一种术后节制肿瘤细胞迁移的dc-cik治疗方法
【专利摘要】本发明公开了一种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法，步骤如下：CTC细胞分离及培养；辐照处理CTC细胞，制备靶向悬液；分离PBMC，并诱导DC细胞和CIK细胞，进行CTC悬液靶向抗原递呈；回输治疗：将加有DC和CIK细胞等物质的生理盐水采用静脉滴注的方式回输给患者。本发明设计出了完美的利用医疗中检测和分离循环肿瘤细胞的技术，用于结合现代DC、CIK为基础的过继免疫治疗技术，本发明具有多项优点：1、提前检测循环肿瘤细胞，提前治疗肿瘤的优点；2、只需要几毫升血液即可分离出CTC，靶向抗原获取容易的特点；3、对于肿瘤术后不定期进行针对患者特异性的肿瘤治疗，具有针对性强且准确的特点。
【专利说明】一种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肿瘤治疗领域，具体是一种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治 疗方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤细胞迁移：恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道，血管或体腔等途径，到达其 他部位继续生长，称肿瘤转移。良性肿瘤无转移。恶性肿瘤容易发生转移，其方式有四种： ①直接蔓延到邻近部位；②淋巴转移：原发癌的细胞随淋巴引流，由近及远转移到各级淋 巴结，也可能超级转移；或因癌阻碍顺行的淋巴引流而发生逆向转移。转移癌在淋巴结发展 时，淋巴结肿大且变硬，起初尚可活动，癌侵越包膜后趋向固定，转移癌阻碍局部组织淋巴 引流，可能引起皮肤、皮下或肢体的淋巴水肿；③血行转移：癌细胞进入血管随血流转移至 远隔部位如肺、肝、骨、脑等处，形成继发性肿瘤；④种植：瘤细胞脱落后种植到另一部位， 如内脏的癌播种到腹膜或胸膜上。显然，恶性肿瘤转移将增加对机体的损害作用，而且影响 转归。
[0003] 树突状细胞（Dendritic cells，DC) :DC 细胞，1973 年 Steiman 和 Cohn 首次从 脾脏中分离出一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功都不同的白细胞，因其细胞膜 向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树状突起，故而命名为树突状细胞（dendritic cells，DCs)。它是机体功能最强的专职抗原递呈细胞（Antigen presenting cells，APC), 它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激 活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC与肿瘤的发生、发展有着 密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。有效的抗肿瘤免疫反应的核心 是产生以CD8+T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。美国杜 克大学遗传和细胞治疗学中心的研究主任埃利-吉尔波瓦说过："DC是激发机体免疫系统 激发抵御癌症侵袭最有效的途径之一。" "DC作为高度专职化的主要抗原递呈细胞，在诱导 针对相关抗原的高效、特异性T细胞免疫应答中起到关键作用。"
[0004] CIK细胞（cytokine induced killer):最初是指在正常人体外周血中只占1? 5%的cd3+cd56+的t淋巴细胞。目前国内外制备的用于过继免疫治疗的cik细胞，实际 上是体外扩增出的以cd3+cd56+、cd3+cd8+为主的异质性细胞群。该细胞群是在多种细胞 因子如il-2、ifn-γ及某些单克隆抗体（anti-cd3mcab)的刺激下，由从外周血、骨髓或脐 血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有广泛的非mhc限制的极强的溶瘤活 性。CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的 免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达 CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞（自然杀伤细胞）样T淋巴细胞，兼具有T 淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别 能力很强，如同"细胞导弹"，能精确"点射"肿瘤细胞，但不会伤及"无辜"的正常细胞。尤其 对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发， 提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
[0005] 循环肿瘤细胞：循环肿瘤细胞（circulating tumour cell)，通常把进入人体外周 血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。肿瘤细胞的一个特征是细胞间的黏附力非常弱，因此肿 瘤细胞就有可能从瘤体脱落，如果脱落的部分进入了血液循环，即可成为循环肿瘤细胞。此 类细胞可以随着血液循环到远处种植形成转移，也可以与凝血系统作用形成血栓，也有研 究说此类细胞可以刺激人体免疫系统可能对肿瘤的治疗有研究意义。
[0006] 早在1896年，Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤 的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC)的概念。
[0007] 肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形 成临床转移灶提供了可能。CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿 瘤细胞的不断增殖，部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质，增加其运动能 力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主 结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。Louha等报道， 在肝癌患者手术中牵动肝脏易发生医源性肿瘤细胞扩散，其原因可能是肝脏具有海绵状结 构，牵动肝脏可使器官伸展和压缩。
[0008] 进入循环的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡。宿主的免疫识别和机械杀伤作用以 及肿瘤细胞自身因素，如缺乏变形性以致不能顺利通过循环管道系统，或缺乏形成癌栓能 力等均可导致肿瘤细胞死亡。只有极少数具有高度活力、高度转移潜能的肿瘤细胞在循环 系统中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶。因此，在外周血 中检测到肿瘤细胞预示着有可能发生肿瘤转移。
[0009] 随着对CTC研究的深入，人们发现检测CTC有助于建立个体化的治疗方案。 Beitsch等采用流式细胞计数、免疫化学等方法比较早期及晚期乳腺癌患者CTC的水平，明 确发现转移性乳腺癌比早期乳腺癌有更多的CTC。通过这种方法能够筛选出高危患者，决 定是否需要辅助治疗。Bela等研究认为，CTC数量的改变可以反应肿瘤对治疗的敏感性及 其增殖活性，可为个体化治疗提供依据。最近，Cristofanilli等检测117例进展期乳腺癌 患者CTC在治疗前后的变化情况，发现CTC水平可以预测进展期乳腺癌的治疗效果。CTC 水平在治疗前较低或开始治疗之后降低的女性治疗效果好，而在治疗后CTC水平仍较高的 患者与前者相比，疾病进展迅速，生存期短，治疗效果差。传统的临床评定疗效方法是根据 肿瘤的大小变化，需要在开始治疗之后3?4个月进行，而且需要进行一系列检查如ECT、 X线等。而Cristofanilli等的研究显示通过检测转移性乳腺癌患者CTC水平可以在最初 治疗之后3?4周尽早预测疗效。这对于决定患者的个体化治疗具有重要意义。已有研究 表明检测早期乳腺癌患者骨髓微转移情况可以监测辅助治疗效果，而在考虑给予辅助治疗 的问题上，CTC在转移性乳腺癌中的重要作用可能与骨髓微转移在早期乳腺癌中的作用类 似。目前有学者正研究能否根据CTC水平改变治疗方案藉以提高疗效，如根据其检测结果， 结合病人的具体情况选择适宜的辅助治疗，调整治疗强度、持续时间，尽量使病人免受不必 要的毒性作用。
[0010] 循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体 化治疗包括临床筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。
[0011] 1、体检：（体外早期诊断）。对于肿瘤的常规检测手段来讲，例如影像学。肿瘤在 小于一公分的情况下，医生也不认为它是异常。通过国外发表的文章可以看到，不要说是一 公分，很多肿瘤在一个毫米的情况下已经在血液里查到循环肿瘤细胞，从这个角度讲，它对 于早期诊断来讲有不可低估的意义。
[0012] 2、辅助诊断手段。从临床来讲，要确定一个病人是不是得了肿瘤，一直是一个很难 明确回答的问题，这就会对很多病人造成误诊。比如说胰腺癌往往发现确诊以后都是晚期 的，为什么会这样？就是因为在早期的时候，胰腺癌的确诊非常困难。现在发现，在很多难 以确诊的病人的血液中，如果说能够检查到循环肿瘤细胞，那对于配合医生下肿瘤诊断的 结论是具有积极意义的。
[0013] 3、根据循环肿瘤细胞的个数判断愈后及存活时间。经美国FDA认证的易莫尼康 (Immunicon)公司通过多年的科研，在几百个病人身上做了大量的科学研究，最终得出结 论，在治疗以后通过计算循环肿瘤细胞的个数，可以明确的告诉病人到底能存活半年还是 一年或更长时间。也就是说循环肿瘤细胞的应用使人们第一次可以以一个量化的指标告诉 医生和病人他的存活时间。
[0014] 4、个体化治疗。个体化治疗指的是针对每一个不同的肿瘤病人，医生开出不同的 治疗方案。目前在医院，比如说协和医院，很少做很严格的个体化治疗方案，一般都是医生 根据经验来决定给病人用何种化疗药物，但有没有效并不知道。现在国外已经开始用一种 新的方法，即把病人体内的肿瘤细胞拿出来培养，培养好以后在体外做药理实验。因为化疗 药物有多种，究竟哪种最好最有效不应该由经验来回答，而是应该由事实来说话。把肿瘤细 胞培养好以后，用不同的药物来处理肿瘤细胞，看哪种化疗药物对肿瘤细胞杀伤作用最大， 然后把杀伤作用最大的药物用在病人身上，这样就增加了治疗的目的性。随着CTC捕获技 术的成熟，人们开始考虑是否可以把CTC作为个体化治疗的基础，从目前来看这是可行的。 即先将CTC捕获出来进行培养，培养好了以后进行药理实验，在此基础上还可以做化疗药 效的快速评估。
[0015] 5、快速判断化疗效果。目前不管是国内还是国外，给病人上化疗药物以后，一般都 要等三个月才可以去评估病人的治疗效果。因为只有经过三个月后，肿瘤的大小才能有比 较明显的变化。通过我们的实验以及国外发表的文章可以看出，凭经验给病人上的化疗药 物在很多情况下是无效的。很多情况下，经过三个月以后，肿瘤细胞非但没有减小反而继续 长大。这对病人来讲就白白耽误了三个月的时间。三个月对于肿瘤病人来讲就意味着有可 能最终死亡。随着CTC技术的成熟，病人不用再等三个月，只需等三周，通过测定CTC数目 的变化，如果CTC数目是显著下降的，说明化疗药物是有效的，如果CTC数目还在增加说明 药物是无效的，这时医生就应该采取新的治疗方案。
[0016] 6、体内耐药性检测。很多情况下给病人用化疗药物一开始是有效的，但是过一段 时间后肿瘤病人的发病并没有得到控制，这有可能是病人对药物产生了耐药性，这一点大 家都可以理解，抗体多了容易产生耐药。目前来讲，对于肿瘤治疗病人会不会产生耐药以及 什么时候产生耐药是未知的。往往是发现病人产生耐药时，病情已得不到控制。随着CTC 技术的成熟，我们可以做动态的观察，也就是对病人做持续跟踪观察，在动态的观察过程中 一旦发现CTC数目显著增加，医生就应该及时的更换新的治疗方案。
[0017] 7、最后就是检测肿瘤复发。这是北京莱尔生物科技有限公司在协和医院及其他医 院做临床实验以后病人反响最大的地方。目如就全世界来说，肿瘤病人经过治疗以后，在恢 复的过程中会不会肿瘤复发？以及什么时候复发？没有医生也没有方法可以做出解释。随 着CTC技术的成熟，我们已经知道肿瘤的复发实际上就是肿瘤转移的过程。很多乳腺癌的 病人复发后会转移到脑部，还有很多结直肠癌的病人复发后往往转移到肝脏。这说明即使 原发部位已经切除，肿瘤还会转移到其他部位，这实际上就是一个慢性的肿瘤转移过程。既 然人们已经认识到肿瘤复发和肿瘤转移过程是直接相关的，医生就可以通过监测CTC直接 监测病人是否肿瘤复发。也就是说肿瘤的复发不是一夜形成的，它是一个持续的肿瘤不断 释放入血向远端转移的缓慢的过程。对于治疗过的病人，他体内的循环肿瘤细胞应该是没 有或者只有极少的数目，如果在他今后的生活过程中检测到循环肿瘤细胞持续增多，这就 给病人和医生都敲响了警钟，这时对病人一定要采取适当的治疗，控制住CTC的增多，因为 CTC的增多很有可能是肿瘤复发的前兆或复发的过程。
[0018] 8、另外人们已经认识到CTC可以作为药物靶向治疗的一个新的靶向。目前国外很 多大的药厂都投入巨资开发肿瘤新药，在开发的过程中不仅把实体肿瘤作为靶向治疗的一 个靶标，同时也认识到可以把CTC作为药物治疗的对象。
[0019] 现有的CTC利用主要在于临床检验中的用于，为了更好的利用CTC的靶向性，并基 于以上循环肿瘤细胞在肿瘤发展和迁移中的重要作用，对其进行靶向杀死可以节制肿瘤扩 散的产生，同时可以根据其靶向信息，追踪和杀死体内组织部位的固定肿瘤细胞，起到节制 和杀死肿瘤的作用。
[0020] DC-CIK联合治疗是现有过继免疫治疗中的基础性治疗，但存在着靶向性不强，需 要提供充足有效的靶向信息给DC细胞，才能将肿瘤靶向信息充分递呈给CIK细胞，从而杀 死肿瘤细胞，现有的大部分靶向抗原来源于手术切除的肿瘤组织块或者人重组抗原，前者 获取需要经过手术进行，伤害大，后者价格昂贵，而且存在于人体体内抗原结构不一致的可 能。
【发明内容】
[0021] 为了随时针对肿瘤患者或者术后患者进行方便的靶向免疫治疗，本发明提供了一 种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法，该方法利用现有的CTC分离技术，从患者血 液中分离出CTC，在体外培养扩增后，使用辐照后的细胞作为靶向抗原的来源，刺激DC细胞 处理抗原并进行抗原递呈给CIK，由于CTC的增殖能力强，可以再体外大量培养，从而增强 免疫治疗的杀死能力和准确性。
[0022] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0023] -种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法，步骤如下：
[0024] (I)CTC细胞分离及培养；
[0025] (2)辐照处理CTC细胞，制备靶向悬液；
[0026] (3)分离PBMC，并诱导DC细胞和CIK细胞，进行CTC悬液靶向抗原递呈；
[0027] (3. 1)血液中分离单核细胞
[0028] (3. I. 1)取IOOml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中；
[0029] (3. I. 2) 300g离心lOmin，离心后，将所有的上层血浆转移到2个新的无菌离心管 中，56°C水浴灭活30min，再于400g离心IOmin后，收集上层黄色液体即低血小板血浆，4°C 储存备用；
[0030] (3. I. 3)向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml 混合液，用移液器混匀；
[0031] (3. 1. 4)再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合液 用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层；
[0032] (3. I. 5) 400g 离心 20 分钟；
[0033] (3. 1. 6)离心后将中间白膜层吸入到新的50ml离心管中；
[0034] (3. L 7)用注射用生理盐水补液到45ml后，300g离心5分钟，清洗单核细胞；
[0035] (3. L 8)重新加入注射用生理盐水45ml，混匀后离心清洗单核细胞；
[0036] (3. 2)免疫细胞诱导分化及抗原递呈；
[0037] (3. 2. 1)第0天，离心收集单核细胞，用20ml无血清培养基重悬，在T75培养瓶中 培养2h ;
[0038] (3. 2. 2) 2h后将不贴壁细胞倒入另外一个T175培养瓶中，并用无血清培养液补足 T175培养瓶的培养液到50ml，并加入终浓度lOOOU/ml的白介素2 (IL-2)和终浓度25ng/ml 的抗⑶3单抗；同时，向T75培养瓶中加入DC培养基和2ml辐照处理的CTC细胞悬液；
[0039] (3. 2. 3)第二天，对T175培养瓶进行半量换液；
[0040] (3. 2. 4)第四天，对T75培养瓶中的细胞用DC培养基，进行半量换液，并补加2ml 处理后的CTC细胞悬液；同时，T175培养瓶中补加培养液到IOOml ;
[0041] (3. 2. 5)第六天，向T75培养瓶中，加入终浓度20ng/ml的TNF-α。补加培养液到 300ml ；
[0042] (3. 2.6)第八天，用细胞刮刀刮下T75培养瓶中的DC细胞，加入到CIK细胞中，并 补加5ml处理后的CTC细胞悬液，再将培养液补加到500ml，进行混合扩增培养；
[0043] (3.2.7)第十天，将所有的DC和CIK细胞离心后，用生理盐水洗2次（300g，离心 5分钟），最后，加入到注射用生理盐水中，补加10%人血白蛋白；
[0044] (4)回输治疗：将加有DC和CIK细胞等物质的生理盐水采用静脉滴注的方式回输 给患者。
[0045] 作为本发明进一步的方案：步骤（I)CTC细胞分离及培养的具体步骤为：
[0046] (I. 1)分离出CTC细胞；
[0047] (1. 2)培养方法：
[0048] (1. 2. 1)准备无菌培养液，包括DMEM，10%胎牛血清，1% L-谷氨酰胺和1 %双抗；
[0049] (1. 2. 2)将分离到的CTC细胞在以上培养液中进行培养，每3天进行一次传代。
[0050] 作为本发明进一步的方案：步骤（2)辐照处理CTC细胞，制备靶向悬液的具体步骤 为：
[0051] (2. I) 20mW/cm2 强度微波辐射 CTC 细胞 30min ;
[0052] (2. 2)用注射用生理盐水清洗2次；
[0053] (2. 3)消化离心收集辐照处理后的CTC细胞，并计数；
[0054] 使用时用按照2*105个/ml溶液稀释。
[0055] 本专利利用DC和CIK两种肿瘤过继免疫治疗中最常用到的高效免疫治疗细胞与 分离获取并经过处理的CTC结合，达到CTC特异性靶向抗原递呈和杀伤强化的能力。
[0056] DC和CIK是两类免疫细胞，分别起到不同的免疫效果。DC细胞是树突状细胞 (Dendritic cell)的简写，1973年Steiman和Cohn首次从脾脏中分离出一类与粒细胞、巨 噬细胞和淋巴细胞形态和功都不同的白细胞，因其细胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突 相似的膜性树状突起，故而命名为树突状细胞（dendritic cells，DCs)。它是机体功能最 强的专职抗原递呈细胞（Antigen presenting cells, APC)，它能高效地摄取、加工处理和 递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调 控、并维持免疫应答的中心环节。
[0057] DC与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预 后好。有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以⑶8+T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是 DC作为免疫治疗手段的基础。
[0058] 美国杜克大学遗传和细胞治疗学中心的研究主任埃利-吉尔波瓦说过："DC是激 发机体免疫系统激发抵御癌症侵袭最有效的途径之一。~DC作为高度专职化的主要抗原递 呈细胞，在诱导针对相关抗原的高效、特异性T细胞免疫应答中起到关键作用。"
[0059] CIK是（cytokine induced killer)的缩写，最初是指在正常人体外周血中只占 1?5%的cd3+cd56+的t淋巴细胞。目前国内外制备的用于过继免疫治疗的cik细胞，实 际上是体外扩增出的以cd3+cd56+、cd3+cd8+为主的异质性细胞群。该细胞群是在多种细 胞因子如il -2、ifn-γ及某些单克隆抗体（anti-cd3mcab)的刺激下，由从外周血、骨髓或 脐血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有广泛的非mhc限制的极强的溶瘤 活性。
[0060] CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种 新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞 同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞（自然杀伤细胞）样T淋巴细胞， 兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细 胞的识别能力很强，如同"细胞导弹"，能精确"点射"肿瘤细胞，但不会伤及"无辜"的正常 细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩 散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首 选方案。
[0061] 本发明中循环肿瘤细胞是肿瘤切除手术后的患者外周血中分离到的CTC细胞，由 于CTC细胞在手术前的患者体内也存在，所以包括但不限于术后患者；另外，循环肿瘤细 胞在手术前患者身上也存在，所以可以用于已经明确发现有外周血中存在着循环肿瘤细胞 的患者；其中CTC必须经过辐射处理，保证CTC死亡；辐照处理过的CTC被制备成悬液，作 为靶向抗原液使用；CTC悬液用于DC细胞处理并获取用于靶向抗原的递呈，递呈给CIK细 胞。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明设计出了完美的利用医疗中检测和分离 循环肿瘤细胞的技术，用于结合现代DC、CIK为基础的过继免疫治疗技术，本发明具有多项 优点：1、提前检测循环肿瘤细胞，提前治疗肿瘤的优点；2、只需要几毫升血液即可分离出 CTC，靶向抗原获取容易的特点；3、对于肿瘤术后不定期进行针对患者特异性的肿瘤治疗， 具有针对性强且准确的特点。
【具体实施方式】
[0062] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0063] -种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法，步骤如下：
[0064] (I)CTC细胞分离及培养；
[0065] (I. 1)分离方法采用下述两种方法的任意一种现有技术：
[0066] 方法1 :采用Abonova的captor系统分离捕获CTC细胞；
[0067] 方法2 :磁性分离循环肿瘤细胞；取7. 5ml血样样品于特定样品管中，离心分离得 到血液中固态成分，然后置于CellTracks? AutoPrep? System(NatureGene公司开发的一 种循环肿瘤细胞检测设备）中；利用结合有可靶定上皮细胞黏附分子的抗体的流体磁性纳 米颗粒，即可将CTC细胞与血液中的其他细胞分离开；
[0068] (1. 2)培养方法：
[0069] (I. 2. 1)准备无菌培养液，包括 DMEM(Hyclone)，10 % 胎牛血清 fetal calf serum(Gibco, nvitrogen，Carlsbad，CA, USA)，1% L-谷氨醜胺 L-glutamin(Sigma)和 1% 双抗 penicillin-streptomycin (Gibco)；
[0070] (I. 2. 2)将分离到的CTC细胞在以上培养液中进行培养，每3天进行一次传代；
[0071] ⑵辐照处理CTC细胞，制备靶向悬液；
[0072] (2. I) 20mW/cm2 强度微波辐射 CTC 细胞 30min ;
[0073] (2. 2)用注射用生理盐水清洗2次；
[0074] (2. 3)消化离心收集辐照处理后的CTC细胞，并计数；
[0075] 注意：使用时用按照2*105个/ml溶液稀释；
[0076] (3)分离PBMC，并诱导DC细胞和CIK细胞，进行CTC悬液靶向抗原递呈；
[0077] (3. 1)血液中分离单核细胞
[0078] (3. I. 1)取IOOml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中；
[0079] (3. I. 2) 300g离心lOmin，离心后，将所有的上层血浆转移到2个新的无菌离心管 中，56°C水浴灭活30min，再于400g离心IOmin后，收集上层黄色液体即低血小板血浆（Poor Platelet Plasma，PPP)，4°C储存备用；
[0080] (3. I. 3)向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml 混合液，用移液器混匀；
[0081] (3. 1. 4)再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合液 用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层；
[0082] (3. I. 5) 400g 离心 20 分钟；
[0083] (3. 1. 6)离心后将中间白膜层吸入到新的50ml离心管中；
[0084] (3. L 7)用注射用生理盐水补液到45ml后，300g离心5分钟，清洗单核细胞；
[0085] (3. L 8)重新加入注射用生理盐水45ml，混匀后离心清洗单核细胞；
[0086] (3. 2)免疫细胞诱导分化及抗原递呈；
[0087] (3. 2. 1)第0天，离心收集单核细胞，用20ml无血清培养基重悬，在T75培养瓶中 培养2h ;
[0088] (3. 2. 2) 2h后将不贴壁细胞倒入另外一个T175培养瓶中，并用无血清培养液补足 T175培养瓶的培养液到50ml，并加入终浓度lOOOU/ml的白介素2 (IL-2)和终浓度25ng/ml 的抗⑶3单抗；同时，向T75培养瓶中加入DC培养基和2ml辐照处理的CTC细胞悬液； [0089] (3. 2. 3)第二天，对T175培养瓶进行半量换液；
[0090] (3. 2. 4)第四天，对T75培养瓶中的细胞用DC培养基，进行半量换液，并补加2ml 处理后的CTC细胞悬液；同时，T175培养瓶中补加培养液到IOOml ;
[0091] (3. 2. 5)第六天，向T75培养瓶中，加入终浓度20ng/ml的TNF-α。补加培养液到 300ml ；
[0092] (3.2.6)第八天，用细胞刮刀刮下T75培养瓶中的DC细胞，加入到CIK细胞中，并 补加5ml处理后的CTC细胞悬液，再将培养液补加到500ml，进行混合扩增培养；
[0093] (3.2.7)第十天，将所有的DC和CIK细胞离心后，用生理盐水洗2次（300g，离心 5分钟），最后，加入到注射用生理盐水中，补加10%人血白蛋白；
[0094] (4)回输治疗：将加有DC和CIK细胞等物质的生理盐水采用静脉滴注的方式回输 给患者。
[0095] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。
[0096] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。
【权利要求】
1. 一种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法，其特征在于，步骤如下： (l)CTC细胞分离及培养； ⑵辐照处理CTC细胞，制备靶向悬液； ⑶分离PBMC，并诱导DC细胞和CIK细胞，进行CTC悬液靶向抗原递呈； (3. 1)血液中分离单核细胞 (3. 1. 1)取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中； (3. 1.2) 300g离心lOmin，离心后，将所有的上层血浆转移到2个新的无菌离心管中， 56°C水浴灭活30min，再于400g离心lOmin后，收集上层黄色液体即低血小板血浆，4°C储存 备用； (3. 1. 3)向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml混合 液，用移液器混匀； (3. 1. 4)再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合液用移 液器转移到淋巴细胞分离液的上层； (3. 1. 5)400g 离心 20 分钟； (3. 1. 6)离心后将中间白膜层吸入到新的50ml离心管中； (3. 1. 7)用注射用生理盐水补液到45ml后，300g离心5分钟，清洗单核细胞； (3. 1. 8)重新加入注射用生理盐水45ml，混匀后离心清洗单核细胞； (3. 2)免疫细胞诱导分化及抗原递呈； (3. 2. 1)第0天，离心收集单核细胞，用20ml无血清培养基重悬，在T75培养瓶中培养 2h ； (3. 2. 2) 2h后将不贴壁细胞倒入另外一个T175培养瓶中，并用无血清培养液补足T175 培养瓶的培养液到50ml，并加入终浓度1000U/ml的白介素 2 (IL-2)和终浓度25ng/ml的抗 ⑶3单抗；同时，向T75培养瓶中加入DC培养基和2ml辐照处理的CTC细胞悬液； (3. 2. 3)第二天，对T175培养瓶进行半量换液； (3. 2. 4)第四天，对T75培养瓶中的细胞用DC培养基，进行半量换液，并补加 2ml处理 后的CTC细胞悬液；同时，T175培养瓶中补加培养液到100ml ; (3. 2. 5)第六天，向T75培养瓶中，加入终浓度20ng/ml的TNF-α。补加培养液到 300ml ； (3. 2.6)第八天，用细胞刮刀刮下T75培养瓶中的DC细胞，加入到CIK细胞中，并补加 5ml处理后的CTC细胞悬液，再将培养液补加到500ml，进行混合扩增培养； (3. 2. 7)第十天，将所有的DC和CIK细胞离心后，用生理盐水洗2次（300g，离心5分 钟），最后，加入到注射用生理盐水中，补加10%人血白蛋白； (4)回输治疗：将加有DC和CIK细胞等物质的生理盐水采用静脉滴注的方式回输给患 者。
2. 根据权利要求1所述的术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法，其特征在于，步 骤（l)CTC细胞分离及培养的具体步骤为： (1. 1)分离出CTC细胞； (1. 2)培养方法： (1. 2. 1)准备无菌培养液，包括DMEM，10%胎牛血清，1 % L-谷氨酰胺和1 %双抗； (1. 2. 2)将分离到的CTC细胞在以上培养液中进行培养，每3天进行一次传代。
3.根据权利要求1所述的术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法，其特征在于，步 骤（2)辐照处理CTC细胞，制备靶向悬液的具体步骤为： (2. 1) 20mW/cm2强度微波辐射CTC细胞30min ; (2. 2)用注射用生理盐水清洗2次； (2. 3)消化离心收集辐照处理后的CTC细胞，并计数； 使用时用按照2*105个/ml溶液稀释。
【文档编号】A61K35/13GK104288178SQ201410300918
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】易银沙, 张万明, 朱海强, 邹义洲, 许澎, 刘彩云, 袁炳秋, 吴小宁 申请人:长沙赢润生物技术有限公司