析型HPLC进行表征，使用VydacC180.46x25cm柱，在35min内，以lml/min的流速，相对于0.1。/o(v/v)水性三氟乙酸(相A)，用包含0.1。/。(v/v)三氟乙酸的乙腈(B相)的从5到70%的线性梯度进行洗脱，在210nm用UV检测。停留时间(Rt)=11.8min.;色谙纯度>99%。FAB画MS:(MH)+=650。实施例2式I的化合物PICM2的制备，其中Ll是pGlu，Xi和X3是Arg，X2是Glu和乂4是Tyr。所以PICM2的％式为pGhi-Arg-Glu-Arg-Tyr-OH。使用自动肽合成4义进行合成，以相当于0.5mmo1胺基的2.5gFmoc-Tyr(tBu)-Novasyn-TGA树脂(0.2m叫/g)起始。用30%哌啶的DMF溶液将Fmoc基团在两个连续的相中进行水解3min和7min。然后以列出的顺序对下列氨基酸进行反应Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.974g),Fmoc-Glu(OtBu)-OH(0'638g)，Fmoc-Arg(Pbf)画OH(0.974g)和Fmoc画pGlu-OH(0.638g)。酰基化作用的持续时间是lh;随后洗涤树脂并以Kaiser茚三酮测定法测试反应。如果反应是阴性的，则在下一个氩基酸偶联之前将Fmoc基团按如上所述进行水解。通过将1.5mmo1氨基酸溶解于4mlDMF中，并与活化剂混合物一起加入到去保护的树脂中而偶联所有氨基酸，所述混合物由含0.780gPyBop的2mlDMF溶液，含0.230gHOBT的2mlDMF溶液和250mlDIEA溶液组成。为了将肽从树脂上分离并将側链同时去保护，将干燥树脂置于反应器中，向所述反应器中加入重量比为9:0.5:0.3:0.2的TFA，苯石危基甲烷，巯基乙醇和茴香醚的溶液20ml。将反应混合物在搅动下放置2h。将过滤物减少到小体积并通过用醚沉淀抽提肽。将沉淀物溶于水并冻干。最后，通过反相色谱纯化肽并通过分析性HPLC进行表征，使用VydacC180.46x25cm柱，在35min内，以lml/min的流速，相对于0.1%(v/v)水性三氟乙酸(相A)，用包含0.1%(v/v)三氟乙酸的乙腈(B14相)的从5到70。/。的线性梯度进行洗脱，在B中，在210nm用UV检测。停留时间(Rt)-12.8min;色谱纯度>99%。FAB-MS:(MH)+=589。实施例3用实施例1和2中所述的方法合成的肽的序列和特征数据。表1显示用实施例1中所述的方法合成的一系列肽的序列和特征数据，所述肽由PICM3到PICM39和PICM54到PICM67组成，以及用实施例2中所述的方法合成的一系列肽的序列和特征数据，所述肽由PICM40到PICM53组成，才艮据常用肽合成方法适当地调整以用于特异性序列合成。表1—根据本发明的肽序歹i的例子及其特征<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>AceArgAibN(Me)ArgPhe-NH218.3620PICM20AccArgAibN(Me)ArgTyr-NH218.1636PICM21AceArgAibN(Me)ArgTrp-NH219.3659PICM22pGluArgAibN(Me)ArgPhe-NH214.5688PICM23pGluArgAibN(Me)ArgTyr-NH214.2704PICM24pGluArgAibN(Me)ArgTrp-NH216.0727PICM25pGluArgAibArgPhe-NH215.4674(续)PICM26pGluArgAibArgTyr-NH215.26卯PICM27pGluArgAibArgTrp-NH216.6713PICM28AccArgAc5cArgPhe-NH218.5632PICM29AceArgAc5cArgTyr-NH218.2648PICM30AceArgAc5cArgTrp-NH219.4671PICM31AccArgAc5cN(Me)ArgPhe-NH219.3646PICM32AceArgAc5cN(Me)ArgTyr-NH219.1662PICM33AceArgAc5cN(Me)ArgTrp-NH220.7685PICM34pGluArgAc5cN(Me)ArgPhe-NH217.6714PICM35pGluArgAe5cN(Me)ArgTyr-NH217.4730PICM36pGluArgAc5cN(Me)ArgTrp-NH218.4753PICM37pGluArgAc5cArgPhe-NH216.2700PICM38pGluArgAc5cArgTyr-NH216.0716PICM39pGluArgAc5cArgTrp-NH217.1739PICM40AccArgGluArgPhe-OH11.7651PICM41AceArgGluArgTyr-OH11.5667PICM42AceArgGluArgTrp國OH12.66卯PICM43AccArgGluArg(Me)Tyr-OH12.3681PICM44pGluArgGluArg(Me)Phe-OH12.9733<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例4PICM57对细胞迁移表现出的剂量依赖型抑制。测试实施例3中所述PICM57对于人纤维肉瘤HT1080细胞的细胞迁移的作用。如文献中所报道的，使用装备了聚碳酸酯滤器的Boyden小室，该滤器具有直径8pm(Nucle叩ore)的孔，不含聚乙烯吡咯烷酮，并涂布了5ng/ml的玻连蛋白(Promega)(Owr/ew爭入，Omcc/d59,5^7,/999)。将无血清DMEM(DulbeccoModifiedEagleMedium)中的3x104细胞留存于Boyden小室的上室中。在不断提高浓度的PICM57存在下，将下室充满包含10%FBS(胎牛血清，作为趋化剂的来源)的DMEM。将细胞于3"C在包含5。/。C02的加湿空气中孵育4h。孵育后，机械去除附于滤器上表面的细胞，并将附于滤器下表面的迁移细胞固定在乙醇中，用苏木精染色，并于200倍》文大下随机选择计数每个滤器的10个视野。将在缺少PICM57的情况下响应于FBS的定向性迁移取作100%，以百分比的形式评估PICM57对于细胞迁移的作用。数据代表三次独立实验的平均数，每次实验一式两份。PICM57对HT1080细胞趋向FBS的迁移的拮抗作用是剂量依赖型的(表2)。它开始于laM的浓度，于lfM的浓度达到其最大值的50%,并于10fM的浓度达到最大值(66%的抑制)。在相同实验条件下评估了在Metastin[45-54存在时FBS诱导的迁移(表3)。数据表明需要比PICM57大1000倍的Metastin[45-54]浓度(10nMMetastin[45-54]对10fMPICM57),以4更获得对趋向FBS的定向性迁移的相当水平的抑制。表2-PICM57对于由10。/。FBS诱导的人纤维肉瘤HT1080细胞的定向性迁移的抑制作用，计算为趋向单独10%FBS(视为100。/。)的迁移细胞的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表3-PICM57,PICM1和Metastin[45-54]对于由10%FBS诱导的HT1080细胞的定向性迁移的抑制作用比较，表示为与对照(10。/。FBS)相比迁移细胞的百分比.浓度Metastin[45-54PICM1PICM570100100100laM100997010aM83705410fM73563910pM53463610nM563532实施例5PICM1诱导的对细胞能动性不依赖于细胞系物种或组织发生起源的抑制。采用实施例4中所述的Boyden小室，并使用10%FBS作为趋化剂来源，在100pMPICMl存在/缺失的情况下，将源自各种组织的人或鼠起源的细胞系进行体外定向性迁移测试。将在缺少PICM1的情况下响应于FBS的方向性迁移取作100%，将PICM1对于细另包迁移的作用评估为所述值的百分比。数据代表两次独立实验的平均数，每次实验一式两份。在所有测试的细胞系中，观察PICM1对于细胞迁移的抑制作用(表4)。尽管抑制程度在所用的细胞系之间有所不同，但它从未小于50%，并且在不对Metastin响应的鼠黑素瘤B16细胞(Ohtaki，T.等人(2001)Nature411，613-617)中也观察到抑制作用。表4-PICM1肽对于由10%FBS诱导的人或鼠起源的多种肿瘤细胞系的能动性的抑制作用，表示为与对照(10%FBS)相比迁移细胞的百分比。19起源细胞系名称组织发生10%FBS100pMPICM1人MCF-7乳腺癌37人MDA-MB-231乳腺癌47人A431皮肤癌49人HeLa宫颈腺癌48人U937单核细胞白血病39人M14黑素瘤59人HT1080纤维肉瘤34人Saos2骨肉瘤43鼠B16黑素瘤50实施例6用PICM57预孵育的细胞的能动性抑制。将人纤维肉瘤HT1080细胞与DMEM,或与包含100pMPICM57的DMEM—起孵育0、15、30、60或120min。将该细胞a)用PBS洗涤(磷酸緩冲盐溶液)；b)于23。C用50mM甘氨酸-HCl緩冲液(pH3.0)洗涤5分钟以<更从细胞表面除去肽(C"rWera.爭人C7/".S，"99-A^S"997)，随后用PBS洗涤。将细胞重悬于DMEM中并如实施例4中所述在Boyden小室中进行细胞迁移测试，使用10%FBS作为趋化剂。结果(表5)表示为在缺失FBS(基础迁移，取作100%)情况下迁移的细胞的百分比。数据代表两次独立实验的平均数，每次实验一式两份。细胞与PICM57的简单预孵育显著降低了它们趋向于FBS迁移的能力。15分钟的接触足以使抑制与实施例4中所述的抑制相当。在细胞与100pMPICM57接触后酸处理15或30min完全消除了PICM57对于细胞能动性的抑制作用。20表5-肽PICM57对于用PICM57预孵育过并接触过10%FBS梯度的人纤维肉瘤HT1080细胞能动性的抑制作用预孵育细胞迁移(min)Ci^出迁移的y。)无酸洗涤有酸洗涤0100100039336215983673010335060112ND120120ND实施例7P1CM57表现出的对细胞能动性的抑制作用是由FPR介导的，FPR是对于fMLP具有高亲和性的受体。利用缺少对于细菌源fMLP(N-甲酰基-Met-Leu-Phe)的甲酰基化肽具有高亲和性的受体的大鼠嗜碱性白血病细胞RBL-2H3，如实施例4中所述在Boyden小室中测试肽PICM57对于细胞迁移的作用(丄。K，『"T^flw》/f丄，7Y/附fl朋v,A，iVef/as/7flS0VjA.iS/^rt^MK，D朋/op，/.A^wms".Z，/C7"，2卵7)。使用50pg/ml纤连蛋白或10nMfMLP作为趋化剂。结果表示为在缺失FBS(基础迁移，取作100%)情况下迁移的细胞的百分比。数据代表两次独立实验的平均数，每次实验一式两份。与文献中报道的结果一致，RBL-2H3细胞趋向纤连蛋白迁移但不趋向fMLP迁移。向趋化性梯度中加入100pMPICM57并未减弱纤连蛋白-依赖21型的细胞迁移(表6)。相反地，用FPR的cDNA(RBL-2H3/ETFR)稳定转染的RBL-2H3细胞获得了在由10nMfMLP构成的梯度中迁移的能力。向趋化性梯度中加入100pMPICM57并未减弱纤连蛋白依赖型的细胞迁移，但是将趋向fMLP的细胞迁移减弱到基础水平(表6)。确定的结论即PICM57的靶标是FPR源自于以下观察结果，即在结合测定中，荧光标记的肽甲酰基-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(分子探针)结合到RBL-2H3/ETFR细胞的表面由细l包与10nMPICM57预酵育特异性减弱了60%。细胞与10|iMMetastin45-54]预孵育并不改变荧光标记的f斤生物甲酰基-Nle-Leu-Phe-Me-Tyr-Lys肽与RBL-2H3/ETFR细胞表面的结合。表6-PICM57表现出的对RBL-2H3/ETFR细胞的fMLP-依赖型细胞能动性的抑制作用。细月包迁移(J^出迁移的％)趋化性RBL-2H3RBL-2H3PICM57RBL-2H3/ETFRRBL-2H3/ETFRPICM57____10010010010010nMfMLP1031022709950ng/ml纤连蛋白272275220215实施例8PICM57对细月包增殖的作用。利用96孑L板在100pM或100nMPICM57存在/缺失的情况下，将人纤维肉瘤HT1080细胞(lx103细胞/孑L)接种在舍10%FBS的DMEM中。在24、48、72或96h，除去未附着的细胞，在用PBS反复漂洗后，固定附着到板上的细胞并随后用包含lmg/mlMTT(3-(4，5-二曱基噻唑基-2)-2，5-二苯基四唑溴化物，Sigma)的无菌溶液于37。C染色4h。随后用lOOpl二甲基亚砜除去染色并于540nm通过分光光度计读取相应的光学22密度。在检查的任何时间两种浓度上PICM57的存在都没有改变HT1080细胞的增殖指数(复制时间大约18h)(表7)。当连续4天每天除去培养基并向细胞中加入新鲜10%FBS/PICM57溶液时，在并行的实验中获得相同结果。表7-肽PCM57对于人纤维肉瘤HT1080细胞的FBS依赖型增殖的作用，通过分光光度计光学密度读数来评估(入:540nm)。时间1FBSFBS/100pMFBS/100pMPICM57FBS/100nMFBS画nMPICM57i(h)(OD)PICM57(OD)每2化达到的(OD)PICM57(OD)每24h达到的(OD):4810.50.450.510.530.56i720.940.921,071.05111(962.12.022.32.182.2实施例9PICM1和PICM57对于人纤维肉瘤HT1080细胞侵袭性的作用。用Boyden小室进行体外细胞侵袭测试，所述Boyden小室使用无聚乙烯吡咯烷酮的滤器，具有直径8nm(Nucleopore)的孑L，涂布有罚ng/滤器的基质胶和包含作为趋化剂的10%FBS的DMEM(Silvestri等人Int.，T.Cancer102，562-571，2002)。将人纤维肉瘤HT1080细胞(2x105细胞/样品)留存在Boyden小室的上室的无血清培养基中。所述小室的下室包含I)MEM，所述DMEM加入10%FBS作为趋化剂的来源，并且包含于指定浓度进行测试的待测定肽。将由此装配的所述小室于37。C置于包含5%C02的加湿环境中。18hr后，将已经穿过基质胶并附于滤器下表面的细胞固定，染色并计数。数据代表两次独立实验的平均数，每次实验一式两份。在表8中给出的结果，表示为在存在FBS但缺失肽的情况下(100%)侵袭基质胶的细力包百分比。PICM1和PICM57对于HT1080细胞/f曼袭性的抑制作用是剂量依赖型的。23表8-PICMl和PICM57对由10。/。FBS"i秀导的人纤维肉瘤HT1080细胞侵袭的剂量响应性抑制作用。趋向于10%FBS的细胞侵袭(％)肽浓度PICM1PICM5701001001aM1006910aM1015910fM624110pM553710nM4431实施例10体外PICM1和PICM57对于新血管发生的抑制作用。通过利用内皮细胞在原血管发生因子存在的情况下形成索状组织的能力来进行体外新血管发生测试，所述索状组织在多聚化的基质胶层上延伸形成孩l管网络。对于这种类型的测定，将5xi04HUVEC细胞(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells,人脐带静脉内皮细胞)接种在24-孔板中，其中留有300pl基质胶在用作原血管发生剂的40ng/mlVEGF(血管内皮生长因子)，以及不同浓度的指定的肽存在时聚合。在5%C02中于37。C孵育18小时后，通过用倒置显微镜在随机选择的至少5个视野中计数微管结构的数目来评估微管形成。肽对于VEGF依赖型微管形成活性的作用计算为在VEGF存在时计数的微管结构的数目(取作100%)的百分比。数据(表9)代表两次实验的平均数，每次实验一式两份。体外PICM1和PICM57对于新血管发生的拮抗作用是剂量依赖型的。这种作用起始于浓度aM并于pM浓度达到峰值(计数的微管结构数目的20%);于fM浓度达到最大作用的50%。通过比较的方式显示了由50nM内皮他汀表现的抗血管发生作用以及由metastin[45-54]表现的低抑制作用。表9-PICM1和PICM57对于HUVEC内皮细胞的VEGF依赖型微24管形成活性的剂量依赖型抑制作用。VEGF-依赖型孩克管形成活性(％)肽浓度PICM57PICM1内皮他汀Metastin45-540100100ND1001aM96104NDND10aM7577NDND10fM5365ND卯10pM2330ND6310nM19223065实施例11PICM57的毒性PICM57对小鼠的急性毒性测试表明LD50为30mg/Kg,集中在28mg/Kg(所有动物存活)和32mg/Kg(所有动物死亡)的区间。PICM57对大鼠的急性毒性测试表明LD50为65mg/Kg，集中在58mg/Kg(所有动物存活)和70mg/Kg(所有动物死亡)的区间。实施例12体内抗转移作用在动物才莫型上评估PICM1的抗转移效力。将在实验才莫型中引发肺部转移的2x106人纤维肉瘤HT1080细胞(SchwdnitzA等人，丄Biol.Chem.279:33613，2004),悬浮在生理盐水溶液中并注射入20只7周龄的CD1棵小鼠尾部静脉中。接种肺瘤细胞24小时后，每48h緩慢注射溶于100|i1生理盐水溶液中的3mg/KgPICM1来处理10只动物的组，动物固定不动。IO只对照动物接受相同的注射处理，但是只用生理盐水溶液注射。每天对每只动物称重并观察呼吸困难情况。22天后对照动物显示明显的呼吸困难症状。处死所有处理的和对照动物，并进行尸体解剖。将肺、肝、肾、脾25和心脏进行肉眼和显微分析。除了肺部以外，对照或经处理动物的器官没有检查出任何组织形态学变化。不过，肺部的肉眼分析显示在对照动物中有大量的胸膜下新生物，经常伴随有坏死和出血特征，这在经处理的动物中未观察到。在显微水平上，对照动物的肺部解剖的连续切片显示平均45。/。的实质区域由转移性节结所占据，经常是血管周边，有中心坏死区域。相反地，在显孩i水平上观察发现用3mg/KgPICMl处理的动物没有显示转移的出现。权利要求1.成盐或未成盐形式的肽及其功能等同衍生物，具有通式L1-X1-X2-X3-X4，其中L1是H或酰基，或任选地N-酰基化、N-烷基化和/或Cα-烷基化的任何天然或非天然的氨基酸；X1和X3是相同的或不同的，任选地N-烷基化和/或Cα-烷基化的任何天然或非天然的碱性氨基酸；X2是任选地N-烷基化和/或Cα-烷基化的任何天然或非天然的氨基酸，前提是其并非为甘氨酸或在α碳原子上由1-10个碳原子的线性或环状烷基单一取代的氨基酸，或在α碳原子上由包含4-10个碳原子的线性或环状烷基单一取代的氨基酸，或在α碳原子上由包含1-8个碳原子的烷基单一取代的氨基酸，任选地由氨基甲酰基、羟基或芳基所取代；X4是任选地Cα-烷基化和/或在C末端酰胺化的任何天然或非天然疏水性氨基酸，或任选地N’-烷基化或N’-酰基化的任何疏水性氨基醇或疏水性偕二胺。2.如权利要求1中所述肽，其中U是H或酰基，或任选地N-酰基化或N-烷基化和/或Ca-烷基化的Glu、Gln;任选地N-酰基化和/或Cct-烷基化的Pro、羟基-Pro、Azt、Pip、pGlu;任选地N-酰基化或N-烷基化的Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c、Ac6c;Xl5X2,X3和X4如权利要求1所定义。3.如权利要求1或2所述肽，其中如权利要求1或2所定义；Xj和X3是任选地N-烷基化和/或Ca-烷基化的相同或不同氨基酸，选自任选地p瓜基化的Arg、Orn和Lys,以及在间位或对位由胺基或胍基取代的苯丙氨酸；X2和X4如权利要求1所定义。4.如权利要求1所述肽，其中Ll5Xi，X3和X4如权利要求l-3的任何一项所定义；X2选自任选地N-烷基化和/或Ca-烷基化的Glu、Lys，任选地N-烷基化的Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c和Ac6c。5.如权利要求1所述肽，其中L！,X！,X2和X3如权利要求1-4中任何一项所定义；X4选自任选地酰胺化和/或Ca-烷基化的Phe、h-Phe、Tyr、Trp、l-Nal、2-Nal、h-l-Nal、h-2-Nal、Cha、Chg和Phg。6.如在前权利要求的任何一项所述肽，其中是H或酰基或任选地N-酰基化或N-烷基化的Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c或Ac6c;Xi，X2，X3和X4如权利要求l-5的任何一项所定义。7.如权利要求1中所述肽，其中X2选自任选地N-烷基化的Aib、Ac3c、Ac4c、Ac5c和Ac6c;LpX，，X3和X4如权利要求1-6的任何一项所定义。8.如权利要求1-7所述肽，其中进行酰基化和烷基化的残基包含1到9个碳原子，进行酰胺化C-末端的残基包含O到14个碳原子，并且进行Ca-烷基化的残基包含1到9个碳原子。9.如权利要求1-8中所述肽，其中进行酰基化和烷基化的残基包含1或2个碳原子，并且进行酰胺化C-末端的残基包含0到5个碳原子。10.如权利要求1-9中所述肽，其序列为Ace-Arg-Glu-Arg-Phe-NH2;pGlu-Arg-Glu-Arg-Tyr-OH;Glu-Arg-Glu-Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Glu-Arg-Tyr-NH2;Ace-Arg-Glu-Arg-Trp-NH2;Ace-Arg國Glu-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Glu-N(Me)Arg-Tyr-NH2;Ace-Arg-Glu-N(Me)Arg-Trp-NH2;pGlu-Arg-Glu-N(Me)Arg-Phe-NH2;pGlu-Arg曙Glu-N(Me)Arg-Tyr-NH2;pGlu-Arg-Glu-N(Me)Arg-Trp-NH2;pGlu-Arg誦Glu-Arg-Phe-NH2;pGlu-Arg-GIu-Arg-Tyr-NH2;pGlu-Arg-Glu-Arg-Trp-NH2;Ace匪Arg-Aib-Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Aib-Arg-Tyr-NH2;Ace-Arg-Aib-Arg-Trp-NH2;Ace-Aib-Arg-Aib-Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Aib-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Aib-N(Me)Arg-Tyr-NH2;Ace-Arg-Aib-N(Me)Arg-Trp-NH2;pGlu-Arg-Aib-N(Me)Arg-Phe-NH2;Glu-Arg-Aib-N(Me)Arg-Tyr-NH2;pGlu-Arg-Aib-N(Me)Arg-Trp-NH2;pGlu-Arg-Aib-Arg-Phe-NH2;pGlu-Arg-Aib-Arg-Tyr-NH2;pGlu-Arg-Aib-Arg-Trp-NH2;Ace-Arg-Ac5c-Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Ac5c-Arg-Tyr画NH2;Ace-Arg-Ac5c-Arg-Trp-NH2;Ace-Arg-Ac5c-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Ac5c-N(Me)Arg-Tyr-NH2;Ace-Arg-Ac5c-N(Me)Arg-Trp-NH2;pGlu-Arg-Ac5c-N(Me)Arg-Phe-NH2;pGlu-Arg-Ac5c-N(Me)Arg-Tyr-NH2;pGlu-Arg-Ac5c-N(Me)Arg-Trp-NH2;pGlu-Arg-Ac5c-Arg-Phe-NH2;pGlu-Arg-Ac5c-Arg-Tyr-NH2;pGlu-Arg-Ac5c-Arg-Trp-NH2;Ace-Arg-Glu-Arg-Phe-OH;Ace-Arg-Glu-Arg-Tyr-OH;Ace-Arg-Glu-Arg-Trp曙OH;Ace-Arg-Glu-N(Me)Arg-Tyr画OH;pGlu-Arg-Glu-N(Me)Arg-Phe-OH;pGlu-Arg-Glu-Arg-Trp隱OH;Ace画Arg-Aib-Arg-Phe-OH;Ace-Arg-Aib-N(Me)Arg-Phe-OH;pGlu画Arg-Aib-N(Me)Arg画Tyr-OH;pGlu-Arg画Aib-Arg-Trp画OH;Ace-Arg-Ac5c-Arg-Phe-OH;Ace-Arg-Ac5c-N(Me)Arg-Tyr-OH;pGlu-Arg-Ac5c-N(Me)Arg-Trp-OH;pGlu-Arg-Ac5c-Arg-Trp-OH;Ace-N(Me)Arg-Aib-Arg-Phe-NH2;Ace-N(Me)Arg-Aib-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Arg國Aib-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Arg-Aib-Arg-a(Me)Phe-NH2;Ace-N(Me)Arg-Aib-Arg-a(Me)Phe-NH2;Ace-N(Me)Arg-Aib-N(Me)Arg-oc(Me)Phe-NH2;Ace-Arg-Aib-N(Me)Arg-a(Me)Phe-NH2;Ace-Aib-N(Me)Arg-Aib-Arg-Phe-NH2;Ace-Aib-N(Me)Arg-Aib-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Aib画Arg-Aib-N(Me)Arg-Phe-NH2;Ace-Aib-Arg-Aib-Arg-a(Me)Phe-NH2;Ace画Aib-N(Me)Arg陽Aib-Arg-a(Me)Phe-NH2;Ace-Aib-N(Me)Arg-Aib-N(Me)Arg-a(Me)Phe-NH2;Ace-Aib-Arg-Aib-N(Me)Arg-a(Me)Phe-NH2。11.包含权利要求1-10中所述化合物之一的药物组合物，所述化合物与合适的载体或赋形剂相组合。12.权利要求1-10中所述化合物在制备用于预防和治疗与异常细胞迁移相关联病症的药物产品中的用途。13.如权利要求12中所述用途，用于预防和治疗恶性胂瘤引起的局部和转移性侵袭。14.如权利要求12所述用途，用于预防和治疗与新血管发生相关联的病症，包括视网膜血管病，视网膜病，黄斑变性和水肿，以及Kaposi氏肉瘤。15.如权利要求12所述用途，用于预防和治疗由细胞迁移支持并与慢性炎症相关联的病症，包括自身免疫疾病，类风湿性关节炎，牛皮癣，和慢性肉芽肿病症。16.如权利要求12所述用途，用于预防和治疗与疱渗病毒感染相关联的疾病。全文摘要成盐或未成盐形式的肽及其功能等同衍生物，具有通式L₁-X₁-X₂-X₃-X₄，其中L₁是H或酰基或任选地N-酰基化或N-烷基化和/或Cα-烷基化的任何天然或非天然的氨基酸；X₁和X₃是相同的或不同的，为任选地N-烷基化和/或Cα-烷基化的任何天然或非天然的碱性氨基酸；X₂是任选地N-烷基化和/或Cα-烷基化的任何天然或非天然的氨基酸，前提为其并非甘氨酸或在α碳原子上由1-10个碳原子的线性或环状烷基单一取代的氨基酸，在α碳原子上由包含4-10个碳原子的线性或环状烷基单一取代的氨基酸，或在α碳原子上由包含1-8个碳原子的烷基单一取代的氨基酸，任选地由氨基甲酰基，羟基或芳基所取代；X₄是任选地Cα-烷基化和/或在C末端酰胺化的任何天然或非天然疏水性氨基酸，或任选地N’-烷基化或N’-酰基化的任何疏水性氨基醇或疏水性偕二胺。文档编号A61K38/03GK101501060SQ200780029266公开日2009年8月5日申请日期2007年7月19日优先权日2006年8月9日发明者温琴佐·帕沃纳,玛丽亚·温琴扎·卡列罗,马里奥·德罗萨申请人:玛丽亚·温琴扎·卡列罗;马里奥·德罗萨;温琴佐·帕沃纳