全人源抗rankl抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及全人源化抗体，具体地，本发明涉及全人源抗RANKL抗体，编码该抗体 的核酸分子以及包含该抗体的组合物，本发明还涉及所述抗体在制备用于防治骨质疏松、 关节炎骨溶解破坏或肿瘤骨转移等疾病的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 骨形成和骨重建由骨吸收破骨细胞和骨形成成骨细胞协调完成，在人的发育和成 长中负责骨代谢和骨骼重建。在骨骼的特定位置骨不断的吸收和形成，估计每年人体中约 10%的骨总量会重建。源于单核/巨噬细胞前体的破骨细胞，活化后可对骨进行重吸收，最 终破骨细胞发生凋亡。接着，来源于前成骨细胞/基质细胞的新生成的成骨细胞在吸收部 位形成骨质。破骨细胞的发展受控于成骨细胞，以使骨吸收和形成过程紧密配合。即在每 个骨吸收循环后跟着一轮骨形成。破骨细胞与成骨细胞活动的失衡会导致以骨丢失（骨质 疏松）或骨增加（骨硬化症）为特征的骨骼异常。（Khosla，Endocrinology, 2001，142, 505 0-5055；Nakashimaetal. ,Curr.Opin.Rheumatol. , 2003, 15, 280-287).
[0003] 成骨细胞与破骨细胞间的通信通过细胞因子和细胞间作用实现。在骨重建中 起关键作用的一个细胞因子是核因子kB受体活化因子配基（receptoractivatorof NF-kappaBIigand，RANKL)。RANKL是首个被发现的TNF配基家族成员，也被称为肿瘤 坏死因子相关激活诱导因子（tumornecrosis-factor-relatedactivation-induced cytokine,TRANCE)、骨保护素配基（osteoprotegerinligand, 0PGL)、破骨细胞分化因 子（osteoclastdifferentiationfactor, 0DF)、肿瘤坏死因子（配基）超家族成员 11(tumornecrosisfactor(ligand)superfamilymember11,TNFSFlI),RANKL后来被认 定是体外诱导破骨细胞分化的细胞因子。（Andersonetal. ,Nature, 1997, 390, 175-179 ; Laceyetal. ,Cell, 1998, 93, 165-176；ffongetal. ,J.Exp.Med. , 1997, 186, 2075-2080 ； Yasudaetal. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1998, 95, 3597-3602) 〇 人类RANKL的基 因位于染色体13ql4。RANKL在骨骼、骨髓和淋巴组织中表达水平最高（Anderson etal. ,Nature, 1997, 390, 175-179；Laceyetal.,Cell,1998,93, 165-176；ffong etal. ,J.Exp.Med. , 1997, 186, 2075-2080；Yasudaetal. ,Proc.Natl.Acad.Sci. 1^八，1998,95,3597-3602)，也可在脑、心、肾、骨骼肌和皮肤中检测到〇^竹8(^13111^ 86七 al.，Bone, 1999, 25, 525-534) 〇
[0004]RANKL由三种RANKL亚基组装形成功能性的三聚体分子。RANKL最初锚定 在细胞膜上，在肿瘤坏死因子a转化酶（metalloprotease-disintegrinTNF-alpha convertase，TACE)的水解作用下，从细胞表面释放其细胞外部分蛋白质（Lumetal.，J. Biol.Chem.，1999, 274, 13613-13618)。RANKL对促进破骨细胞分化，增强其活力，以及抑 制破骨细胞凋亡是必不可少的（Fulleretal.，J.Exp.Med. ,1998, 188, 997-1001;Lacey etal. ,Cell, 1998, 93, 165-176；Lumetal. ,J.Biol.Chem. , 1999, 274, 13613-13618 ； Yasudaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1998, 95, 3597-3602)。RANK受体在前成骨细 胞和骨髓基质细胞表面表达。RANKL的表达受各种激素、细胞因子、生长因子和糖皮质激 素正调节或负调节，包括维生素D3、甲状旁腺激素、白细胞介素1-0和1即-(1，这些都可 增加RANKL的表达（Kongetal.，Immunol.Today, 2000, 21，495-502)。在骨吸收和骨形 成的循环之初，RANKL与破骨细胞前体细胞表面的功能性受体RANK结合（Andersonet al.，Nature, 1997, 390, 175-179;Laceyetal.，Cell, 1998, 93, 165-176)。RANKL和RANK 的相互作用促进破骨细胞的成熟，成熟破骨细胞分化为多核、具有骨吸收功能以表达特 异性标记物抗酒石酸酸性憐酸酶（tartrate-resistantacidphosphatase，TRAP)为特 征（Burgessetal.，J.Cell.Biol. ,1999, 145, 527-538;Hsuetal.，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，1999, 96, 3540-3545;Lumetal.，J.Biol.Chem.，1999, 274, 13613-13618 ; Yasudaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1998, 95, 3597-3602)。RANKL也可与水溶性受 体骨保护素（OPG)结合，OPG主要由骨髓基质细胞表达并抑制RANKL介导的破骨细胞成熟 和活化（1^。6丫6七&1.，〇611，1998,93，165-176;￥&811(13 6七31.，？1'〇。.似1:1.八。&(1.3。;[. USA，1998, 95, 3597-3602)。PTH为骨重建的一种主要调节因子，通过增加RANKL表达同时 减少OPG的表达，促进破骨细胞活性（LeeandLorenzo,Endocrinology, 1999, 140, 3552-3 561)。当前成骨细胞分化时，RANKL的mRNA水平显著下降，而OPGmRNA水平显著升高（Gori etal.，Endocrinology, 2000, 141，4768-4776)。RANKL与OPG水平之间的动态联系使破骨 细胞的活动紧接着成骨细胞的活动，以此完成骨吸收和骨形成的循环。
[0005] 通过从细胞内存储库中释放钙，RANKL诱导破骨细胞中的钙含量瞬时升高 (Komarovaetal.，J.Biol.Chem.，2003, 278, 8286-8293)。阻断RANKL基因的纯合型小鼠 出生三周后，表现出严重的生长迟缓。由于成骨细胞不能支持破骨细胞，RANKL基因缺陷小 鼠由于缺少成骨细胞对破骨细胞形成的支持作用，表现为严重的骨硬化症（骨质增厚），牙 萌出缺陷和破骨细胞缺失（Kongetal.，Immunol.Today, 2000, 21，495-502)。
[0006]RANKL的功能不仅在于骨骼的形成和重建，RANKL基因缺陷小鼠也表现出T 和B淋巴细胞早期分化缺陷和淋巴结缺失，这表明RANKL是淋巴器官和淋巴细胞发育 的调节因子，（Kongetal.，Immunol.Today, 2000, 21,495-502)。T细胞受体刺激诱导 RANKL基因的表达，从而导致T细胞中c-JunN-末端激酶的活化（Wongetal.，J.Biol. Chem.，1997, 272, 25190-25194)。RANKL还参与免疫系统功能调节，通过抑制细胞凋亡而作 为髓源树突状细胞的重要存活因子（Lumetal.，J.Biol.Chem.，1999, 274, 13613-13618; Wongetal.，J.Exp.Med，1997, 186, 2075-2080)。此外，小鼠妊娠期间肺泡乳腺结构发育 也需要RANKL的参与（Fataetal.，Cell, 2000, 103, 41-50)。
[0007]RANKL不适当地活化破骨细胞会使骨吸收过程失衡，导致骨吸收大于骨形成。在许 多骨质疏松症中，包括绝经后妇女骨质疏松症、与年龄相关的骨质疏松症、牙周病、家族性 膨胀性骨溶解症、佩吉特氏病中都观察到局部或全身性的骨丢失（Khosla,Endocrinology, 2001，142, 5050-5055)。在上述这些疾病中已报道了RANKLmRNA表达上调。
[0008] 佩吉特氏病的特征是具有导致骨吸收增加的大量异常破骨细胞。佩吉特氏病患者 中分离的骨髓间质细胞系和病患骨髓中的RANKLmRNA表达都升高。而且佩吉特氏病患者的 破骨细胞前体在形成破骨细胞过程中所需RANKL浓度比正常骨髓细胞低（Menaaetal.，J. Clin.Invest.，2000, 105, 1833-1838)。
[0009] 具有骨质减少的其他疾病，如类风湿性关节炎、慢性病毒感染、成人及儿童白血 病是以T细胞激活和骨破坏为特征（Kongetal.，Immunol.Today, 2000, 21,495-502)。 类风湿性关节炎是一种慢性炎性疾病，特征是渐进性破骨细胞介导的骨吸收。类风湿 性关节炎滑膜液中含有破骨细胞前体、表达RANKL的T细胞和OPG产生的B细胞。RA 滑膜液中的培养的巨噬细胞能够依赖RANKL分化为破骨细胞（1切1^8&的&1.，工 Pathol.，2000, 192, 97-104)。在T细胞依赖的试验性关节炎大鼠模型中，表现出人 类RA的许多临床特征，通过OPG治疗，抑制RANKL功能从而可防止骨破坏（Konget al.，Nature, 1999, 402, 304-309)。
[0010] 多发性骨髓瘤是以骨质疏松和骨破坏为突出特征的癌症。多发性骨髓瘤细胞促进 RANKL表达，同时也抑制骨髓基质细胞的OPG表达，导致RANKL与OPG水平失衡以及破骨细 胞的异常生成和活化（Pearseetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2001，98, 11581-11586)。 此外，有些癌细胞表达分泌性RANKL，导致恶性肿瘤患者高钙血症（Nagaietal. ,Biochem. Biophys.Res.Commun.，2000, 269, 532-536)。经糖皮质激素治疗后，成骨细胞中RANKL增 加，同时OPG表达减少，这会激活破骨细胞形成，以此全身糖皮质激素治疗可产生严重骨质 疏松（Hofbaueretal.，Endocrinology, 1999, 140, 4382-4389)。?
[0011] 免疫功能与骨生理学相关，免疫细胞表达RANKL提供了免疫系统紊乱带来的骨密 度降低的分子解释。因此通过抑制RANKL功能，进而抑制破骨细胞活性，能改善免疫炎症导 致的骨质疏松（Kongetal.，Immunol.Today, 2000, 21，495-502)。
[0012] 由于RANKL参与多种疾病，RANKL表达的上