荜茇酰胺在制备抗肿瘤转移药物中的运用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗肿瘤剂，特别涉及荜茇酰胺及其药用盐在制备抗肿瘤转移药物中的运用。本发明首次发现荜茇酰胺能够抑制肿瘤细胞迁移，为开发抗肿瘤药物提供了新的思路。
【专利说明】荜茇酰胺在制备抗肿瘤转移药物中的运用
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗肿瘤剂，特别涉及荜茇酰胺及其药用盐在制备抗肿瘤转移药物中的运用。
【背景技术】
[0002]肿瘤转移是恶性肿瘤治疗失败和患者死亡的主要原因，而转移是恶性肿瘤的基本生物学特征。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段、多途径、涉及多基因变化的一系列复杂过程，包括肿瘤细胞从原发灶脱落，侵入血管和淋巴管，迁移、黏附于适宜部位诱导肿瘤血管形成，最终在远处形成转移灶。研究表明，肿瘤细胞的浸润和转移过程中，不仅有多种基因参与，还有一些相关因子、酶和蛋白质等的共同作用。
[0003]荜茇是一种多年生草质藤本植物，中医取其果穗入药，主治脘腹冷痛、呕吐、泄泻、偏头痛、鼻渊、外治牙痛、冠心病、心绞痛。荜茇酰胺(piperlongumine)又称荜茇明碱(piplartine)是从荜茇中分离到的主要有效成分之一，属生物碱类化合物。在长柄胡椒(P.sylvaticum Roxb.)及瘤突胡椒(P.tuberculatum)等胡椒科植物中也可分离到荜发酰胺。随着对其研究的深入，人们发现了荜茇酰胺的许多药理学作用。它具有抗血小板凝集、镇痛、抗真菌、抗血吸虫、抗焦虑以及抗抑郁等诸多药理活性。尤其是它对多种肿瘤细胞表现出显着的细胞毒作用，而在相同浓度下对正常细胞的毒性非常小，是一种极具潜力的具有选择毒力的抗肿瘤中药单体[Raj et al.，2011，Nature475:231-4]。该化合物国外研究文献呈增多趋势，逐渐成为该领域的研究热点之一。
[0004]研究表明荜茇酰胺对多种肿瘤有抑制作用，它能够抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。Bezerra DP等将60只雌性Swiss小鼠(10只/组)移植S180后，荜茇酰胺腹腔给药7天，然后对其肿瘤以及肝、脾、肾等器官进行了组织病理学和形态学分析以评价荜茇酰胺的毒理学性质。发现荜茇酰胺抑制了实体瘤的生长，在50mg/Kg/d和10mg/Kg/d的抑制率分别为28.7%和32.3%，其抑制率与剂量之间呈正相关。其组织病理学结果表明:荜茇酰胺的肾毒性较大，可以导致临近肾小管和肾小球上皮细胞水肿和肾小管出血[Bezerra et al., 2006, Braz J Med B1l Res39:801-7]。Bezerra DP 等用荜发酸胺处理白血病细胞HL-60，K562，Jukart，Molt-4，通过台盼蓝染色表明，给药12h以内，各细胞系均未出现生存能力的变化，在处理24h后，生存能力均出现明显下降。荜茇酰胺lOyg/mL处理24h后，5-Br-U的掺入减少和细胞致死率的增加呈正相关。形态学的变化同样印证了这一发现。而低浓度(2.5μ g/mL)处理则会引起典型的细胞凋亡，在2.5μ g/mL浓度下，能够检测到Caspase-3的活性。因此，低浓度荜茇酰胺可引起白血病细胞的凋亡，而高浓度则可导致细胞坏死[Bezerra et al., 2007, Toxicol In Vitro21:1-8]。
[0005]Kong EH等研究发现荜茇酰胺对前列腺癌细胞具有抑制作用，MTT实验结果表明，3-30 μ M的荜茇酰胺显著抑制了雄性激素依赖性的PC-3细胞的生长，并且在12-48h表现出时间依赖性。荜茇酰胺抑制PC-3细胞增殖的IC5tl值为15 μ M0 24-30 μ M的荜茇酰胺处理24h，细胞出现空泡化以及染色体浓集现象，而且会出现DNA的片段化，凋亡细胞数量增加，导致细胞数量明显减少，其抑制作用可以导致细胞在G2/M期停滞以及在Gl期积累。更高浓度的处理会导致⑶C-2表达的下调，以及PARP表达的上调，同时用荜茇酰胺处理的PC-3细胞也会表现出升高的 caspase-3 活性[Kong et al., 2008, Oncol Rep20:785-92]。
[0006]发明人在研究过程中惊奇地发现，荜茇酰胺在低剂量下、在对肿瘤细胞杀伤较弱的情况下，表现出显著地抑制肿瘤细胞迁移的抑制作用。低剂量荜茇酰胺就对肿瘤细胞的迁移有着显著的抑制作用。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是:提供一种荜茇酰胺的新用途，具体涉及荜茇酰胺及其药用盐在制备抗肿瘤转移药物中的运用。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0009]荜茇酰胺及其药用盐在制备抗肿瘤转移药物中的运用，所述肿瘤包括但不限于肺癌。
[0010]鉴于现在已有研究表明荜茇酰胺与某些化合物如苯基乙炔磺酰胺(中国生化药物杂志2012，V.33 (06) 60-64)联用能够起到协同抗肿瘤的效果，因此，本领域技术人员能够认识到荜茇酰胺与其他具有抗肿瘤作用的物质的复配作为组合物同样能发挥抗肿瘤转移作用，而无需付出创造性的劳动，此类组合物也应当涵盖在本发明的保护范围之内。
[0011]优选的，本发明提供的是荜茇酰胺及其药用盐在制备抗非小细胞肺癌转移的药物中的应用。
[0012]所述抗肿瘤转移药物的制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、口崩制剂或注射剂。
[0013]本发明所述的药用盐，具体的可列举上述化合物与盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，与甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、对甲基苯磺酸等有机酸和天门氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸的酸形成的盐。
[0014]本发明的有益效果:首次发现荜茇酰胺能够在对细胞存活影响不大的情况下，能显著地抑制肿瘤细胞运动和迁移。与目前常规的抗肿瘤转移药物实际上是通过杀死肿瘤细胞而间接表现出抗肿瘤转移表型不同，荜茇酰胺具有不依赖于细胞毒作用的、真正的抑制肿瘤细胞运动和迁移的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为荜拨酰胺处理A549细胞后划痕实验结果:图1_A为A549细胞长满后,用200 μ L的枪头在中央划痕，分饥饿组，溶剂对照组及不同浓度荜茇酰胺处理细胞，分别与损伤后0h,12h和24h进行显微镜(X10倍)下拍摄观察伤口愈合情况的照片；图1_B为定量统计结果柱形图，使用迁移过标志线的细胞数量来反映划痕的愈合程度，此实验重复三次，*代表差异显著(P〈0.05)，林代表差异极显著(p〈0.01);图1-C为荜拨酰胺处理A549细胞后细胞存活状态的定量统计结果柱形图，使用拨酰胺处理后存活细胞的活性来反映细胞存活状态，此实验重复三次，*代表差异显著(P〈0.05)，**代表差异极显著(p〈0.01 )。
[0016]图2为荜拨酰胺处理A549细胞后的Trans well实验结果。图2-A为接种细胞于小室内，使用溶剂对照及不同浓度的荜茇酰胺(5，20，40 μ Μ)作用细胞24h后，对迁移到下室的细胞进行固定，结晶紫染色和拍照(20X)所得图。图2-B为图2-A中细胞数量的定量统计结果柱形图，将其与对照组比较，实验重复三次，*代表差异显著(P〈0.05)，**代表差异极显著(ρ〈0.01)。
[0017]图3为F-actin的分布图。F-actin在A549细胞受到无血清培养基，10%含血清培养基与荜茇酰胺(5，10 μ Μ)处理后的分布改变。
【具体实施方式】
[0018]实施例1划痕实验
[0019]肿瘤细胞通过向周围组织扩增迁移，浸润浸入血管内皮或淋巴管从而进入循环系统，然后在新的宿主环境下，细胞大量增殖，形成转移灶。划痕实验通过在培养成层的细胞表面进行人为划痕，可以模拟细胞在体内的迁移过程。我们进行了细胞划痕实验以考察荜茇酰胺对Α549细胞迁移的影响。
[0020]实验前准备好24孔板，背面用解剖针划好参考线三条，每条间距0.5cm,紫外照射所需的解剖针，24孔板，直尺。细胞铺板后，过夜，次日观察细胞密度达到90% ;细胞长至90%后，使用无血清F-12k饥饿12h。用200 μ I枪头比着直尺进行划线，注意枪头垂直于well的底面，划痕垂直于参考线。用PBS洗涤两次后显微镜下观察是否去除干净划下细胞，如果不干净继续洗涤，直至洗净为止。设置饥饿对照组，和无药品对照组以及不同浓度的药物的实验组，并加入相应的培养液0.5ml/孔，然后在显微镜下拍照。药物处理12h，24h后分别进行拍照观察测量。结果如图1-A所示。当使用荜茇酰胺处理后，与溶剂对照组相比较，发生迁移越过标准线的细胞数量随着给药浓度的增加而减少。统计迁移越过标准线的细胞数目，然后将其与对照组相比较，结果如图1-B，由实验结果可以看出，当荜茇酰胺的浓度为0.625 μ M时，其发生迁移的细胞数目与溶剂对照组相比无统计学差异；当荜茇酰胺浓度达到1.25 μ M后，细胞迁移数目与溶剂对照组比较差异极显著(ρ〈0.01)。综上，荜拨酰胺在浓度达到1.25 4 11后，可以对八549细胞的迁移有抑制作用。
[0021]实施例2Trans well 实验
[0022]为了进一步确证荜拨酰胺对A549细胞的迁移具有抑制作用，我们进行了 Transwell实验。培养A549细胞，收集细胞并加入无FBS的F_12k洗涤三次；500g离心5min，力口入含有不同浓度荜拨酰胺的F-12k，轻轻吹打混匀后加入trans well中。在24孔板中加入含有10%FBS的F-12k培养基。12h后进行吉姆萨染色并拍照计数统计。结果如图2-A、2-B,由结果可以结合划痕试验的结果可以得出结论:在荜拨酰胺浓度为5μ M的条件下，可以显著抑制Α549细胞的迁移。
[0023]实施例3ΜΤΤ法测定荜茇酰胺对Α549细胞活性的影响
[0024]MTT [汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
[0025]实验具体操作如下:96孔板中，每孔种植500-10，000个细胞，每孔体积200 μ I。留8个孔不种植细胞，做空白对照。37°〇，5%0)2条件下孵育过夜，使细胞贴壁。每个孔中加2μ I荜茇酰胺(溶解于DMSO中)。放置在漩涡振荡器上，150rpm震荡5min，使得样品完全混入培养液中。37V，5%C02条件下孵育l_5h，使得药物发挥作用。每个96孔板准备2ml MTT溶液(溶于PBS，浓度为5mg/ml)。每孔加入20 μ I MTT溶液，放置在漩涡振荡器上，150rpm震荡5分钟，使得MTT完全混入培养液中。37°C，5%C02条件下孵育l_5h，使得MTT完全被代谢。倒掉培养基(可以用滤纸吸干96孔板上的残液)。用200 μ I DMSO重悬甲臜(MTT的代谢产物)。放置在漩涡振荡器上，150rpm震荡5分钟，使得甲臜充分的溶解。560nm处读取光密度值，减去670nm的背景光密度值。光密度值的高低与细胞的数量呈正关。
[0026]实验中，我们考察无血清、血清及不同浓度荜茇酰胺(5，10 μ M)对Α549细胞存活的影响。如图1c，5 μ M荜茇酰胺仅导致细胞的存活下降约7%，10 μ M荜茇酰胺导致细胞的存活下降约17%，因此低浓度荜茇酰胺对于肿瘤细胞的存活影响不太，即低浓度荜茇酰胺对于肿瘤细胞的细胞毒作用不强，而5 μ M荜茇酰胺抑制肿瘤细胞迁移的活性高到35-50%以上。这个结果充分说明:与通常抗肿瘤转移药物实际上是通过杀伤肿瘤细胞发挥作用，并不是真正地抑制肿瘤细胞的迁移，荜茇酰胺能够在对肿瘤细胞杀伤很弱的情况下，表现出抑制肿瘤细胞转移的活性。因此，荜茇酰胺具有真正地抑制肿瘤细胞转移的功能，具有开发成抗肿瘤转移药物的应用前景。
[0027]实施例4荜茇酰胺对Α549细胞F_actin的影响
[0028]细胞的迁移是一动态的过程，细胞前端伸出板状的伪足，细胞前端的伪足和细胞外基质ECM形成新的细胞黏着，胞体收缩，细胞尾端和周围的基质黏着解尚，细胞向如运动。在细胞黏附过程中，伴随细胞骨架的改变。我们考察了荜茇酰胺对A549细胞骨架分子F-actin的影响。同时由于血清也能刺激细胞骨架改变，实验中，我们考察无血清、血清及不同浓度荜茇酰胺(5，10 μ M)对A549细胞F-actin分布的影响。如图3，无血清组细胞与基质的相互作用，引起细胞骨架围绕于核周分布，血清组细胞表现出显着的迁移前缘，荜茇酰胺(5，10 μ M)减少了板状伪足在细胞前缘的出现。
[0029]本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
【权利要求】
1.荜茇酰胺及其药用盐在制备抗肿瘤转移药物中的运用。
2.如权利要求1所述的运用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。
3.如权利要求1或2所述的运用，其特征在于，所述抗肿瘤转移药物的制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、口崩制剂或注射剂。
【文档编号】A61P35/04GK104415035SQ201310360539
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】华子春, 张鹏, 黄启来 申请人:江苏靶标生物医药研究所有限公司