Ssx2ip在预防和治疗肿瘤转移中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了SSX2IP在预防和治疗肿瘤转移中的应用。具体地，本发明公开了SSX2IP抑制剂在制备抑制肿瘤转移或抑制肿瘤细胞迁移的药物中的用途。SSX2IP抑制剂可作为药物有效成分抑制肿瘤转移或抑制肿瘤细胞迁移，还可增加肿瘤细胞对化疗药物敏感性或降低肿瘤细胞对化疗药物耐药性。此外，本发明的SSX2IP基因或蛋白及其激动剂可用于促进肿瘤细胞的增殖或迁移，用于制备肿瘤动物模型。
【专利说明】SSX21P在预防和治疗肿瘤转移中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤学领域。更具体地，本发明涉及SSX2IP抑制剂在预防和治疗肿瘤转移、肿瘤细胞迁移以及化疗耐药性行方面的应用。本发明还涉及SSX2IP基因、蛋白或其激动剂在制备肿瘤模型中的应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，居全球(恶性肿瘤)发病率第五位，癌症相关死因第三位，在中国其发病率仅次于肺癌，居第二位。
[0003]在肝癌的综合治疗中，手术切除和化疗是治疗的重要手段，但由于肝癌早期诊断困难，肿瘤转 移速度快，且对化疗药物敏感度不高，导致各种治疗效果不理想，转移患者预后差。
[0004]此外在不同阶段的肝癌患者中，个性化的治疗方案尤其重要。但由于缺乏特异性肝癌转移标志物，治疗的时间窗往往在肝癌转移后才开启，延误了预防肿瘤转移的良好时机。
[0005]因此，本领域迫切需要开发能够抑制肿瘤转移、降低化疗耐药性的治疗药物，以及能够预测或诊断肿瘤转移尤其是肝癌转移的特异性标志物，从而能够预测肝癌转移，进而为更好地预防或治疗肿瘤转移提供基础。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种能够预防和治疗肿瘤转移、肿瘤细胞迁移并能够提高化疗敏感性的SSX2IP抑制剂；本发明还提供了一种对肿瘤转移或肿瘤耐药有预防或治疗作用药物的筛选方法。此外，本发明还提供了一种预测或诊断肿瘤是否转移的试剂盒。
[0007]本发明的第一方面，提供了一种SSX2IP(滑膜肉瘤X断裂点基因2相互作用蛋白，Synovial Sarcoma X brearkpoint2interacting Protein)抑制剂的用途，用于制备抑制肿瘤转移或抑制肿瘤细胞迁移的药物。
[0008]在另一优选例中，所述的SSX2IP蛋白来源于哺乳动物；较佳地，来源于人、小鼠或大鼠；更佳地，来源于人。
[0009]在另一优选例中，所述的肿瘤包括肝癌、胃癌、肠癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤。
[0010]在另一优选例中，所述的肿瘤为肝癌。
[0011]在另一优选例中，所述的抑制剂包括:SSX2IP的抗体、SSX2IP核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及SSX2IP的活性抑制剂。
[0012]在另一优选例中，所述的药物含有药学上可接受的载体、SSX2IP抑制剂和任选的化疗剂。
[0013]在另一优选例中，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药:口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。
[0014]在另一优选例中，所述的药物的制剂选自下组:片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。
[0015]在另一优选例中，所述的SSX2IP抑制剂以0.5_5mg/kg体重的剂量(每次或每天)施用于哺乳动物。
[0016]在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人、小鼠、大鼠，更佳地，为人。
[0017]在另一优选例中，所述的化疗剂包括酰胺(CTX)、异环磷酰胺(IFO)、丝裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、长春花碱(VBL)、依托泊甙(VP16)、威猛(Vumon)、顺钼(CDDP)、氟尿嘧啶(5-FU)、卡钼(CBP)和甲氨蝶呤(MTX)等。
[0018]本发明的第二方面，提供了一种SSX2IP抑制剂的用途，(a)用于制备促进化疗或放疗诱导的细胞凋亡的药物组合物，或(b)用于制备促进化疗或放疗诱导的细胞凋亡的促进剂，或(C)用于制备使得癌细胞对化疗或放疗诱导的细胞凋亡更敏感的增敏剂。
[0019]在另一优选例中，所述的SSX2IP抑制剂用于癌症治疗的增敏剂或促进细胞凋亡的促进剂。
[0020]所述的SSX2IP蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0021]本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性抑制癌细胞迁移的方法，包括步骤:在SSX2IP抑制剂存在下，培养癌细胞，从而抑制癌细胞迁移。
[0022]在另一优选例中，所述的方法包括向癌细胞的培养体系中添加SSX2IP抑制剂，从而抑制癌细胞迁移。
[0023]在另一优选例中，所述的癌细胞包括肝癌细胞、胃癌细胞、肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺细胞、乳腺细胞、黑色素瘤细胞。
[0024]在另一优选例中，在所述方法中，所述的SSX2IP抑制剂的浓度为0.5_5mg/mL。
[0025]本发明的第四方面，提供了一种SSX2IP基因、SSX2IP蛋白或其激动剂的用途，用于制备促进肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的组合物(或促进剂)，或用作促进肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的促进剂。
[0026]在另一优选例中，所述的SSX2IP基因或蛋白来源于哺乳动物；较佳地，来源于人、小鼠或大鼠；更佳地，来源于人。
[0027]在另一优选例中，所述的SSX2IP基因或蛋白是重组人SSX2IP基因或蛋白或来自人血液或血清中的人SSX2IP基因或蛋白。
[0028]在另一优选例中，所述的促进肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的药物用于建立肿瘤模型。
[0029]在另一优选例中，所述的肿瘤为肝癌。
[0030]在另一优选例中，所述的SSX2IP基因、SSX2IP蛋白或其激动剂的用途还包括:在SSX2IP蛋白或其激动剂存在下，培养癌细胞，从而促进癌细胞生长或增殖。
[0031 ] 本发明的第五方面，提供了一种筛选用于抑制肿瘤细胞迁移或用于提高癌细胞药物敏感性的候选化合物的方法，所述方法包括步骤:
[0032] (a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中SSX2IP的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中SSX2IP的表达量和/或活性；[0033]其中，如果测试组中细胞的SSX2IP的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对SSX2IP的表达和/或活性有抑制作用的治疗肿瘤转移或肿瘤细胞迁移或能够提高化疗药物敏感性的化合物；和
[0034](b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，任选地测试所述候选化合物对癌细胞转移或迁移的抑制作用或所述候选化合物对癌细胞药物敏感性的影响作用。
[0035]在另一优选例中，所述的肿瘤包括肝癌、胃癌、肠癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤。
[0036]在另一优选例中，在步骤(b)中包括步骤:测试组中，癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；在对照组中，在癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；其中，如果测试组中癌细胞的迁移距离或侵袭数量显著小于对照组，就表明该测试化合物是对肿瘤转移或肿瘤细胞迁移有抑制作用的或能够提高化疗药物敏感性的化合物。
[0037]本发明第六方面，提供了一种SSX2IP基因或SSX2IP蛋白的用途，用于制备检测肿瘤转移的试剂或试剂盒。
[0038]在另一优选例中，所述的SSX2IP蛋白来源于哺乳动物；较佳地，来源于人、小鼠或大鼠；更佳地，来源于人。
[0039]在另一优选例中，所述的SSX2IP蛋白来源于人，其全长氨基酸序列如SEQ IDN0.:1所示。
[0040]在另一优选例中，所述的SSX2IP基因核苷酸序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0041]在另一优选例中，所述的肿瘤包括:肝癌、胃癌、肠癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤。
[0042]在另一优选例中，所述的试剂包括SSX2IP特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片。
[0043]在另一优选例中，所述的检测包括酶联免疫反应法(ELISA法)检测或时间分辨免疫荧光法(TRFDWi)检测。
[0044]在另一优选例中，所述的SSX2IP蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
[0045]在另一优选例中，所述可检测标记选自下组:生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
[0046]在另一优选例中，所述SSX2IP的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0047]在另一优选例中，所述检测是测定组织样品、血液样品、血清样品或体液样品。
[0048]在另一优选例中，所述的组织样品包括癌组织和癌旁组织。
[0049]本发明的第七方面，提供了一种用于检测肿瘤转移的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测SSX2IP蛋白或mRNA的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测肿瘤转移。
[0050]在另一优选例中，所述的检测肿瘤转移指判断肿瘤转移是否发生，和/或判断发生肿瘤转移的可能性(易感性)大小。
[0051 ] 在另一优选例中，所述判断包括预先判断。 [0052]在另一优选例中，所述的检测SSX2IP蛋白或mRNA的检测试剂包括:
[0053](a).抗SSX2IP蛋白的特异性抗体；和/或[0054](b).特异性扩增SSX2IP的mRNA或cDNA的特异性引物。
[0055]在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容:
[0056]当检测对象的肿瘤组织SSX2IP表达量与癌旁组织的SSX2IP表达量之比≥2，则提示该检测对象肿瘤转移的几率高于普通人群。
[0057]在另一优选例中，所述的表达量是相对于对照基因(如β -肌动蛋白)的相对表达量。
[0058]在另一优选例中，所述的试剂盒还用于预测肿瘤患者生存时间。
[0059]在另一优选例中，当检测对象是肿瘤患者时，如果检测对象肿瘤组织中的SSX2IP表达量Yl显著高于同类癌症患者肿瘤组织中SSX2IP的表达量Υ2，则提示该检测对象生存时间的低于同类癌症患者的平均生存时间；
[0060]如果检测对象肿瘤组织中的SSX2IP表达量Yl显著低于同类癌症患者肿瘤组织中SSX2IP的表达量Υ2，则提示该检测对象生存时间的高于同类癌症患者的平均生存时间。
[0061]在另一优选例中，所述的显著高于是指Υ1/Υ2≥2。
[0062]在另一优选例中，所述的显著低于是指Υ1/Υ2 ≤ 0.5。
[0063]本发明的第八方面，提供了一种SSX2IP基因或蛋白的用途，作为检测肿瘤转移的特异性标志物用于制备检测试剂；或用作检测肿瘤转移的特异性标志物。
[0064]在另一优选例中，所述的肿瘤包括肝癌。
[0065]本发明提供了一种预测或诊断肿瘤转移的方法，包括步骤:
[0066](a).准备受试者测试样品；
[0067](b).检测测试样品中SSX2IP相对肌动蛋白的mRNA表达量并与参比值相比，当其比值> 2则提示该检测对象肿瘤转移的几率高于普通人群。
[0068]在另一优选例中，所述测试样品为组织样品、血液样品、血清样品或体液样品。
[0069]在另一优选例中，所述参比值为非肿瘤样品中SSX2IP的表达量。
[0070]在另一优选例中，所述检测步骤b包括检测SSX2IP mRNA的量，或SSX2IPcDNA的量；和/或检测SSX2IP蛋白的量。
[0071]在另一优选例中，所述检测步骤b包括通过RT-PCR或PCR方法进行检测。
[0072]在另一优选例中，所述的检测步骤b包括使用抗SSX2IP蛋白的抗体进行检测。
[0073]此外，本发明还包括一种抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的方法，包括步骤:给需要治疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的SSX2IP蛋白或其激动剂。
[0074]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0075]图1显示了 Kaplan-Meier分析SSX2IP在51例肝癌病人中表达与生存期的关系，其中，SSX2IP高表达病人组(31例)其生存期显著低于SSX2IP低表达病人组(20)(P=0.004)。
[0076]图2显示了过表达SSX2IP与肝癌细胞的腹腔扩散和肝转移能力的关系:其中，图2A显示了.B拍照记录肝癌细胞在腹腔内的扩散情况。B.统计发现过表达SSX2IP的肝癌细胞其在裸鼠腹腔中扩散并形成肿瘤的能力显著高于转染空载细胞组和未处理细胞组(6.2±0.84，2.6±0.89，2.4±1.14，**P < 0.001)。C.BEL-7402, BEL-7402Vector,BEL-7402SSX2IP三类细胞分别通过尾静脉注射入裸鼠体内，10周后，处死并解剖，拍照记录裸鼠肝的情况。D.统计发现，过表达SSX2IP的肝癌细胞在裸鼠体内发生肝转移的比率显著高于空载对照和空白对照组，转移比率分别为7/10，2/10和1/10，P = 0.023.[0077]图3显示了 SSX2IP能够促进肝癌细胞的划痕愈合能力。其中，划痕愈合实验反应了肝癌细胞的移动能力。
[0078]图3A 显示了通过划痕愈合实验检测 SMMC-7721, SMMC-772Ivector, SMMC-772Issx2ip三类细胞的移动能力，发现过表达SSX2IP的肝癌细胞细胞SMMC-772Issx2ip,其移动能力显著高于空载细胞组合空白对照细胞组，48小时后的平均间隙距离为:170.83±36.96 μ m,516.67±25.57m, 525.00±31.92 μ m,林P < 0.001。
[0079]图3Β 显示了通过划痕愈合实验检测 BEL-7402, BEL-7402Vector, BEL_7402SSX2IP 三类细胞的移动能力，发现过表达SSX2IP的肝癌细胞细胞BEL-7402SSX2IP，其移动能力显著高于空载细胞组合空白对照细胞组，48小时后的平均间隙距离为:183.33 ± 49.07m，312.50±25.00m, 329.17±15.96 μ m,林P < 0.001。
[0080]图4.SSX2IP能够促进肝癌细胞的侵袭和迁移能力 [0081]图4Α显示了 SSX2IP对肝癌细胞SMMC-7721侵袭迁移能力的促进结果:
[0082]图4B显示了统计结果表明过表达SSX2IP肝癌细胞SMMC_7721SSX2IP，其侵袭和迁移的能力显著增强。迁移实验中，过表达SSX2IP组对比对照组的数量统计为:123.33±9.45，59.67±4.73,51.33±6.03 ;侵袭实验中，过表达SSX2IP组对比对照组的数量统计为:92.00±7.00,43.67±4.16,38.00±3.61，**P < 0.001。
[0083]图4C显示了 SSX2IP对肝癌细胞BEL-7402侵袭迁移能力的促进结果
[0084]图4D显示了统计结果，表明过表达SSX2IP肝癌细胞BEL-7402SSX2IP，其侵袭和迁移的能力显著增强
[0085]迁移实验中，过表达SSX2IP组对比对照组的数量统计为:154.67 土 14.05，103.67 ±10.70，109.00 ±7.55 ;*P < 0.01。侵袭实验中，过表达SSX2IP组对比对照组的数量统计为:113.00±6.56,63.33±11.50,60.67±11.02，*P < 0.01。
[0086]图5.SSX2IP能够降低肝癌细胞对化疗药物的敏感度，增加耐药性
[0087]图 5A 显示了 SMMC-7721, SMMC-772 IVector 和 SMMC-7721SSX2IP 对化疗药物 5_Fu的剂量反应曲线和IC5tl值，结果显示SMMC-7721SSX2IP对5-FU的IC5tl值显著高于对照组(24.68± 1.17 μ Μ, 14.59±0.77Μ, 13.60±0.88 μ Μ, **Ρ〈0.001)。
[0088]图 5Β 显示了 BEL-7402, BEL_7402Vector 和 BEL-7402SSX2IP 对化疗药物 5_Fu的剂量反应曲线和IC5tl值，结果显示BEL-7402SSX2IP对5-FU的IC5tl值显著高于对照组(28.52±0.65 μ Μ, 12.73± 1.81 μ Μ, 14.16± 1.20 μ Μ, **Ρ〈0.001)。
[0089]图 5C 显示了 BEL-7402, SMMC-772IVector 和 SMMC-7721SSX2IP 对化疗药物 CDDP的剂量反应曲线和IC5tl值，结果显示SMMC-7721SSX2IP对⑶DP的IC5tl值显著高于对照组(11.38± 1.42 μ Μ, 5.72±0.75 μ Μ, 6.18±0.81 μ Μ, **Ρ〈0.001)。
[0090]图 ? 显示了 BEL-7402, BEL_7402Vector 和 BEL-7402SSX2IP 对化疗药物 CDDP的剂量反应曲线和IC5tl值，结果显示BEL-7402SSX2IP对CDDP的IC5tl值显著高于对照组(9.86±1.24 μ Μ, 6.13±0.24 μ Μ, 5.90±0.47 μ Μ, **Ρ〈0.001)。
【具体实施方式】
[0091]本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现，本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现，SSX2IP抑制剂可以用作预防或治疗肿瘤转移、肿瘤细胞迁移，并能提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；本发明人还发现了 SSX2IP基因或蛋白可以用于制备提高肿瘤对化疗药物敏感性、筛选抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的药物；此外，本发明人还发现了 SSX2IP基因或蛋白及其激动剂可以用作促进肿瘤转移、肿瘤细胞迁移，并增强肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，可以用于动物耐药、转移模型的制备。
[0092]此外，本发明人通过研究还发现，SSX2IP的高表达与肿瘤转移有很强的相关性，实验证明，SSX2IP可以作为预测或诊断肿瘤转移的特异性标志物，从而制备预测肿瘤是否可能或诊断肿瘤是否已经发生转移的检测试剂盒。此外，本发明人还发现了 SSX2IP可以用于预测肿瘤患者的生存时间。在此基础上，完成了本发明。
[0093]SSX2IP蛋白和多核苷酸
[0094]在本发明中，“本发明蛋白”、“本发明多肽”、“SSX2IP蛋白”可互换使用，指滑膜肉瘤X断裂点2相互作用蛋白(简称为SSX2IP)。应理解，所述术语还包括SSX2IP的活性片段和衍生物。
[0095]在本发明中，“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码SSX2IP蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序 列，包括正义和反义核酸。SSSX2IP定位于Chr0m0S0melp22.3，基因全长46kb,其中包含14个外显子。
[0096]在本发明中，术语“SSX2IP蛋白”或“SSX2IP多肽”可互换使用，都指具有人蛋白SSX2IP氨基酸序列的蛋白或多肽。目前SSX2IP已被确定为急性髓性白血病的相关抗原，是一个潜在的白血病免疫治疗的靶点。
[0097]可用于本发明的SSX2IP基因核苷酸序列的5种mRNA转录本的Genbank登录号为NM001166293.1;NM001166294.1;NM001166295.1;NM001166417.1;NM014021.3。
[0098]一种优选的SSX2IP基因核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示，Gene ID: 117178，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.:2所示，登录号为NP001159889.1。
[0099]如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0100]如本文所用，“分离的SSX2IP蛋白或多肽”是指SSX2IP蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化SSX2IP蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发明中，SSX2IP蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0101]本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0102]本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
[0103]编码SSX2IP的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0104]本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
[0105]本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码SSX2IP蛋白的多核苷酸。
[0106]本发明的人SSX2IP核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0107]一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0108]此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0109]应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
[0110]本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或SSX2IP蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
[0111]通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的SSX2IP蛋白。一般来说有以下步骤:
[0112](I).用本发明的编码人SSX2IP蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0113](2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0114](3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0115]本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人SSX2IP编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0116] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。[0117]包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0118]宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0、COS、或293细胞的动物细胞等。
[0119]用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0120]获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。 [0121]在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 ο
[0122]抑制剂
[0123]利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与SSX2IP蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。
[0124]本发明SSX2IP蛋白的抑制剂(包括抗体、反义核酸以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制SSX2IP蛋白的表达和/或活性，进而抑制肿瘤的转移或肿瘤细胞的迁移。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于):瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
[0125]可用于本发明的抑制剂包括:SSX2IP的抗体、抑制性mRNA、SSX2IP核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及SSX2IP的活性抑制剂。其中，典型的SSX2IP抑制剂为抑制性miRNA、SiRNA0
[0126]典型地，将SSX2IP基因作为制备预防或治疗肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的药物的靶点的技术方案包括以下方案:
[0127]1.化学合成双链核糖核酸分子，其序列特异性针对SSX2IP基因序列，利用脂质体包裹递送至肿瘤细胞内干扰SSX2IP基因的表达，观察软琼脂克隆形成能力、细胞迁移能力等细胞生物学特性的改变。可利用本领域常规的方法来设计和合成特异性针对SSX2IP的核酸序列(如siRNA)。
[0128]2.利用各种载体，包括DNA载体、慢病毒载体来干扰SSX2IP基因的表达，达到体内干扰SSX2IP基因的效果，检测它们对裸鼠瘤体腹腔扩散或肝转移的治疗效果，从而实现抑制肿瘤增殖的目的。
[0129]3.获得能够特异性抑制SSX2IP基因转运活性的多肽、单克隆抗体，达到抑制SSX2IP活性的目的，从而现实抑制肿瘤细胞转移或迁移的目的。
[0130]本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明SSX2IP抑制剂(如抗体、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约I微克-10毫克/千克体重。
[0131]抗体
[0132]本发明还包括对人SSX2IP蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人SSX2IP基因产物或片段。较佳地，指那些能与人SSX2IP基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，将提纯的人SSX2IP基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人SSX2IP蛋白或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。
[0133]本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab ) 2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
[0134]本发明的抗体包括可以抑制SSX2IP功能的抗体，也可以是不影响人SSX2IP功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人SSX2IP基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人SSX2IP基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的SSX2IP基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞(如E.coli)中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化SSX2IP蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。
[0135]可用于本发明的SSX2IP抗体可以是抗人SSX2IP蛋白抗体。本发明的抗人SSX2IP蛋白抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人SSX2IP蛋白。
[0136]药物组合物和给药方式
[0137]本发明提供了含有活性成分(a)SSX2IP抑制剂；(b)药学上可接受的载体；以及任选的(C)化疗剂的药物组合物。
[0138]在本发明的药物组合物中，SSX2IP抑制剂SSX2IP抑制剂的含量没有特别限制，通常为 0.01-95wt%,较佳地为 0.l-90wt%o
[0139]本发明的药物组合物可以是单方制剂，也可以是复方制剂。
[0140]在复方制剂中，除了含有SSX2IP抑制剂之外，还可包含其他抗肿瘤化合物，例如化疗剂。代表性的化疗剂包括(但并不限于):烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物以及相关抑制剂、长春花碱类、epipodopyvllotoxins、抗生素、L 一天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、钼配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-释放激素类似物。优选的化疗剂包括:5—氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利钼、卡培他滨、紫杉醇和多西紫衫醇。
[0141]本发明的药物组合物的剂型和制备方法没有特别限制，可用本领域常规通用的制法制成片剂、胶囊、颗粒剂、缓释剂、注射剂等各种剂型。优选的剂型是口服制剂(如片剂)和注射剂。
[0142]在本发明中，SSX2IP抑制剂或含SSX2IP抑制剂的药物制剂可用于预防和治疗肿瘤转移或肿瘤细胞迁移。
[0143]适用于本发明的肿瘤包括(但并不限于):黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、白细胞过多症、成神经细胞瘤、鳞状细胞癌、头癌、颈癌、牙龈癌、舌癌、乳癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、肉瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑瘤、结肠癌以及膀胱癌。
[0144]在另一个优选例中，所述的肿瘤为肝癌。
[0145]在本发明中，给药方式没有特别限制，可以通过口服、静脉内、肌内、腹腔内或皮下等途径给药。
[0146]本发明制剂可以每天服用或给药一次或两次、或多次，或者以缓释方式给药。优选的方式是每天服药一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺应性。
[0147]服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量为每人Img~200g，较佳地为IOmg ~100g0
[0148]激动剂
[0149]利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与SSX2IP蛋白发生相互作用的物质，尤其是激动剂等。
[0150]本发明SSX2IP蛋白的激动剂，当进行施用(给药)时，可促进SSX2IP蛋白的表达和/或活性，进而促进癌细胞(包括肝癌)的转移或迁移。通常，可将这些激动剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质而有所变化。配制好的药物组合物可以通过体外或非体外的常规途径进行给药，其中包括(但并不限于):瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
[0151]本发明的SSX2IP基因、蛋白或其激动剂特别适用于体外肿瘤细胞的培养以及肿瘤动物模型的制备，尤其是肝癌细胞肝内转移、远处转移或腹腔转移动物模型建模。
[0152]筛选方法
[0153]本发明还提供了基于SSX2IP进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(抑制)SSX2IP表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对癌细胞的抑制作用。
[0154]其中，代表性的癌细胞包括肝癌细胞、胃癌细胞、肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺细胞、乳腺细胞、黑色素瘤细胞。
[0155] 本发明提供的筛选预防或治疗肿瘤转移、肿瘤细胞迁移或提高化疗药物敏感性的候选化合物的方法，基于该化合物对SSX2IP的表达量和/或活性的影响，一种典型的筛选方法包括步骤:[0156](a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中SSX2IP的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中SSX2IP的表达量和/或活性；
[0157]其中，如果测试组中细胞的SSX2IP的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对SSX2IP的表达和/或活性有抑制作用的治疗肝癌的候选化合物。和/或
[0158](b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对肝癌细胞转移或迁移的抑制作用。如，在测试组中，肝癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察肝癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；在对照组中，在肝癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察肝癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；其中，如果测试组中肝癌细胞的迁移距离或侵袭数量显著小于对照组，就表明该测试化合物是对肝癌转移细胞或肝癌细胞迁移有抑制作用的治疗肝癌的候选化合物。
[0159]检测方法和试剂盒
[0160]本发明涉及定量和定位检测人SSX2IP蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人SSX2IP蛋白水平，可以用于诊断肿瘤的转移或肿瘤细胞的迁移。
[0161]一种检测样品中是否存在SSX2IP蛋白的方法是利用SSX2IP蛋白的特异性抗体进行检测，它包括:将样品与SSX2IP蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在SSX2IP蛋白。
[0162]SSX2IP蛋白或其 多核苷酸可用于SSX2IP蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗SSX2IP的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的SSX2IP 蛋白。
[0163]本发明还提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有特异性扩增SSX2IP的引物对和/或SSX2IP特异性抗体以及标签或说明书。
[0164]其中，所述的标签或说明书注明以下内容:当检测对象的SSX2IP相对-肌动蛋白的mRNA表达量与癌旁组织的SSX2IP相对-肌动蛋白的mRNA表达量之比>2，则提示该检测对象肿瘤转移的几率高于普通人群。
[0165]一种典型的本发明的试剂盒可用于检测人肝组织样品或血液样品。
[0166]本发明还包括一种抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的方法，包括步骤:给需要治疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的SSX2IP抑制剂。
[0167]本发明的有益效果
[0168]1.本发明SSX2IP抑制剂可以有效地抑制肿瘤，特别是肝癌的转移或肝癌细胞的迁移，可作为预防或治疗肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的药物。
[0169]2.本发明SSX2IP抑制剂可以显著降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，从而提高对化疗药物的敏感度，以提高化疗药物的效果。
[0170]3.本发明的SSX2IP抑制剂还可以用作药物的筛选，从而筛选出对能够有效抑制肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的药物，或对化疗药敏感的药物。
[0171]4.本发明SSX2IP基因或蛋白及其激动剂可用于促进肿瘤的转移或迁移，可用于离体癌细胞的培养或肿瘤动物模型的建模。[0172]5.本发明SSX2IP基因或蛋白可以用于作为诊断或预测肿瘤，尤其是肝癌转移的特异性标志物，即SSX2IP高表达者肿瘤转移的几率更大。
[0173]6.本发明SSX2IP基因或蛋白还可以用于预测肿瘤患者的生存时间，即SSX2IP表达量越高，肿瘤患者的生存时间越短。
[0174]实施例1
[0175]制备预测或诊断肿瘤是否转移/预测患者生存期的试剂盒
[0176]制备一用于组织学检测预测或诊断肿瘤是否转移/预测患者生存期的试剂盒，所述试剂盒包括:
[0177](a)容器，以及位于容器内的特异性针对SSX2IP的以下抗体:抗人SSX2IP的抗体(购自Abcam和Sigma公司);和
[0178](b)以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于预测肿瘤是否转移检测或患者生存期。
[0179]实施例2SSX2IP蛋白表达与肿瘤癌栓形成和肿瘤包膜完整性的相关性
[0180]材料:53位肝癌病人样本，均收集于复旦大学附属中山医院。获得受试者的知情同意及医院的伦理审查委员会的批准。 [0181]方法:采用实施例1制备的试剂盒，分组情况如表1所示；观察指标:肿瘤大小、癌栓形成及肿瘤包膜完整性；测定肿瘤瘤体内SSX2IP的表达水平，并观察其表达水平对于癌症患者并发症的发生有无意义。
[0182]结果:如表1所示:
[0183]表1
【权利要求】
1.一种滑膜肉瘤X断裂点基因2相互作用蛋白即SSX2IP的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备抑制肿瘤转移或抑制肿瘤细胞迁移的药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的SSX2IP蛋白来源于哺乳动物；较佳地，来源于人、小鼠或大鼠。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括肝癌、胃癌、肠癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂包括:SSX2IP的抗体、SSX2IP核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及SSX2IP的活性抑制剂。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物含有药学上可接受的载体、SSX2IP抑制剂和任选的化疗剂。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的化疗剂包括酰胺(CTX)、异环磷酰胺(IFO)、丝裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、长春花碱(VBL)、依托泊甙(VP16)、威猛(Vumon)、顺钼(CDDP)、氟尿嘧啶(5-FU)、卡钼(CBP)和甲氨蝶呤(MTX)。
7.—种SSX2IP抑制剂的用途，其特征在于，(a)用于制备促进化疗或放疗诱导的细胞凋亡的药物组合物，或(b)用于制备促进化疗或放疗诱导的细胞凋亡的促进剂，或(C)用于制备使得癌细胞对 化疗或放疗诱导的细胞凋亡更敏感的增敏剂。
8.—种体外非治疗性抑制癌细胞迁移的方法，其特征在于，包括步骤:在SSX2IP抑制剂存在下，培养癌细胞，从而抑制癌细胞迁移。
9.一种SSX2IP基因、SSX2IP蛋白或其激动剂的用途，其特征在于，用于制备促进肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的组合物。
10.一种筛选用于抑制肿瘤细胞迁移或用于提高癌细胞药物敏感性的候选化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤: (a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中SSX2IP的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中SSX2IP的表达量和/或活性； 其中，如果测试组中细胞的SSX2IP的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对SSX2IP的表达和/或活性有抑制作用的治疗肿瘤转移或肿瘤细胞迁移或能够提高化疗药物敏感性的化合物；和 (b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，任选地测试所述候选化合物对癌细胞转移或迁移的抑制作用或所述候选化合物对癌细胞药物敏感性的影响作用。
【文档编号】A61K39/395GK104001174SQ201310062585
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月27日 优先权日:2013年2月27日
【发明者】霍克克, 李璞 申请人:霍克克, 李璞