W.，ed?，第 2 版，RavenPress,N. Y. (1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完 整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab'、 ?(&13'）2、？(1、？1(^13和互补决定区〇：〇1?)片段、单链抗体（例如， 8(^0、嵌合抗体、双抗体 (diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
[0049] 在本发明中，术语"Fd片段"意指由Vh和ChI结构域组成的抗体片段；术语"Fv片 段"意指由抗体的单臂的\和Vh结构域组成的抗体片段；术语"dAb片段"意指由Vh结构域 组成的抗体片段（Ward等人，Nature341:544-546 (1989));术语"Fab片段"意指由\、VH、 Q和ChI结构域组成的抗体片段；术语"F(ab'）2片段"意指包含通过铰链区上的二硫桥连 接的两个Fab片段的抗体片段。
[0050] 在一些情况下，抗体的片段是单链抗体（例如，scFv)，其中\和Vh结 构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子（参见，例 如，Bird等人，Science242:423-426 (1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA85:5879-5883 (1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-\-接头-Vh-COOH或 NH2-Vh-接头-\-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例 如，可使用具有氨基酸序列（GGGGS)4的接头，但也可使用其变体（Holliger等人（1993)， Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人 (1995)，ProteinEng. 8:725-731，Choi等人（2001)，Eur.J.Immunol. 31:94-106,Hu等人 (1996)，CancerRes. 56:3055-3061，Kipriyanov等人（1999)，J.Mol.Biol. 293:41-56 和 Roovers等人（2001)，CancerImmunol.描述。
[0051] 在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中VjP\结构域在单个多 肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从 而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位（参见，例 如，HolligerP?等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448 (1993)，和PoljakR.J?等 人，Structure〗： 1121-1123(1994))。
[0052] 可使用本领域技术人员已知的常规技术（例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂 法）从给定的抗体（例如单克隆抗体BA05-UBA05-2)获得抗体的上述片段，并且以与对于 完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的片段。
[0053] 在本发明中，所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述表达载体例如为原核表 达载体，真核表达载体，噬菌体载体或病毒载体，均为本领域常用的载体。其中所述原核 表达载体例如为PET28a、pGEMExl、pGEM7ZF(+)或pBAD24等，所述真核表达载体例如为 pBudCE4.l、pcDNA3.l、pCMV-Tag2B或pGL3basic等，在本发明的实施方案中，所述真核表达 载体为pcDNA3. 1，所述病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。
[0054] 在本发明中，所述细胞可以为原核细胞或真核细胞。所述真核细胞例如为哺乳动 物细胞。所述细胞可以通过向原核细胞或真核细胞中引入/转染上述的核酸分子或载体而 得到。
[0055] 在本发明中，所述原核细胞例如可以为大肠杆菌，所述真核细胞例如可以为酵母 细胞、昆虫细胞（如Sf21)、哺乳动物细胞，所述哺乳动物例如可以为NSO细胞、CHO细胞、 293细胞。在本发明的一个实施方案中，所述细胞为真核细胞。在本发明的一个实施方案 中，所述真核细胞为293F细胞。
[0056] 在本发明中，可以利用本领域所知的任何种类的转染方法获得转染有特定核酸或 载体的宿主细胞。例如，可通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中。或者，可使用脂转染 试剂如FuGENE6、X-tremeGENE和LipofectAmine。或者，可通过基于逆转录病毒、慢病毒、 腺病毒和腺相关病毒的适当病毒载体将核酸引入细胞中。
[0057] 在本发明中，所述骨质疏松包括但不限于原发性骨质疏松，内分泌骨质疏松（包 括但不限于甲状腺功能亢进，甲状旁腺功能亢进，库欣综合征，肢端肥大症），骨质疏松的遗 传和先天形式（包括但不限于成骨不全，高胱氨酸尿症，门克斯综合征，赖-戴综合征），和 由于肢端固定的骨质疏松。
[0058] 在本发明中，所述恶性肿瘤包括但不限于乳腺癌，前列腺癌，甲状腺癌，肾癌，肺 癌，食道癌，直肠癌，膀胱癌，子宫颈癌，卵巢癌、肝癌、胃肠道癌、多发性骨髓瘤和淋巴瘤 (何杰金氏病）。
[0059] 本发明提供了结构不同于denosumab的新的抗RANKL抗体。
[0060] 在本发明的一些实施方案中,本发明构建了来源于denosumab的突变体库并将其 表达在酵母表面展示系统上，使用RANKL作为靶标，在体外进行两轮筛选，选择具有更低的Kd和更长的解离半衰期的抗RANKL抗体突变体，选择的变体在稳定性测试和特征分析以后 用合适的IgG4骨架转化为全抗体。
[0061] 在本发明的一些实施方案中，本发明的抗RANKL抗体及其片段作为破骨细胞分化 和成熟的抑制剂，与RANKL有很强的亲和力，能够阻断RANKL与RANKL受体结合。
[0062] 在本发明的一些实施方案中，本发明的抗RANKL抗体及其片段对T细胞和B细胞 功能影响较小，因此有较小的免疫抑制作用和更好的安全窗，可以预期在恶性肿瘤或恶性 肿瘤骨转移上，有更好的临床应用前景。
[0063] 在本发明的一些实施方案中，本发明的抗体及其片段具有更好的均一性和稳定 性，避免了IgG2抗体生产的不均一性（异质性）给批次质量鉴定带来的弊端。
【附图说明】
[0064] 图1抗体BA05-1和BA05-2与RANKL的结合
[0065] 图2抗体BA05-1和BA05-2抑制RANKL与它的同源受体RANK结合的能力
[0066] 图3抗RANKL抗体对RANKL诱导的破骨细胞分化的抑制作用
[0067] 图4抗体BA05-1和BA05-2对外周血单个核细胞（PBMC)的TNFa和IL-6释放的 作用
[0068] 图5抗体BA05-1和BA05-2对PBMC培养物中RANKL阳性T细胞的作用
[0069] 图6单剂量BA05-1和BA05-2抗体对食蟹猴CTX-I的体内抑制作用
[0070] 图7单剂量BA05-1和BA05-2抗体对食蟹猴TRACP-5B的体内抑制作用
[0071] 图8抗体BA05-1和BA05-2的血清稳定性（其中纵坐标表示完整、无降解的抗体）
【具体实施方式】
[0072] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0073] 本发明构建了含有Denosumab的CDR区随机突变序列的肽库，并将其展示在酵母 细胞表面，库容量约为lxlO7,使用RANKL作为靶标，利用流式细胞术在体外进行两轮筛选， 选择具有更低的Kd和更长的解离半衰期的抗RANKL抗体突变体。以下实施例中即采用该 库进行筛选。
[0074] 其中的靶标RANKL为RANKL的ECD结构域，购自R/DSystems(货号 390-TN-010)。
[0075] 实施例I:BA05-1和BA05-2抗体序列的设计和表达
[0076] 以下为AMG162的重链可变区的序列：
[0103] 编码BA05-1和BA05-2的重链恒定区（HC)和轻链恒定区（LC)的DNA由IDT(USA) 合成。为了表达抗RANKL抗体，将VK片段克隆入含有人CK片段的pcDNA3. 1载体 (Invitrogen)的HindIII和NheI位点，将VH片段克隆入含有人IgG4CH片段的pcDNA3.1 载体（Invitrogen)的HindIII和BsiWI位点。其中含有人CK片段的pcDNA3. 1载体和 含有人IgG4CH片段的pcDNA3. 1载体由本发明人构建（其中的CK片段和CH片段的序列为 前述DNA序列中的一部分）。
[0104] 再次经过DH5a细菌转化，质粒提取和测序确定阳性克隆。测序结果与记录 的抗体的编码序列一致。为表达重组BA05-1和BA05-2,分别将BA05-1和BA05-2轻 链和重链质粒共转染至293-F细胞（293fectin,购自Invitrogen公司）中，采用 FreeStyle?293Expression培养基（购自Invitrogen公司）、100ml培养瓶培养转染后 的细胞5天，离心、0.22um膜过滤后收集培养上清，采用ProteinA柱（5mlMabSelect 预装柱，购自GEBiosciences公司）纯化，用10个柱体积平衡缓冲液（20mM磷酸缓冲， 150mMNaCl，pH7. 0)后，2ml/分钟的流速将过滤后上清上柱，冲洗10个柱体积后，用洗脱缓 冲液（IOmM柠檬酸钠，pH3. 5)洗脱5个柱体积，将洗脱的抗体采用IMTrisHCl，pH8. 0中和 pH至6. 5,然后透析纯化后的抗体至PBS中，用紫外法（280nm波长）测定抗体浓度，测定抗 体纯度。
[0105] 本发明采用本领域普通技术人员熟知的基因工程的方法制备目的全人源抗体，本 实施例中仅描述采用通过293-F细胞瞬时表达、获得分析检定用抗体样品的方法，然而，本 领域技术人员也可以通过细菌、酵母、病毒和其它真核细胞表达系统来，如中华卵巢仓鼠 细胞（CHO)稳定细胞系，来制备、生产本发明的全人源抗体。
[0106] 实施例3 :流式细胞仪检测BA05-landBA05-2抗体对RANKL的结合
[0107] 通过流式细胞术检测抗RANKL抗体BA05-landBA05-2与RANKL(全长RANKL) 转染293细胞（Invitrogen)表面RANKL的结合。293-RANKL转染细胞与不同浓度的 抗RANKL抗体BA05-1、BA05-2、AMG162在4°C孵育lh。用PBS洗涤细胞，并且加入抗人 IgG(H+L)-PE(l:200)/抗人IgG-R-PE(I=1000 )抗体 4°C孵育 30min。用PBS洗涤后，将细 胞重悬于ImlPBS中，然后用流式细胞仪（BDFACScan)进行分析。如图1所