Lxr激动剂用于治疗骨关节炎的用途的制作方法

专利名称：Lxr激动剂用于治疗骨关节炎的用途的制作方法
LXR激动剂用于治疗骨关节炎的用途 发明领域
本发明涉及采用LXR激动剂治疗或预防骨关节炎的方法。
背景技术：
骨关节炎也称为退行性关节病，它的特征在于关节软骨的退化和软 骨下骨的增殖和重塑。通常的症状是僵硬、活动受限和疼痛。骨关节炎 是关节炎最常见的形式，并且患病率随年龄明显增加。
现有的骨关节炎治疗方法包括运动、药物、休息和关节保健、手术、 疼痛緩解技术、替代治疗和体重控制。治疗骨关节炎中常用的药物包括 非甾族抗炎药(NSAID)如阿司匹林、布洛芬、萘普生钠、酮洛芬；直接 用于皮肤的局部疼痛緩解乳膏、橡胶和喷雾剂(例如辣椒碱乳膏)；通常 注射到受影响的关节以暂时緩解疼痛的皮质类固醇；和透明质酸。可进 行手术以使骨表面重建(平滑化)、骨复位和置换关节。尽管各种药物疗 法已被用于治疗疾病，但是它们对长期控制和预防是无效的。
最初从肝鉴定为孤儿受体的肝X受体(LXR)是核激素受体超家族的 成员，并且已发现它是巨噬细胞炎性基因表达的负调节物(参见公布的美 国专利申请第2004/0259948号；Joseph SB等人，Nat. Med. 9:213-19(2003))。 LXR是配体活化的转录因子并作为与类视黄醇X受体 的专性异二聚体与DNA结合。尽管LXR(x限于某些组织如肝、肾、脂 肪、肠和巨噬细胞，但是LXR卩展示了遍在的组织分布模式。通过巨噬 细胞中的羟胆固醇(内源性配体)的LXR活化引起涉及脂质代谢和胆固醇 逆向转运的几种基因(包括ABCA1、 ABCG1和载脂蛋白E)的表达。
发明概述
一个方面涉及用于治疗患有骨关节炎的哺乳动物的方法，其包括向 需要这种治疗的哺乳动物给药LXR反应性的基因表达诱导量的LXR激动剂。
另一个方面涉及诱导载脂蛋白D在具有骨关节炎软骨的哺乳动物 中的表达的方法，其包括向需要这种诱导的哺乳动物给药有效量的LXR;敫动剂。
一个进一步的方面涉及预防骨关节炎的方法，其包括(a)测定在 受治疗者的正常软骨中的基线载脂蛋白D的表达水平；以及(b)通过用 LXR激动剂治疗来保持受治疗者的软骨中的基线载脂蛋白D的表达水 平。
一个另外的方面涉及治疗患有骨关节炎的哺乳动物的方法，其包括 向需要这种治疗的哺乳动物给药聚集蛋白聚糖酶活性抑制量的LXR激 动剂。
一个进一步的方面涉及抑制具有骨关节炎软骨的哺乳动物中聚集 蛋白聚糖酶的活性的方法，其包括向需要这种抑制的哺乳动物给药有效 量的LXR激动剂。
另 一个方面涉及治疗患有骨关节炎的哺乳动物的方法，其包括向需 要这种治疗的哺乳动物给药有效量的LXR激动剂以抑制促炎性细胞因 子在骨关节炎损伤中的精制(elaboration)。
一个另外的方面涉及检测受治疗者中的骨关节炎表型的方法，其包 括(a)测定正常软骨中的基线载脂蛋白D的表达水平；(b)从疑似患 有骨关节炎的受治疗者中获得软骨样品；以及(c)检测载脂蛋白D在所 述样品中的表达水平；其中与基线载脂蛋白D表达相比，在所述样品中 的更低量的载脂蛋白D表达指示骨关节炎。
一个进 一 步的方面涉及筌定能减少软骨中的骨关节炎效应的LXR 配体的方法，其包括(a)提供包含LXR的样品；(b)使所述样品与测 试化合物接触；以及(c)测定所述测试化合物是否诱导载脂蛋白D的表 达、抑制聚集蛋白聚糖酶活性、抑制促炎性细胞因子的精制、或它们的 组合。
本发明的其他方面和优点对参考下文紧跟的详述后的本领域技术 人员而言变得显然。
附图简述


图1A是显示了在患有重度骨关节炎(OA)的软骨中核受体(NR)表达 的相对表达水平的柱状图。图IB是显示了在患有重度OA的软骨中类 视黄醇受体表达的相对表达水平的柱状图。
图2A是显示了正常软骨和在患有轻度OA与重度OA的软骨中
5ApoD表达的柱状图。疾病严重度是通过检查软骨样本中损伤的大小和
深度来宏观评价的。图2B是显示在正常软骨和患有轻度OA与重度OA 的软骨中的TNFa表达的柱状图。
图3是显示在细胞因子诱导的人OA软骨外植体中的蛋白聚糖降解 /释放被LXR激动剂抑制并且在这些外植体中细胞因子诱导的总蛋白聚 糖含量减少一皮LXR激动剂预防的柱状图。
图4A是显示使用BC-3抗体的聚集蛋白聚糖酶产生的聚蛋白多糖新 表位的蛋白质印迹，BC-3抗体识别聚集蛋白聚糖酶产生的聚蛋白多糖分 解产物的N-末端。使用来自患有终末期OA的两位人供体(关节置换手 术后)的软骨外植体。供体#259是57岁男性患者，而供体#261是55岁 女性患者。泳道l、 5:载体。泳道2、 6: TO卯1317 (2 ^M)。泳道3、 7: IL隱1卩+抑瘤素M(OSM)(各为10 ng/ml)。泳道4、 8: IL-1卩+ OSM + TO901317。图4B是使用AGEG抗体显示聚集蛋白聚糖酶产生的聚蛋白 多糖新表位的蛋白质印迹，AGEG抗体识别聚集蛋白聚糖酶产生的聚蛋 白多糖分解产物的不同表位。泳道l、 5:载体。泳道2、 6: TO9013H(2 pM)。泳道3、 7: IL-l卩+ OSM(各为10 ng/ml)。泳道4、 8: IL-l卩+ OSM + TO901317。
图5A是显示通过LXR激动剂抑制从细胞因子治疗的人软骨外植体 中的总前列腺素E2(PGE2)生产的柱状图。图5B比较用载体对照或LXR 激动剂GW3965(2(iM)处理21天的外植体中呈膜磷脂PC和PE的形式的 花生四烯酸的量。来自2位人OA供体的软骨样品被用于这项研究。
发明详述
步，当数量、浓度、其他值或参数以范围、:选范围或一1列高优选值 和低优选值给出时，这应理解为明确公开了由任何范围上限值或优选值 和任何范围下限值或优选值的任 一对形成的所有范围，无论范围是否单 独公开。当在此引用数值的范围时，除非另有说明，此范围旨在包括其 端点和在此范围内的所有整数和分数。当限定范围时，并不期望本发明 的范围限制在所引用的特定值。
除非另有说明，本发明的实施使用细胞生物学、细胞培养、分子生 物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这
6些技术在本领域的技术内。这些技术在文献中被充分解释。例如，参见
Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子克隆实-险室手册)，第2 版，Sambrook, Fritsch和Maniatis编,(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Clonmg(DNA克隆)，巻I和II (D. N. Glover编，1985); Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M. J. Gait编，1984);美国专利 第4,683,195号；Nucleic Acid Hybndization(核酸杂交)(B. D. Hames & S. J. Higgms编1984); Transcription and Translation(摔争录和翻i奪)(B. D. Hames & S. J. Higgins编1984); Culture of Animal Cells(动物细胞的培 养)(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes(固定化细胞和酶)(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆的实践指南)(1984) ; Methods m Enzymology(酶学方法)(Academic Press, Inc.， N.Y.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(哺乳动物细胞的基因转移载体)(J. H. Miller 矛口 M. P. Calos编，1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology(酶学方法)，巻154和155(Wu等人编)，Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (细胞和分子生物学的免疫化学方 法)(Mayer和Walker编，Academic Press, London, 1987); Handbook of Experimental Immunology(实验免疫学手册)，巻I-IV(D. M. Weir和C. C. Blackwell编，1986); Manipulating the Mouse Embryo(小鼠胚胎操作)(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986》
此处，申请人显示LXRa和LXRp(肝X受体a和p)在正常软骨、中 度骨关节炎软骨和重度骨关节炎软骨中表达。申请人还首次证明了骨关 节炎中可能的脂质缺损，因为在正常软骨中以很高水平表达的载脂蛋白 D(ApoD)的表达在中度和重度骨关节炎软骨中急剧向下调节。LXR配体 经由存在于ApoD启动子区的LXR反应元件诱导ApoD的表达。与表达 数据一致，当与正常软骨比较时，前载脂蛋白D的蛋白质水平在骨关节 炎软骨样品中也减少。因为ApoD是脂质(花生四烯酸和胆固醇)结合蛋 白，所以其在骨关节炎软骨中的减少可解释在骨关节炎软骨中观察到的 增加的脂质水平。期望在软骨中增加的花生四烯酸使得炎症的脂质介质 (PGE2、白三烯及类似物)在患病组织中的水平增加。骨关节炎软骨还显 示软骨降解酶(聚集蛋白聚糖酶和金属蛋白酶)的活性增加。
申请人还第一次表明LXR配体抑制聚集蛋白聚糖酶在人骨关节炎关节软骨组织外植体中的活性。LXR配体还抑制TNFa和许多种其他促 炎性细胞因子的表达。因此，通过使脂质缺陷正常化、抑制聚集蛋白聚 糖酶/金属蛋白酶的表达和/或活性以及抑制促炎性细胞因子在骨关节炎 损伤中的精制，期望LXR配体在骨关节炎中是治疗有效的，并且比当 前和即将来临的骨关节炎治疗更有效。进一步，LXR配体诱导蛋白质的 c-jun/c-fos家族，因此增加AP1活性，这是软骨生成所需要的。因此，
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I.定义
在本文公开的上下文中，将使用许多个术语。
如本文所用，术语"约"或"近似"表示在给定值或范围的20%内， 优选在10%内，且更优选在5%内。
术语"聚集蛋白聚糖酶活性"是指被与聚蛋白多糖结合的聚集蛋白 聚糖酶阻断或启动的至少一种细胞过程。 一般来说，活性是指通过聚集
蛋白聚糖酶的聚蛋白多糖的蛋白水解断裂。其他聚集蛋白聚糖酶活性包 括但不限于聚集蛋白聚糖酶与聚蛋白多糖的结合和由聚集蛋白聚糖酶 对聚蛋白多糖的结合或断裂引起的生物反应。
术语"细胞因子精制"是指通过软骨组织或软骨细胞生成细胞因子。
本文所用的术语"有效量"、"治疗有效量"、"LXR反应性的基 因表达诱导量，，、"聚集蛋白聚糖酶活性抑制量，，和"有效剂量，，是指 当向需要的哺乳动物给药时对至少部分改善或至少部分预防与骨关节 炎有关的状况有效的效应分子的量。
如本文所用，术语"表达"包括使DNA转录成mRNA并翻译成多 肽或蛋白质的过程。
术语载脂蛋白D(ApoD)表达的"诱导"是指载脂蛋白D mRNA和/ 或蛋白质表达的增加、诱导或者以其它方式的增强。这种增加、诱导或 增强可通过本文所提供的测定法中的一种来测量。载脂蛋白D表达的诱 导并不必然显示载脂蛋白D的最大表达。ApoD表达的增加可以是例如 至少约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或更多。 在一个实施方案中，诱导通过比较正常软骨的ApoDmRNA表达水平和 骨关节炎软骨的ApoD mRNA表达水平来测量。
术语聚集蛋白聚糖酶或聚集蛋白聚糖酶活性的"抑制"是指至少一种聚集蛋白聚糖酶活性的减少、抑制或以其它方式的降低。结合的减少、 抑制或降低可通过本文所提供的测定法中的一种来测量。聚集蛋白聚糖 酶活性的抑制并不必然指示聚集蛋白聚糖酶活性的完全否定。活性的减
少可以是例如至少约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 卯％或更多。在一个实施方案中，抑制通过聚蛋白多糖的分解产物的检 测的减少来测量。
术语促炎性细胞因子的精制的"抑制"是指细胞因子如例如iNOS、 MCP-3、 COX-2、 MIP1卩、MMP画9、 IP画IO、 IL画1卩、IL誦lou G-CSF、 TNFou MCP-1、 IL-6的活性的减少、抑制或以其它方式的降低。细胞因子精制 的减少、抑制或降低可通过本文所提供的测定法中的一种来测量。促炎 性细胞因子精制的抑制并不必然指示促炎性细胞因子精制的完全否定。 精制的减少可以是例如至少约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或更多。在一个实施方案中，抑制通过比较正常软骨的TNFa mRNA表达水平与骨关节炎软骨的TNFa mRNA表达水平来测量。
"肝X受体"或"LXR"是指LXRa和LXR卩两者及其变体、同种 型和活性片段。LXR卩被遍在地表达，而LXRa的表达被限制在肝、肾、 肠、脾、脂肪组织、巨噬细胞、骨骼肌和如本文所证实的软骨。LXRa 序列的代表性GenBank⑧登录号包括下列人(/7omo Mf/^朋，Q13133)、 小鼠(Mws mMscw/ws, Q9Z0Y9)、 大鼠("認i^ "orveg,'cws, Q62685)、 牛(Bos Q5E9B6)、 猪scra/a, AAY43056)、 鸡(G"〃ws ga〃^, AAM卯897)。 LXR卩的代表性GenBank⑧登录号包括下列人(7/omo sa/ /e"s, P55055)、 'J、鼠(A/wa' wwscw/ws, Q60644)、 大鼠(i^3Ztws wo厂veg/cws, Q62755)、牛(Bos town^， Q5BIS6)。
术语"哺乳动物，，是指人、非人灵长类、犬、猫、牛、羊、猪、鼠 或其他兽医或实验室哺乳动物。本领域技术人员认识到，减少一类哺乳 动物中的病理学严重度的治疗预测治疗对另 一 类哺乳动物的效果。
如果这种ApoD调节剂的存在导致ApoD表达的增加或减少，则认为 ApoD调节剂调节ApoD的表达。 II. LXR激动剂
可用于本发明的LXR激动剂包括天然的羟胆固醇、合成的羟胆固 醇、合成的非羟胆固醇和天然的非羟胆固醇。示例性的天然的羟胆固醇包括20(S)羟基胆固醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-羟基胆 固醇、24(S),25-环氧胆固醇和27-羟基胆固醇。示例性的合成的羟胆固醇 包括N,N-二曱基-3p-幾基胆烯酰胺(DMHCA)。示例性的合成的非羟胆固 醇包括N-(2,2,2-三氟乙基)-N-(4-[2,2,2-三氟-l-羟基-l-(三氟甲基)乙基]苯 基)苯磺酰胺(TO901317; Tularik 0901317)、 [3-(3-(2-氯-三氟曱基千基 -2，2-二苯基乙氨基)丙氧基)苯乙酸](GW3965)、 N-曱基-N-[4-(2,2,2-三氟 -1_羟基-1_三氟曱基_1-乙基)_苯基]_苯磺酰胺(丁0314407)、 4,5-二氲 _1_(3_(3_三氟曱基_7_丙基_苯并异嚅唑_6-基氧基)丙基)-2，6-嘧啶二酮、3-氯-4-(3-(7-丙基-3-三氟曱基-6-(4,5)-异嚅唑基)丙硫基)-苯乙酸(F3曱基AA) 和乙酰基-罗汉^^酸二聚体(podocarpic dimer)。示例性的天然的非鞋胆固 醇包括桩蛋白(paxilline)、链甾醇和豆甾醇。
例如，在下列中公开了其他有用的LXR激动剂公布的美国专利 申请第2006/0030612、 2005/0131014、 2005/0036992、 2005/0080111、 2003/0181420 、 2003/0086923 、 2003/0207898 、2004/0110947 、 2004/0087632、 2005/0009837、 2004/0048920和2005/0123580号；美国 专利第6,316，503、 6,828,446、 6,822，120和6,卯0,244号;WO01/41704; Menke JG等人，Endocrinology 143:2548-58(2002); Joseph SB等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:7604-09(2002); Fu X等人，J. Biol. Chem. 276:38378-87 (2001); Schultz JR等人,Genes Dev. 14:2831-38(2000); Sparrow CP等人，J. Biol. Chem. 277:10021-27(2002); Yang C等人，J. Biol. Chem., Manuscript M603781200(July 20, 2006); Bramlett KS等人，J. Pharmacol. Exp. Ther. 307:291-96 (2003); Ondeyka JG等人，J. Antibiot (Tokyo) 58:559-65 (2005)。
III.治疗/预防的方法
根据一种调节方法，通过将细胞与LXR激动剂接触而使LXR活性 在细胞中受到激发。这种LXR激动剂的实例被描述在上面部分II中。 如详细在此描述(部分V),可用于激发LXR活性的其他LXR激动剂可 使用选择用于这种化合物的筛选测定法来鉴定。
调节方法可在体外(例如通过用LXR激动剂培养细胞或通过将LXR 激动剂引入至培养中的细胞)或可选择地体内(例如通过对受治疗者给药 LXR激动剂或通过将LXR激动剂引入至受治疗者的细胞)来进行。为了 实施体外调节方法，可通过标准方法从受治疗者获得细胞并且将其与LXR激动剂在体外一起温育(即培养)以调节细胞中的LXR活性。
1. 预防方法
在一个方面中，本发明提供了通过对受治疗者给药诱导ApoD表达 和/或抑制聚集蛋白聚糖酶活性和/或抑制促炎性细胞因子在骨关节炎损 伤中的精制的LXR激动剂来预防受治疗者骨关节炎的方法。预防性LXR 激动剂的给药可在骨关节炎症状的表现前发生，以使骨关节炎在其进展 中被预防或可选择地延緩。
2. 治疗方法
技术领域：
本发明的另一个方面涉及为了骨关节炎的治疗目的而调节LXR活 性的方法。因此，在示例性的实施方案中，本发明的调节方法包括将细 胞与调节ApoD表达和/或聚集蛋白聚糖酶活性和/或抑制促炎性细胞因 子在骨关节炎损伤中的精制的LXR激动剂接触。这些调节方法可在体 外(例如通过用LXR激动剂培养细胞)或可选4奪地在体内(例如通过对受 治疗者给药LXR激动剂)来进行。照这样，本发明提供了治疗患有骨关 节炎的个体的方法，所述个体将从调节ApoD表达和/或聚集蛋白聚糖酶 活性和/或骨关节炎损伤中的促炎性细胞因子精制中获益。
IV. LXR激动剂的给药
以生物学上相容的形式向受治疗者给药LXR激动剂，所述形式适 于体内药物给药，以增强ApoD表达和/或抑制聚集蛋白聚糖酶活性和/ 或抑制促炎性细胞因子的精制。"适于体内给药的生物学上相容的形 式"表示待给药的LXR激动剂的形式，其中所述激动剂的治疗作用超 出任何毒性作用。预期术语"受治疗者"包括免疫反应可被诱发的活生 物体，例如哺乳动物。如本文所述的LXR激动剂的给药可以是任何药 理学的形式，所述形式包括单独或与药学上可接受的载体组合的治疗有 效量的LXR激动剂。
LXR激动剂的治疗有效量可随各因素如疾病状态、年龄、性别和个 体的重量和LXR激动剂在个体中诱发期望反应的能力而改变。可调整 剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，几个分开的剂量可每天被给药， 或如由治疗情况的紧急事件所示的，所述剂量可被按比例地减少。
本发明的治疗组合物或药物组合物可通过任何适合的本领域已知 途径，包括如口服、静脉内、皮下、肌内、透皮、鞘内或脑内给药或在 体外治疗方案中给药至细胞。给药可以是快速的(如通过注射)或经历一段时间(如通过緩慢输注或给药緩慢释放制剂)。为了治疗或预防骨 关节炎，本发明的治疗组合物或药物组合物的给药可例如通过口服给药 或通过关节内注射来进行。
此外，LXR激动剂可与聚合物如聚乙二醇稳定地连接以获得期望 的溶解度性质、稳定性、半衰期和其他药学上有利的性质(例如，参见
Davis等人，Enzyme Eng. 4:169-73 (1978); Burnham NL, Am. J. Hosp. Pharm. 51:210-18 (1994》。
LXR激动剂可以在有助于递送到细胞胞浆的组合物中。例如，LXR 激动剂可与载体部分如能递送所述激动剂到细胞胞浆的脂质体轭合。这 种方法在本领域中众所周知(例如，参见Amselem S等人，Chem. Phys. Lipids 64:219-37 (1993))。此外，LXR激动剂可通过显孩"主射^皮直4妻递送 至细月包。
LXR激动剂可以以药物制品的形式^L使用。这种制品以药物领域众 所周知的方法来制备。 一种优选的制品使用生理盐水溶液的运载体，但 是期望还可使用其他药学上可接受的载体如生理浓度的其他无毒盐、5% 葡萄糖水溶液、无菌水或类似物。本文所用的"药学上可接受的载体" 包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和 吸收延迟剂及类似物。这种介质和试剂用于药学上活性的物质的用途在 本领域中众所周知。除任何常规介质或试剂与LXR激动剂不相容的情 况之外，包括它们在治疗组合物中的使用。补充的活性化合物也可被掺 入所述组合物中。还可期望合适的緩沖液存在于所述组合物中。如需要， 这种溶液可净皮冻干并贮藏在无菌安4瓦中，以待通过添加用于备注射的无 菌水而重建。主要溶剂可以是水性的或可选择地非水性的。LXR激动剂 还可被掺入可植入到需要治疗的组织的固体或半固体生物相容性基质 中。
所述载体还可包含用于调节或保持制剂的pH、渗克分子浓度 (osmolarity)、粘度、透明度、颜色、无菌、稳定性、溶出速率或气味的 其他药学上可接受的赋形剂。
剂量给药可根据剂量制剂的药代动力学参数和所用的给药途径来 重复。
还提供了可口服给药的包含LXR激动剂的某些制剂。这些制剂优 选用适合载体包封并配制成固体剂型。适合载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、 磷酸钙、藻酸盐、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、明 胶、糖浆、曱基纤维素、羟基苯曱酸曱酯和羟基苯曱酸丙酯、滑石、镁、 硬脂酸酯、水、矿物油和类似物。所述制剂可另外包括润滑剂、润湿剂、 乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或调味剂。所述组合物可配制以在通过 使用本领域众所周知的程序对患者给药后提供活性成分的快速释放、持 续释放或延迟释放。所述制剂还可包含减少蛋白水解降解的物质和/或促 进吸收的物质如表面活性剂。
为了给药方便和剂量均匀，配制以剂量单位形式的组合物是尤其有 利的。本文所用的剂量单位形式是指以单剂量适用于待治疗的哺乳动物
受治疗者的物理上分立的单位；每个单位包含与需要的药物载体结合
的、计算为产生预期治疗效应的预定量的活性化合物。本发明的剂量单
位形式的规才各由下述确定并且直接取决于下述(a) LXR激动剂的独特 性质和要达到的具体治疗效果以及(b)在配制(compound)这种用于治疗
由本领域普通技术人员容易地计算，例如根据患者的大约体重或体表面 积或者待占据的身体空间的体积。所述剂量还可根据所选的具体给药途 径来计算。对测定用于治疗的适合剂量所必需的计算的进一步细化由本 领域普通技术人员常规地进行。这种计算可依据靶细胞的测定制品中的 本文所公开的LXR激动剂活性由本领域技术人员在没有过多实验的情 况下来进行。准确剂量是结合标准剂量响应研究而一皮确定的。应理解， 实际所给药的组合物的量可依据包括待治疗的状况、待给药的组合物的 选择、个体患者的年龄、重量和反应、患者症状的严重度和所选的给药 途径的有关情况由医生确定。
这种LXR激动剂的毒性和治疗效力可通过标准药学程序在例如用 于测定LD5。(50。/。种群致死的剂量)和ED5o(在50%种群中治疗有效的剂 量)中的细胞培养物或实验动物中测定。毒性和疗效之间的剂量比是治疗 指数并且它可被表示为LDWED5()比。优选显示大治疗指数的LXR激动 剂。尽管可使用显示毒副作用的LXR激动剂，但是应该小心设计将这 种激动剂靶向到受影响组织的部位以使对未感染细胞的潜在性损伤降 至最低因而减少副作用的递送系统。
从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可被用于配制用于人的一系列剂量。这种LXR激动剂的剂量优选在极少毒性或无毒的包括ED50 的循环浓度范围内。所述剂量可根据所用的剂型和所用的给药途径在此 范围内变化。对于用于本发明方法的任何LXR激动剂，治疗有效的剂 量最初可从细胞培养测定中评价。可在动物^t型中制定剂量以达到包括 如在细胞培养物中测定的IC5。(即实现症状的半数最大抑制的LXR激动 剂浓度)的循环血浆浓度范围。这种信息可用于更准确地确定可用在人中 的剂量。在血浆中的水平可例如通过高效液相色谱法来测量。
监测LXR激动剂对ApoD的表达和/或聚集蛋白聚糖酶的活性和/或 促炎性细胞因子的精制的影响不仅可应用于基本药物筛选，而且应用于 临床试验。例如，LXR激动剂的有效性可在显示ApoD基因表达在软骨 细胞中减少和/或聚集蛋白聚糖酶活性增加和/或促炎性细胞因子在骨关 节炎损伤中的精制增加的受治疗者的临床试验中监测。在这些临床试验 中，ApoD的表达和/或聚集蛋白聚糖酶的活性和/或促炎性细胞因子的精 制可用作不同骨关节炎阶段的表型的"读出"或标志。
因此，例如为了在临床试验中研究LXR激动剂对骨关节炎的作用， 可分离细胞，制备RNA,并分析ApoD和涉及骨关节炎的其他基因(例 如TNFa)表达的水平。基因表达的水平(即基因表达谱)可通过RNA印迹 分析或RT-PCR、通过测量所产生的蛋白质的量、或通过测量ApoD或 其他基因的活性水平来定量，全部通过本领域普通技术人员众所周知的 方法进行。以这种方式，基因表达"i普可用作指示细胞对LXR激动剂的 生理反应的标志。因此，这种反应状态可在用LXR激动剂治疗个体前 以及在用LXR激动剂治疗个体期间的不同点测定。
本发明还提供了监测用LXR激动剂治疗受治疗者的有效性的方法， 其包括以下步骤(i)在给药LXR激动剂前从受治疗者中获得给药前的 样品；(ii)在给药的前样品中检测ApoD表达的水平和/或聚集蛋白聚糖 酶活性的水平和/或促炎性细胞因子精制的水平；(iii)从所述受治疗者中 获得一种或多种给药后的样品；(iv)在给药后的样品中检测ApoD表达 或活性的水平和/或聚集蛋白聚糖酶活性的水平和/或促炎性细胞因子精 制的水平；(v)将在给药前的样品中的ApoD表达的水平和/或聚集蛋白 聚糖酶活性的水平和/或促炎性细胞因子精制的水平与在给药后样品中 的ApoD表达和/或聚集蛋白聚糖酶活性和/或促炎性细胞因子精制的水 平比较；以及(vi)相应地改变LXR激动剂向所述受治疗者的给药。例
14如，期望增加的LXR激动剂给药，以使ApoD表达增加至比已检测水平 更高的水平和/或使聚集蛋白聚糖酶活性减小至比已检测水平更低的水 平和/或使促炎性细胞因子精制减小至比已检测水平更低的水平，即增加 LXR激动剂的有效性。可选择地，期望减少的LXR激动剂给药，以使 ApoD表达或活性减小至比已检测水平或活性更低的水平和/或使聚集蛋 白聚糖酶活性增加至比已检测水平更高的水平和/或使促炎性细胞因子 精制增加至比已检测水平更高的水平，即减少LXR激动剂的有效性。 根据这样的实施方案，ApoD表达和/或聚集蛋白聚糖酶活性和/或促炎性 细胞因子精制可用作LXR激动剂甚至在缺乏可观测的表型反应中有效 的指示剂。
此外，在骨关节炎的治疗中，包含LXR激动剂的组合物可^皮外源 性给药，并且期望它有可能在血清中、在任何期望的组织室中和/或在受 影响的组织中实现LXR激动剂的某些耙水平。因此，能监测LXR激动 剂在患者中或在包括获自患者的组织活检样品的生物样品中的水平是 有利的，并且在某些情况下，还监测ApoD表达和/或聚集蛋白聚糖酶活 性和/或促炎性细胞因子精制的水平。因此，本发明还提供了用于在患者 的样品中检测LXR激动剂的存在的方法。
V. 筛选测定法
在一个实施方案中，LXR反应性基因的表达水平或由此的蛋白活性 水平可用于促进通过基于LXR的机理治疗骨关节炎的化合物的设计和/ 或鉴定。因此，本发明提供用于鉴定例如对ApoD表达和/或聚集蛋白聚 糖酶活性和/或细胞因子精制具有激发或抑制作用的调节剂即LXR激动 剂的方法(本文也称为"筛选测定法")。如此所鉴定的化合物可用于治 疗如本文别处所述的骨关节炎。
测试化合物例如可使用本领域已知的组合文库法中的很多方法中 的任一种来获得，所述组合文库法包括空间可寻址平行固相或液相文 库；需要去巻积的合成文库法；'一珠一化合物'文库法；和使用亲和 色"i普筛选的合成文库法。
用于合成分子文库的方法的实例可在例如下述中发现DeWitt SH 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909-13(1993); Erb E等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-26(1994); Zuckermann RN等人，J. Med. Chem. 37:2678-85(1994); Cho CY等人，Science 261:1303-05(1993);
15Carrell等人，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059(1994); Carrell等人, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061(1994); Gallop MA等人,J. Med. Chem. 37:1233-51 (1994)。
化合物文库可以以溶液(例如Houghten RA等人，Biotechniques 13:412-21(1992))或以珠(Houghten RA等人，Nature 354:82-84(1991))、芯 片(FodorSA等人，Nature 364:555-56(1993))、细菌(美国专利第5,223,409 号)、孢子(美国专利第5,223,409号)、质粒(Cu11 MG等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-69(1992))或噬菌体(Scott JK & Smith GP, Science 249:386-90(1990); Devlin JJ等人，Science 249:404-06(1990); Cwirla SE 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-82(1990); Felici F等人，J. Mol. Biol. 222:301-10 (1991);美国专利第5,223,409号)提供。
示例性筛选测定法是基于细胞的测定法，其中使表达LXR的细胞 与测试化合物接触，测试化合物能够通过基于LXR的机理调节ApoD表 达和/或聚集蛋白聚糖酶活性和/或细胞因子的精制。测定调节ApoD表 达和/或聚集蛋白聚糖酶活性和/或细胞因子精制的测试化合物的能力可 通过监测例如DNA、 mRNA或蛋白水平、或通过测量ApoD、聚集蛋白 聚糖酶和/或TNFa的活性水平来完成，全部通过本领域普通技术人员众 所周知的方法进4于。所述细^^例如可以是哺乳动物源例如人的。
由上述筛选测定法鉴定的新型调节剂可用于本文所述的治疗。
实施例
进一步在下述实施例中定义本发明。应理解，这些实施例尽管指示 本发明的优选实施方案，但是它们仅以举例说明的方式给出。从上文详 述和这些实施例中，本领域技术人员可确定本发明的优选特征，并且在 不偏离本发明的精神和范围下，可对本发明作出各种变化和调整以使其 适应于各种用途和条件。
实施例1
为了鉴定在关节炎或正常关节软骨中表达的转录，从末期膝关节置 换的关节炎患者和非关节炎截肢个体中获得组织样品。通过组织学确认 关节炎的存在或缺乏。
将人基因组U95Av2(HG-U95Av2) GeneChip 阵列(Affymetrix， Santa Clara, CA)用于表达特征。HG-U95Av2芯片包含表示得自人基因组的 12,000初级全长序列( 16探针对/序列)的25聚体寡核苷酸探针。对 于设计以与耙序列完全互补的每个探针，产生除其中心的单碱基错配之 外相同的配偶体探针。这些探针对允许对信号进行定量并且减去非特异 性噪音。
从个体关节软骨组织中提取RNA,将其转化为生物素化的cRNA, 并根据Affymetrix方案片段化。将片段化的cRNA在含有100 )ig/ml绅 鱼精DNA和500昭/ml乙酰化的BSA的lx MES緩冲液中稀释并在99 。C下变性5分钟，之后直接在45。C下变性5分钟。通过短暂离心将不溶 性材料从杂交混合物中移出，将杂交混合物加至每个阵列并于45。C在伴 有60 rpm的连续旋转下孵化16小时。孵化后，移出杂交混合物并将芯 片用6x SSPET充分洗涤，如在Affymetrix方案中所述用SAPE溶液染 色。
用Hewlett-Packard基因阵列扫描仪以6 mm的分辨率测量每个转录 物的原荧光强度值。使用测定基因是"存在"还是"缺失"的算法的 GeneChip 软件3.2(Affymetrix)、以及阵列上每个基因的特异性杂交强 度值或"平均差"来评价荧光数据。参照已知丰度的11个对照转录物 的平均差而将每个基因的平均差归 一 化为频率值，所述对照转录物根据 Hill AA等人Science 290:809-12(2000)的程序被掺入(spike mto)每个杂 交混合物。计算每个基因的频率并且该频率表示等于每106总转录物个 体基因转录物的总数的值。
图1A描述了核激素受体超家族的19位不同成员(LXRa、 LXR卩、 Rev画erba、 Rev隱e棒GR、 EAR2、 COUP TF-I、 COUP TF誦II、 CAR、 PXR、 MR、 SF-1、 TR-2、 TR-4、 NOR陽l、 Nurrl、 Nur77、 SHP、 FXR)在重度 骨关节炎软骨中的mRNA水平(以百万分率(ppm)表示)。用于这些基因 芯片研究的定量检测下限经测定约为5 ppm。图1中显示的数据提供了 LXR(3、 Rev-erba和GR似乎通过关节软骨以基因芯片的敏感度水平来表 达的证据。在图1B中，显示了六个类视黄醇受体家族成员(视黄酸受体 (RAR)和类视黄醇X受体(RXR))的表达水平。这些数据显示RXRa在关 节软骨组织中以易检测的水平表达。RXRa是LXR的异二聚体配偶体并 且LXR配体作用的生物活性单位是LXR-RXR异二聚体。这些数据提供 了关注LXR表达在关节软骨中的功能作用的动力。
实施例2
17图2A显示了正常软骨和获自中度和重度骨关节炎患者的软骨中的
ApoD mRNA水平的比较(以百万分率(ppm)表示)。用于这些基因芯片研 究的定量检测下限经测定约为5 ppm。图2A中显示的数据提供了轻度
据。^ 2B显示了在正常软骨和获自中度和重度骨关节炎患者-软骨中 的TNF(xmRNA水平的比较(以百万分率(ppm)表示)。用于这些基因芯片 研究的定量检测下限经测定约为5 ppm。图2B中显示的数据提供了轻 度和重度骨关节炎软骨中的TNFa表达相对于正常软骨被显著诱导的证据。
实施例3
^!争人OA供体(#154，来自National Disease Research Interchange (国 家疾病研究交换中心))的新鲜软骨外植体( 20块，共 200 mg/孔)在包 含1% Nutridoma (Roche Applied Science, Indianapolis, ESQ的 1 ml DMEM/F12中培养10天。在这10天期间，在有或没有LXR激动剂(2 ^VI GW3965,报道过的LXR激动剂或2 下式I, LXR激动剂)下将外植 体暴露于细胞因子(l ng/ml ILl卩+5 ng/ml抑瘤素M)。
C〇2H
每2天，用新鲜的细胞因子和LXR激动剂替代培养基。在使用 DMMB(二曱基亚曱蓝)测定法后于这些培养物中测量蛋白聚糖的累积释 放。然后在10天治疗结束时，将外植体用蛋白酶K消化并测定总蛋白 聚糖含量。LXR激动剂显著减少了细胞因子诱导的蛋白聚糖进入培养基的释放；因而，用LXR激动剂治疗OA软骨外植体10天显著增加了外 植体中的总蛋白聚糖含量(图3)。由于ILip和抑瘤素M都存在于患有 OA的关节中，并认为它们在OA疾病进展中起作用，我们的数据表明 LXR激动剂在OA软骨中可能具有结构修饰的效果。 实施例4
将人OA供体的新鲜软骨切成块( 10mg/块， 2x2x2mm)。将软骨 外植体随机放至24孔板( 250 mg湿重/孔)中。每个治疗组包括三个外才直 体孔。将外植体在含有10%FBS的1 mlDMEM/F-12中培养3天，然后 用无血清培养基替代完全培养基。12小时后，移除培养基并加入新鲜无 血清培养基(lml),随后是LXR激动剂T0901317处理(2pM)。 8小时后 加入ILip/抑瘤素M(每孔10 ng/ml)。然后将外植体在LXR激动剂 T0卯1317和ILip/抑瘤素M的存在或缺乏下培养另外20小时。在37°C 下将从每个治疗组收集的180 )il培养基在50 mM EDTA的存在下用專欠 骨素酶ABC、角质素酶、角质素酶II去糖基化3小时。然后将样品浓縮 并在4-12% SDS-PAGE凝胶中分离。使用小鼠BC3新表位抗体(1:1500) 或兔抗AGEG抗体(1:1000)作为第一抗体和与碱性过氧化酶(1:5000)轭合 的抗小鼠或抗兔IgG抗体作为第二抗体，进行蛋白质分析。图4A显示 了使用BC3抗体的结果，并且图4B显示了使用AGEG抗体的结果。在 使用供体#259的软骨的实验中，细胞因子治疗诱导了包含聚蛋白多糖片 段的BC3和AGEG两者进入培养基的释放。用T0901317的治疗阻断了 通过细胞因子的BC3和AEEG释放的诱导。在使用供体#261的实-验中， 使含有BC3和AEGE的聚蛋白多糖片段从未治疗过的软骨外植体中释 放进入培养基。T0901317治疗减少了这些片段在培养基中的量。含
T0901317治疗所阻断。 实施例5
^夸人OA供体(由National Disease Research Interchange (国家疾病 研究交换中心)提供)的新鲜软骨外植体( 20块，总数为 200 mg/孔)在 包含1% Nutridoma (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)的1 ml DMEM/F12中培养21天。在这21天期间，在有或没有LXR激动剂(2)iM GW3965或式I)下将外植体暴露于细胞因子(IO ng/ml IL1卩+10 ng/ml抑 瘤素M)。每2-3天，将培养基用新鲜的细胞因子和LXR激动剂所替代。于第7、 14、 21天收集的培养基样品中前列腺素E2(PGE2)的总量使用 EIA测定法(Cayman)来测量。
图5显示了在所有3个时间点两种LXR激动剂都强烈抑制细胞因 子(ILl(3/抑瘤素M)诱导的PGE2合成。脂质特性分析(Lipomics Inc.)结果 显示，膜磷脂的两种形式(大多数花生四烯酸(AA)来源于此)的量通过 LXR激活而减少，表明了总PGE2的减少至少部分由OA软骨中的总AA 含量减少来介导。涉及PGE2合成的酶的表达还可^皮LXR活性所抑制。
PGE2是主要的促炎性前列腺素类，它在具有类风湿性关节炎(RA) 或OA的关节中发现。软骨中增加的PGE2还可在炎症介导的具有关节 炎疾病特征的结构性损伤中起作用。更重要地，PGE2是炎症、疼痛过 敏性的关键特征中的一个。因此，LXR激动剂;f艮有可能成为可通过阻断 OA关节中的PGE2生成而緩解疼痛以及通过阻断软骨基质退化而预防 疾病进展的OA治疗剂。
权利要求
1. 一种治疗患有骨关节炎的哺乳动物的方法，其包括向需要这种治疗的哺乳动物给药LXR反应性的基因表达调节量的LXR激动剂。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述LXR激动剂是天然的羟 胆固醇、合成的羟胆固醇、合成的非羟胆固醇或天然的非羟胆固醇。
3. 根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述LXR激动 剂是20(S)羟基胆固醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-羟基胆 固醇、24(S),25-环氧胆固醇、27-羟基胆固醇、N,N-二甲基-3p-羟基胆烯 酰胺、N-(2,2,2-三氟乙基)-N-H-[2,2,2-三氟-l-羟基-l-(三氟甲基)乙基]苯 基}苯磺酰胺、[3-(3-(2-氯-三氟甲基苄基-2,2-二苯基乙氨基)丙氧基)苯乙 酸]、N-甲基-N-[4-(2，2,2-三氟-l-羟基-l-三氟曱基-l-乙基)-苯基]-苯磺酰 胺、4,5-二氢-1-(3-(3-三氟曱基-7-丙基-苯并异嚅唑-6-基氧基)丙基)-2,6-嘧啶二酮、3-氯-4-(3-(7-丙基-3-三氟曱基-6-(4,5)-异哺唑基)丙硫基)-苯乙 酸、乙酰基-罗汉松酸二聚体、桩蛋白、链甾醇或豆甾醇。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述LXR激动剂是N-(2,2,2-三氟乙基)-N-[4-(2,2,2-三氟-l-羟基-l-三氟甲基-l-乙基)-苯基]-苯磺酰胺。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中采用LXR激动 剂的治疗抑制软骨退化并诱导软骨再生。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述LXR激动 剂抑制聚集蛋白聚糖酶活性。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述LXR激动 剂抑制促炎性细胞因子和/或炎性介质在骨关节炎关节中的精制。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述炎性介质是前列腺素E2。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中采用LXR激动 剂的治疗提供骨关节炎关节的疼痛緩解。
10. 根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述LXR反应 性基因是载脂蛋白D。
11. 一种诱导载脂蛋白D在具有骨关节炎软骨的哺乳动物中表达的 方法，其包括向需要这种诱导的哺乳动物给药有效量的LXR激动剂。
12. —种预防骨关节炎的方法，其包括(a)测定在受治疗者的正常软骨中的基线载脂蛋白D表达水平；以及(b)通过用LXR激动剂治疗来保持受治疗者的软骨中的基线载脂蛋白D的表达水平。
13. —种用于治疗患有骨关节炎的哺乳动物的方法，其包括向需要 这种治疗的哺乳动物给药聚集蛋白聚糖酶活性抑制量的LXR激动剂。
14. 一种抑制具有骨关节炎软骨的哺乳动物中聚集蛋白聚糖酶的活 性的方法，其包括向需要这种抑制的哺乳动物给药有效量的LXR激动 剂。
15. —种用于治疗患有骨关节炎的哺乳动物的方法，其包括向需要 这种治疗的哺乳动物给药有效量的LXR激动剂以抑制促炎性细胞因子 和脂质在骨关节炎关节中的精制。
16. —种用于治疗患有骨关节炎的哺乳动物的方法，其包括向需要 这种治疗的哺乳动物给药有效量的LXR激动剂以緩解骨关节炎关节的 疼痛。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述LXR激动剂抑制TNFa表达。
18. —种检测受治疗者中的骨关节炎表型的方法，其包括(a) 测定在正常软骨中的基线载脂蛋白D的表达水平；(b) 从疑似患有骨关节炎的受治疗者中获得软骨样品；以及(c) 检测载脂蛋白D在所述样品中的表达水平； 其中与基线载脂蛋白D表达相比，在所述样品中的更低量的载脂蛋白D表达指示骨关节炎。
19. 一种鉴定能减少软骨中的骨关节炎效应的LXR配体的方法，其 包括(a) 提供包含LXR的样品；(b) 使所述样品与测试化合物接触；以及(c)测定所述测试化合物是否诱导载脂蛋白D的表达、抑制聚集蛋 白聚糖酶的活性、抑制促炎性细胞因子的精制、或它们的组合。
20. LXR激动剂在制备用于治疗或预防骨关节炎的药物中的用途。
全文摘要
本文公开了LXR激动剂用于预防和治疗骨关节炎的用途，以及在受治疗者中检测骨关节炎表型的方法和鉴定能减小软骨中的骨关节炎效应的LXR配体的方法。
文档编号A61K31/00GK101547688SQ200780034740
公开日2009年9月30日 申请日期2007年9月18日 优先权日2006年9月19日
发明者E·拉瓦利, E·莫里斯, L·科林斯-拉西, S·纳帕尔, Z·杨 申请人:惠氏公司