示，BA05-1与 RANKL的结合能力与AMG162相当，而BA05-2与RANKL的结合能力略优于AMG162。
[0108] 实施例4 :BA05-1和BA05-2阻断RANKL与其同源受体的结合
[0109] 如图2所示，检测三种抗RANKL抗体阻断RANKL与其受体结合的能力。具体地， 实验前16h将人RANK(2iig/ml，购于R&D，货号683-RK-100)包被于96孔板上。接着加入 与不同浓度重组人RANKL抗体BA05-1、BA05-2、AMG162预孵育的0. 5iig/ml生物素标记 RANKL(eBioscience,货号 13-6619-82)，37°C，30min。加入 50ull: 5000 稀释的HRP标记的 亲和素（Pierce，货号N100)，37°C孵育Ih用于检测与包被RANK结合的RANKL。抗RANKL BA05-1和BA05-2抗体特异性阻断RANKL与RANK结合的能力与AMG162相当。
[0110] 实施例5 :抗RANKL抗体BA05-1和BA05-2对RANKL诱导的破骨细胞分化的抑制 作用
[0111] 检测抗RANKL抗体BA05-1和BA05-2抑制RANKL诱导的RAW破骨细胞分化的能 力（见图3)。RAW264. 7细胞与一定量的人RANKL(40ng/ml)和不同量的抗RANKL抗体 BA05-1、BA05-2、AMG162在细胞培养基中共孵育4天。4天结束时，利用渗透和酸化对细胞 进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP)活性染色，然后用磷酸对硝基苯酯（pNPP)处理5min。加 入50iilO. 5MNa0H溶液终止反应。利用TRAP活性将磷酸对硝基苯酯转化为对硝基苯酚，通 过测量405nm处光密度进行定量。结果显示，BA05-1和BA05-2对RANKL诱导的破骨细胞 分化具有抑制作用，并且与AMG162具有相似的活性。
[0112] 实施例6 :抗体BA05-1和BA05-2对RANKL相关免疫功能的抑制
[0113] 利用Ficoll密度梯度离心从肝素处理过的全血中分离外周血单个核细胞 (PBMC)。用抗RANKL抗体与PBMC共孵育4h进行预处理，预处理后的PBMC与固定的RANK-Fc 融合蛋白（购自R/DSystems，货号683-RK-100)在37°C，5%C02条件下培养48h，使得 RANKL形成多聚体.VEGF-Fc融合蛋白（购自R/DSystems，货号357-KD-050)作为同型对 照。培养上清中的TNFa和IL-6 水平利用OptEIA(BDBiosciences，SanDiego,CA)的ELISA 方法按照说明书进行测定。利用流式细胞仪通过双染色T细胞标记分子（PE-偶联抗CD3) 检测RANKL阳性T细胞，并通过与FITC偶联的羊抗人IgG二抗（Sigma)孵育检测RANK-Fc 融合蛋白。
[0114] 在通过固定的RANK-Fc诱导RANKL信号前，用抗RANKL抗体预处理PBMC，降低了 TNFa和IL-6的释放。但是与AMG162相比，BA05-1和BA05-2抗体对细胞因子释放的抑制 作用更小（图4)。这可能是由于RANKL阳性T细胞消耗更少造成的（图5)。
[0115] 实施例7:抗RANKL抗体BA05-1和BA05-2的体内有效性
[0116] 六只健康雌性食蟹猴（4. 5岁）分别皮下接受单剂量的PBS(n= 2)，10mg/kg的 BA05-1(n= 2)或者10mg/kg的BA05-2(n= 2)。通过监测血清骨生物标志物C-末端交联I 型胶原蛋白（CTX-I)的血浆水平来评估有效性。收集基础水平（实验前1周）、第1周和第 2周血清样品，并冻存于_70°C。利用可商购的ELISA试剂盒（Mybiosource.com，MBS737402) 测量血清CTX-I水平，该试剂盒特异于I型胶原蛋白C末端端肽的氨基酸序列，以检测破骨 性骨吸收时产生的I型胶原蛋白片段。根据标准样品浓度的颜色密度（O.D.)值制定标准 曲线。每个样品的CTX-I浓度从这条标准曲线上得出（图6)。
[0117] 测量血清替代标志物CTX-I水平表明，BA05-1和BA05-2急性且大幅度地降低了 骨吸收中CTX-I的水平，表明骨重建减少。同样地，单剂量的BA05-1和BA05-2显著降低 了TRAP活性，表明显著抑制了破骨活性（图7)。TRAP活性用降低猴抗酒石酸酸性磷酸酶 5B(TRACP-5B)ELISA试剂盒（Mybiosource.com，MBS025470)进行测量。
[0118] 实施例8:抗RANKL抗体BA05-1和BA05-2的血清稳定性
[0119] 抗RANKL抗体BA05-1，BA05-2和AMG162与50%人血清37°C条件下共孵育两周。 尺寸排除色谱（SizeExclusionChromatography,SEC)HPLC监测纯化抗体的纯度和均一 性。样品在PBS(pH7.4)中以lml/min的流速通过analyticalSuperdex20010/30Tricorn 柱（GEHealthcare)。214和280nm处进行UV检测。利用凝胶过滤标准品（Bio-Rad)确定 IgG大小。图8显示，在37°C孵育两周条件下，BA05-1和BA05-2比AMG162在人血清中更 加稳定。
[0120] 尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根 据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保 护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
【主权项】
1. 全人源抗RANKL抗体或其片段，其包含如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3所示的重链 以及如SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7所示的轻链；或者选自以下（1) - (4)中的一项或几项： ⑴其中所述重链的可变区序列为：在所述重链的可变区序列即SEQ ID NO :9序列中 经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其片段具有相同或相似活性； (2) 其中所述轻链的可变区序列为：在所述轻链的可变区序列即SEQ ID NO :11序列中 经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其片段具有相同或相似活性； (3) 其中所述重链的恒定区序列为：在所述重链的恒定区序列即SEQ ID NO :13序列中 经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其片段具有相同或相似活性； (4) 其中所述轻链的恒定区序列为：在所述轻链的恒定区序列即SEQ ID NO :12序列中 经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其片段具有相同或相似活性。2. 权利要求1的全人源抗RANKL抗体或其片段，其包含如SEQ ID NO :1所示的重链以 及如SEQ ID NO :5所示的轻链。3. 权利要求1的全人源抗RANKL抗体或其片段，其包含如SEQ ID NO :3所示的重链以 及如SEQ ID NO :7所示的轻链。4. 分离的核酸分子，其编码权利要求1-3任一项的全人源抗RANKL抗体或其片段。5. 权利要求4的核酸分子，其包含如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4所示的重链以及如 SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO :8 所示的轻链。6. 权利要求5的核酸分子，其包含如SEQ ID NO :2所示的重链以及如SEQ ID NO :6所 示的轻链。7. 权利要求5的核酸分子，其包含如SEQ ID NO :4所示的重链以及如SEQ ID NO :8所 示的轻链。8. 重组载体，其含有权利要求4-7任一项的核酸分子。9. 重组细胞，其含有权利要求4-7任一项的核酸分子或者权利要求8的重组载体。10. 组合物，其含有权利要求1-3任一项的全人源抗RANKL抗体或其片段、权利要求 4-7任一项的核酸分子、权利要求8的重组载体或权利要求9的重组细胞，以及药学上可接 受的载体或赋形剂。11. 权利要求10的组合物，其还含有至少一种治疗炎症或免疫疾病的治疗剂。12. 权利要求11的组合物，其中所述治疗剂选自COXl和C0X2抑制剂、泼尼松龙、甲氨 蝶呤、氯喹、环孢菌素。13. 权利要求1-3任一项的全人源抗RANKL抗体或其片段、权利要求4-7任一项的核酸 分子、权利要求8的重组载体或权利要求9的重组细胞在制备用于预防或治疗与骨损失相 关疾病的药物中的用途。14. 权利要求13的用途，其中所述与骨损失相关疾病包括：骨质疏松、关节炎骨溶解破 坏、恶性肿瘤或恶性肿瘤骨转移、佩吉特骨病（畸形性骨炎）、伴随骨破坏的炎症（例如骨髓 炎）、伴随骨破坏的自身免疫性疾病或类风湿性关节炎、高钙血症、骨坏死、骨质稀少。15. 权利要求14的用途，其中所述恶性肿瘤包括：乳腺癌，前列腺癌，甲状腺癌，肾癌， 肺癌，皮肤癌，食道癌，直肠癌，膀胱癌，子宫颈癌，卵巢癌、肝癌、胃肠道癌、多发性骨髓瘤和 淋巴瘤（何杰金氏病）。16. 权利要求14的用途，其中所述骨质疏松包括原发性骨质疏松，内分泌骨质疏松（包 括但不限于甲状腺功能亢进，甲状旁腺功能亢进，库欣综合征，肢端肥大症），骨质疏松的遗 传和先天形式（包括但不限于成骨不全，高胱氨酸尿症，门克斯综合征，赖-戴综合征），和 由于肢端固定的骨质疏松。17. 权利要求1-3任一项的全人源抗RANKL抗体或其片段、权利要求4-7任一项的核酸 分子、权利要求8的重组载体或权利要求9的重组细胞在制备作为RANKL抑制剂的药物中 的用途。18. 检测试剂或试剂盒，其含有权利要求1-3任一项的抗体或其片段； 优选地，所述抗体或其抗原结合部分还可包含可检测的标记；或者 优选地，所述检测试剂或试剂盒还可包含第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原 结合部分；或者 优选地，所述第二抗体还可包含可检测的标记。19. 权利要求1-3任一项的抗体或其片段在制备检测试剂或试剂盒中的用途，其中所 述检测试剂或试剂盒用于检测核因子K-B受体活化因子配体，或者用于诊断核因子K-B 受体活化因子配体相关疾病。
【专利摘要】本发明涉及全人源化抗体，具体地，本发明涉及全人源抗RANKL抗体，编码该抗体的核酸分子以及包含该抗体的组合物，本发明还涉及所述抗体在制备用于防治与骨损失相关疾病特别是骨质疏松、关节炎骨溶解破坏或肿瘤骨转移等疾病的药物中的用途。本发明的抗体在保持与人RANKL特异结合，并阻断其活性的同时，降低了其对人体潜在的免疫抑制性，同时具有更好的稳定性，避免了IgG2抗体生产的不均一性(异质性)给批次质量鉴定带来的弊端。
【IPC分类】A61K39/395, C12N15/70, G01N33/68, C12N15/13, C07K16/28, A61P19/02, A61P29/00, A61P37/00, A61P35/00, A61P19/08, C12N1/21, A61K48/00, A61P19/10
【公开号】CN105085679
【申请号】CN201410168618
【发明人】刘劼
【申请人】上海津曼特生物科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年4月25日