靶向的聚赖氨酸树状聚体治疗剂改性的大分子2的制作方法

专利名称：靶向的聚赖氨酸树状聚体治疗剂改性的大分子2的制作方法
专利说明靶向的聚赖氨酸树状聚体治疗剂改性的大分子2 发明领域 本发明总体上涉及分支大分子及其作为成像剂或造影剂的用途。具体而言，本发明涉及由赖氨酸或赖氨酸类似物衍生而来并具有多个功能部分的树状聚体，本发明还涉及所述大分子的用途，特别是在治疗应用中的用途，以及包含其的组合物。

背景技术：
本说明书对任何现有出版物(或者由该出版物所得到的信息)或者任何已知事物的引用，不能并且不应该成为认可或承认、或者以任何方式表明这些现有的出版物(或者由该出版物所得到的信息)或者已知的事物形成了本说明书所涉及的致力研究领域中的部分普通常识。
鉴定用于药物制备物的新化合物是寻找更可靠和更有效治疗的重要部分。然而，同样重要的是已知药物的研发和改进，降低与新候选药物相关的风险，以及显著减少使药物进入临床研发的进展和花费。
许多药物在临床试验阶段失败，要么是因为它们的物理性质(特别是溶解度)使它们难以制备，要么是因为差的治疗指数在高药物浓度期间(即，在刚刚给药后)引起毒性作用。其他缺点包括差的吸收，差的生物利用度，不稳定性，由于不能靶向药物而引起的全身副作用，以及一旦给药后不能控制其生物分布、代谢和肾或肝的清除。类似地，目前市场上的一些产品可以就这些方面进行改进。
已经尝试许多方法来改善药物化合物的特征，包括将药物试剂制成脂质体、胶束或聚合物胶束制剂，以及将药物试剂与亲水聚合物主链共价连接。
理想的特征改性剂的特点包括具有明确定义的结构，允许对目的化合物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)特征(也称为药代动力学)进行精确控制，以及能方便地在每个试剂或结构中携带多种化合物。通过控制其从所述试剂或结构成分中释放(使身体仅仅与治疗血药浓度的化合物接触)可以改善目的化合物的毒性。
在最近几年，已经发现树枝状大分子或树状聚体在生物技术和药物应用中的应用不断增加。树枝状大分子是具有稠密分枝结构的一类特殊聚合物，其特征在于具有比普通聚合物更高的功能部分浓度/单位分子体积。有三亚类树枝状大分子随机超支化聚合物；树枝状接枝聚合物和树状聚体(其包括树状分子(dendron))，根据存在于每一个树枝状结构中结构控制的相对程度进行分类(Fréchet andTomalia″Dendrimers and other Dendritic Polymers″，Wiley andSons，New York，2002)。树状聚体的独特性质，特别是，诸如它们高程度的分支、多价、球状结构以及明确确定的分子量，使它们成为药物应用中有希望的新骨架。在过去几十年里，已经增加了关于设计和合成生物相容的树状聚体及其在许多生物科学领域(包括大分子药物、药物递送、生物医学成像和医学设备)中的应用的研究。
树枝状聚合物作为药物递送载体和药物活性剂的潜在利用近年来已经受到越来越多的关注。然而，虽然文献有许多报道，例如树状聚体组装的合成方案，树状聚体-药物相互作用和药物负载效率的描述，以及越来越多的关于树状聚体与细胞系相互作用的体外评价，但几乎没有描述树状聚体的基本药代动力学和代谢速率的信息。
此外，制备在血液中循环足够长时间以在靶位点上聚集，但还可以以合理速率从体内排除以避免长期堆积的树状聚体，仍然是一个挑战。此外，树状聚体的组织定位仍然难以预先预测，且需要更多的研究来确定外周树枝状基团对这些性质的影响。另一个需要研究的领域是药物从树状聚体的释放。与致密的球状树枝状结构相关的空间位阻使得酶促可切除连接的改造困难。
惊奇地发现，如本文所述通过引入一种或多种功能部分，可以显著改善所述大分子的功效，且对可能存在的其他功能部分没有显著不利影响，或不干扰可能存在的其他功能部分。
发明概述 本发明涉及树状聚体，其具有与其核心部分连接的第一功能部分和至少一个与所述树状聚体最外层的结构单元(表面结构单元)的表面连接的第二功能部分。特别是，本发明涉及一种树状聚体，其包含核心和一层或多层赖氨酸或赖氨酸类似物结构单元，其中所述树状聚体具有与核心部分的氮原子连接的第一功能部分和与结构单元最外层的表面氨基氮原子连接的一个或多个第二功能部分。
因此，本发明的第一个方面提供了一种大分子，其包含 (i)核心部分，其具有用于与第一功能部分连接的第一氨基氮原子，以及用于与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元连接的至少两个其他的氨基氮原子； (ii)第一功能部分，其通过第一氨基氮原子与所述的核心部分连接； (iii)至少一层赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元，其最外层具有用于与一个或多个第二功能部分连接的表面氨基氮原子，这些所述的层通过所述的核心部分的至少两个其他氨基氮原子而与所述的核心部分连接；以及 (iv)一个或多个第二功能部分，其与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元的最外层的表面氨基氮原子连接； 其中 所述的第一和第二功能部分均包含选自药学活性试剂、相互作用试剂和药代动力学改性剂试剂。
将药学活性试剂整合到本发明的大分子中可以在使用时为所述试剂提供延长的释放特征，或延长其血浆停留时间。将药代动力学改性剂整合到所述大分子中可以在使用时进一步增强所述药学活性试剂的释放特征，或进一步延长其血浆停留时间。将相互作用试剂(诸如靶向试剂或捕获试剂)整合到本发明的大分子中可以在使用时增加所述大分子在靶细胞或组织类型中的浓度，并有利地增加靶细胞或组织类型中所述大分子的摄取，或靶向所述大分子至所使用的蛋白、DNA或RNA靶，或提供将所述大分子与诊断或医疗设备成分的表面连接的更有效的、可重复的方法。
反过来，可以将如上所述不同类型的功能部分的两个或多个整合到所述大分子中以提供具有多个互补功能的大分子。
第二功能部分可以与第一功能部分相同或不同。第二功能部分可以仅与表面氨基氮原子的一个、一些或全部连接。所述大分子可以仅包含第一和第二功能部分，或可以包含一个或多个如本文所定义的第三(和任选地第四和第五)功能部分，其可以任选地与表面氨基连接以提供一种大分子，所述大分子在核心具有第一功能部分和在所述大分子的表面上具有每一种第二和第三(和任选地第四和第五)功能部分的至少一种。第三(和任选地第四和第五)功能部分可以选自药学活性试剂、药代动力学改性剂或相互作用试剂。
所述功能部分可独立地与合适的氮原子直接相连，或经由可切除或不可切除的连接体连接。
根据本发明这个方面的大分子特别适合呈递药学活性试剂。因此，在本发明的一个实施方案，至少第一和/或第二功能部分包含药学活性试剂。所述大分子可以在大分子的核心上和/或在大分子表面所选的位点上包括与核心和/或表面结构单元连接的单一药学活性试剂或多种药学活性试剂(其可以是相同或不同的)。
在该实施方案的具体实施例中，药学活性试剂与所述大分子的核心部分连接。在其进一步的实施例中，所述药学活性试剂是蛋白或多肽。
在本发明的一些实施方案中，至少第一和/或第二功能部分包含药代动力学改性剂。所述大分子可以在大分子的核心上和/或在大分子表面所选的位点上包括与核心和/或表面结构单元连接的单一药代动力学改性剂或多种药代动力学改性剂(其可以是相同或不同的)。
大分子的呈递可以有利地导致所述大分子性能的改善，所述大分子包括包含药学活性试剂的第一功能部分，和至少一种包含药代动力学改性剂的第二功能部分。
在本发明其他实施方案中，提供一种大分子，其中第一功能部分包含靶向试剂(诸如，抗体)，和至少一种包含药学活性试剂的第二功能部分。
在本发明的另一方面，提供制备如上所述大分子的方法，包括下述步骤 (i)提供 (a)树状聚体，其包括 (i)核心部分，其具有用于与第一功能部分连接的第一氨基氮原子，以及用于与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元连接的至少两个其他的氨基氮原子； (ii)在第一氨基氮原子上的第一保护基团； (iii)至少一层赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元，其最外层具有用于与一个或多个第二功能部分连接的表面氨基氮原子，这些所述的层通过所述的核心部分的至少两个其他氨基氮原子而与所述的核心部分连接；以及 (iv)在赖氨酸或赖氨酸类似物结构单元的最外层的一个或多个表面氨基氮原子上的第二保护基团； (b)第一功能部分；和 (c)至少一种第二功能部分； (ii)使用第一保护基团对其惰性的反应条件选择性地除去第二保护基团； (iii)将至少一种第二功能部分与所述去保护的表面氨基氮原子连接； (iv)除去第一保护基团； (v)将第一功能部分与所述去保护的第一氨基氮原子或连接体基团连接。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含根据本发明的大分子及其药学可接受的赋形剂、载体或佐剂。
在另一方面，本发明提供如本文所述的一种大分子，其用于治疗。
如本文所讨论的，可以在各种应用中利用根据本发明该方面的大分子和含有所述大分子的药物组合物，其中将所述药学活性试剂定向或结合具体的作用位点，或具体的细胞或组织类型，或蛋白、DNA或RNA靶、或底物的能力，或改进其药代动力学的能力。


发明内容
本说明书对任何现有出版物(或者由该出版物所得到的信息)或者任何已知事物的引用，不能并且不应该成为认可或承认、或者以任何方式表明这些现有的出版物(或者由该出版物所得到的信息)或者已知的事物形成了本说明书所涉及的致力研究领域中的部分普通常识。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“抗体”包括完整的抗体、或衍生物或片段(例如通过酶或化学裂解而产生的或者通过重组而得到的)，或者通过蛋白质表达技术或者通过化学合成而产生的抗体结合区域的模拟物(其保持了特异性的结合活性)。具体而言，所述的术语包括单克隆抗体以及由单克隆抗体得到的所有的多种形式，包括但不限于全长抗体(例如具有完整的Fc区域)；抗原结合片段，包括例如Fv、Fab、Fab’和F(ab′)2片段；以及采用重组方法形成的抗体衍生的多肽，例如单链抗体。本文所用的术语、“抗体”以及“多种抗体”是指在例如转基因动物中或者通过噬菌体展示而形成的人抗体、以及嵌合抗体和人源化的抗体。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“连接的”是指大分子的化学成分之间通过共价键、氢键、吸附作用、金属键合、范德华力、离子键合、螯合-金属-螯合连接键、配体-受体连接键、由肽的类似物的DNA和RNA的互补双链而形成的双链体或三链体、或者它们的组合而形成的相连。本发明所包括的具体形式为共价键。所述的连接可以为直接连接，或者通过一个或多个插入部分(例如一个或多个桥连、隔离物或连接体部分，这些术语在本文中可以互换使用)而形成的间接连接。此外，连接基团或功能部分或胺可以进一步通过有助于连接的改性剂改性。
在本说明书和权利要求书中所使用的术语“所选的连接点”指树枝状大分子聚合物的一个或多个氨基，其与树枝状大分子聚合物的其他氨基不同在于其在合成树状聚体聚合物的规定阶段中是唯一有反应性的，从而允许功能部分或树枝状基序的连接。这有利于实现功能部分的表面位置和分布被获知。因此所选的连接点还可以在核心部分的第一氮原子上或在树状聚体的表面上。
在本说明书和权利要求书中所使用的术语“结合”指给定分子例如被另一配体捕获(结合)和抓住(held)从而与靶相互作用的能力，使得所述配体和其靶之间的相互作用是相对特异性的。实例包括抗体、或其衍生物和片段与抗体靶(受体)之间的特异性相互作用；或小分子(诸如生物素、叶酸或地高辛)与其各自地靶(受体或抗体)之间的相互作用。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“衍生物”和“片段”，当其使用与多肽(特别是抗体)有关时，是指具有相似的氨基酸序列(即，至少80％、85％、90％或95％的同源性)并且至少在一定程度上保持了所述多肽的活性的功能等价物。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“赖氨酸类似物”是指具有单一一个顶部羧基、以及两个或三个伯胺基团的分子。在一种情况下，对于母体赖氨酸1而言，赖氨酸类似物可以是不对称的，这种情况被定义为将伯胺与羧酸酯顶部相连的键和原子是不同的。在第二种情况下，赖氨酸类似物可以为对称的，其中对称被定义为将每个伯胺与羧酸酯相连的键和原子是相同的，并且忽视当每个伯胺进一步发生反应时所潜在性地引入的不对称情况。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“树状聚体基序”是指大分子的分离的单元，当大分子的一个分支在所述的键(其将所述的构造单元或核心的一个反应性胺与所连接的构造单元的顶部羧酸酯基团相连)处被割断时，树状聚体基序将“脱离”。树状聚体基序的顶部羧酸酯基团代表了这样的点，在合成本发明的大分子的过程中，树状聚体基序在所述的点处与生长中的大分子核心连接。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“构造单元”是指在树状聚体基序的组装过程中使用的赖氨酸或赖氨酸类似物。所述的构造单元可以为表面以下的构造单元，其为构造单元的层的一部分或一代，其中所述的构造单元具有可以与其他构造单元的顶部羧酸酯基团进一步发生反应的胺。所述的这些层可以依次描述为表面下第一层，其是指与所述的表面层紧密相邻的第一个表面下的层；表面下第二层为在所述的表面层以下的第二层；表面下第三层为在所述的表面层以下的第三层；以此类推。
如本文所用，术语“层”或“代”是指与所述的核心部分具有相同程度的连接性的多个构造单元，即具有相同数量的、将所讨论的构造单元与所述核心的氨基氮原子连接的构造单元。例如，直接与所述的核心部分的氮原子连接、或者通过连接体基团而与所述的核心部分的氮原子连接的构造单元被称为第一层或第一代。在其与所述核心部分的氮原子之间具有一个构造单元的构造单元被称为第二层或第二代。一层或一代构造单元必需包含至少两个构造单元。对于所用的构造单元而言，每层构造单元为同质的，然而不同的构造单元可用于制备不同的层。因此，在本发明的某些实施方案中，所述的大分子由一层或多层单一一种构造单元(例如赖氨酸)构成。在其他实施方案中，所述的大分子包含至少两层构造单元，其中至少两层构造单元由不同的构造单元构成。
术语“小分子”指任何非肽分子，其分子量至多为约1500道尔顿，诸如从约200至约600，或从约600至约1000，或从约1000至约1500道尔顿。
如本文所用，术语“表面”用于指树状聚体的构造单元的最外层。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“表面构造单元”是指大分子的构造单元的最外层，即，没有与表面构造单元的表面上的胺连接的其他构造单元。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“表面上的胺”或者“表面上的氨基”或者“表面上的氨基氮原子”是指由表面构造单元衍生的树状聚体基序的任何最外面的氮。这些表面上的胺代表了用于其他构造单元、连接体或功能部分(任选地通过改性基团)的连接点。
在本说明书和权利要求书中所使用的术语“功能部分”指如本文定义的任何基团，其可以直接或间接地连接在所述核心第一氨基氮原子或表面胺处，以实现所述功能。功能部分的性质和数目可以通过标准的分析技术(包括质子/碳NMR、ESI或MALDI质谱)来测定。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“胺保护基团”是指这样的基团，就该基团而言，其除去过程具有一定的顺序，从而使得这些并非用于切除的基团对切除环境是惰性的。当将保护基团定义为“可溶的”时，其是指用于除去一个基团的环境可以影响第二个基团的整体性，而如果第一个基团的整体性有待保持的话，就需要首先除去第二个基团。当保护基团被进一步定义为“正交(orthogonal)”时，其是指每个基团对于除去正交组中的每一个其他基团所需要的切除环境是惰性的。重要的应该注意，当采用了合适的反应条件时，保护基团仅为可溶的或者仅为正交的。本领域中描述了多种用于多胺分子的选择性单保护的普通方法。此类方法在Krapcho and Kuell SyntheticCommun.(1990)202559中有所描述。
本发明的大分子由至少一层赖氨酸或赖氨酸类似物构造分子构建而成。本发明所包括的构造单元的实例包括以下这些(其中#表示顶部羧基的羰基残基) 赖氨酸*1具有以下结构
甘氨酰-赖氨酸*2具有以下结构
类似物3具有以下结构，其中a为整数1或2；而b和c独立地为整数1、2、3或4。

类似物4具有以下结构，其中a为整数0、1或2；而b和c独立地为整数2、3、4、5或6。

类似物*5具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5。

类似物6具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数0、1、2、3、4或5。

类似物7具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5。

类似物8具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b、c和d独立地为整数1、2、3、4或5。

类似物9具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5。

此外，所述构造单元的任何亚甲基可以被亚甲氧基(CH2-O)或亚乙氧基(CH2-CH2-O)替代，前体条件是这种替代不会导致在所述的构造单元内形成碳酸酯(-O-C(O)-O-)或氨基甲酸酯(-O-C(O)-N-)部分。
在本发明的某些实施方案中，所述的构造单元选自赖氨酸1、甘氨酰-赖氨酸2或赖氨酸类似物5
其中a为整数0、1或2；此外，1、2或5的任何亚甲基可以被亚甲氧基或亚乙氧基替代，前体条件是这种替代不会导致在所述的构造单元内形成碳酸酯或氨基甲酸酯部分。
所述构造单元的羧酸酯基团和胺基可以被衍生，从而增大或减小这些基团的活性。可以使用诸如Boc，CBz，4-硝基苄氧基氨基甲酸酯(4-NO2-CBz)Fmoc，Dde，CF3CO2，2-卤代-CBz，Alloc，Me3SiEtSO2，Troc，o-NO-2PhSO2以及2，4-二硝基苯-磺酰基之类的胺保护基团来保护(衍生)反应性胺基。
通常，游离羧基不具有足够的反应性来与胺反应形成酰胺键，这样优选的是提供有助于脱水作用并由此驱动反应完成的一些手段。这可以通过例如“活化”羧基作为酰基卤化物衍生物或活性酯衍生物来实现(The Peptides，Analysis，Synthesis and Biology Vol 1 MajorMethods of Peptide Bond Formation；Academic Press New York 1979eds Gross，E.and Meienhofer，J.，PeptidesChemistry andBiology，Wiley-VCH Weinheim 2002，Sewald，N.and Jakubke，H-D.，The Chemical Synthesis of Peptides Clarendon Press，Oxford 1994，Jones，J.)。
在第一种活化方法中，在脱水反应物存在下(如果需要的话，其他活化试剂也可以存在)，使含有羧酸的反应物与含有羟基部分的第二种反应物发生反应，从而得到这样的产物，其中含酸部分与含羟基部分通过酯键相连。该产物被称为“活化酯”。选择含有羟基部分的反应物，使得所述的产物酯可以容易地与伯胺发生反应，从而生成氨化物，并释放出之前所述的含有羟基部分的反应物。在一些情况下，活性酯是足够稳定的，从而能够在使用之前对其进行分离、纯化和储存。
在第二种活化方法中，可以使含有羧基的反应物与活化试剂“原位”发生反应，从而形成酰基类物质，该物质进一步与伯胺(其同样以“原位”方式存在，或者是在合适的先前活化时间之后加入的)反应，从而形成所需的酰胺键。
两种活化方法在PCT/AU2006/001591中都有更详细的描述。
树状聚体基序的赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元与核心化合物发生反应。所述的核心可以是含有三个或多个反应性(氨基)氮的任何化合物，其中一个反应性(氨基)氮最终成为用于第一功能部分(第一氨基氮原子)的连接点。应该理解，该氮原子可以在树状聚体的构建过程中通过合适的保护基团来保护。
在本发明的某些实施方案中，所述的核心可以通过使二氨基化合物的一个氮原子与赖氨酸或赖氨酸类似物反应，从而形成三氨基核心化合物的方法来制备。然后，所述的二氨基化合物的未反应的氨基成为用于连接第一功能部分的氨基，而所述的赖氨酸或赖氨酸类似物的至少两个氨基成为用于所述的构造单元的连接点。
适用于与赖氨酸或赖氨酸类似物(例如本文示例性举出的那些)反应、从而制备出所述的核心部分的二氨基化合物包括
其中a为1-9的整数，例如1、2、3、4或5；
其中a、b和c独立地为整数1、2、3、4或5，例如2或3；并且d为0-100的整数，例如1-30，特别是1-5、6-10、11-15、16-20、21-25或26-30；
其中a和b独立地为整数0、1、2、3、4或5；
其中a和c独立地为整数1、2、3、4、5或6；而c为整数0、1、2、3、4、5或6；
其中a和d独立地为整数1、2、3、4、5或6；而b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6。
可以使用未经过进一步改性(即，与赖氨酸或赖氨酸类似物发生反应)的三氨基化合物，或者可以使该三氨基化合物与赖氨酸或赖氨酸类似物发生反应来形成四氨基核心。
三氨基化合物的实例包括
其中a、b和c独立地为整数1、2、3、4、5或6；
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；而d、e和f独立地为整数1、2、3、4、5或6。
可以使用未经过进一步改性(即，与赖氨酸或赖氨酸类似物发生反应)的四氨基化合物，或者可以使该四氨基化合物与赖氨酸或赖氨酸类似物发生反应来形成五氨基核心。四氨基化合物的实例包括
其中a、b、c和d独立地为整数0、1、2、3、4、5或6。

其中a、b、c和d独立地为整数1、2、3、4、5或6。

其中a、b、c和d独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；而e、f、g和h独立地为整数1、2、3、4、5或6。
此外，所述核心的任何亚甲基都可以被亚甲氧基或亚乙氧基替代，前提条件是这种替代不会导致在所述的核心内形成碳酸酯部分或氨基甲酸酯部分。
在某些实施方案中，所述的核心为得自赖氨酸或赖氨酸类似物与二氨基化合物反应的三氨基化合物，其中所述的二氨基化合物选自
其中a为整数1、2、3、4或5；
其中a、b和c独立地为整数2或3；而d为1-30的整数；
其中a和d独立地为整数1或2，而b和c独立地为整数0、1或2。
在具体的实施例中，所述的核心由二氨基化合物(例如化合物11，其中a、b、c和d均为1(NEOEOEN))和赖氨酸或赖氨酸类似物(例如类似物5，其中a、b、和c均为2(Su(NPN)2))构成。
在其他实施方案中，所述的核心为选自以下的三氨基或四氨基化合物，其单独或者作为与赖氨酸或赖氨酸类似物的反应产物
其中a、b和c可以相同或不同，并且为1-2的整数；
其中a、b和c独立地为整数0、1或2；而d、e和f独立地为整数1或2。
或者四氨基化合物
其中a、b、c和d独立地为整数0或1；
其中a、b、c和d独立地为整数1或2；
其中a、b、c和d独立地为0、1或2；而e、f、g和h独立地为整数1或2。
赖氨酸和赖氨酸类似物树状聚体聚合物的制备是公知的，并且在美国专利号4,289,872和4,410,688的实施例中有所描述。
通常，所述的树状聚体具有保留了单一一个反应性位点(该位点被保护(通过合适的保护基团))的核心，而所述核心的其余氨基位点用于构造单元定加入。所述核心的被保护的反应性位点最终用于将单一的实体(第一功能部分)与大分子的核心连接。
在构建所述的树状聚体的过程中，可以利用胺保护基团，通过例如使构造单元上的两个可利用氨基中的仅仅一个氨基、或构造单元上的三个可利用氨基中的仅仅一个或两个氨基发生反应，或者备选地，使仅在一部分表面构造(例如每个第二或第三构造单元、或者三分之二的构造单元)单元上的所有氨基发生反应，从而仅使一层或一代中构造单元的一部分表面上的胺基进一步发生反应。然而，在本发明的某些实施方案中，在特定层或代中的构造单元的每一个氨基都会进一步与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元发生反应，直到所需数量的层或代被构建完成为止。在这种方式中，例如，当使用具有两个氨基的构造单元时，层中构造单元的数量为紧邻下层中构造单元的数量的二倍，而当使用具有三个氨基的构造单元时，层中构造单元的数量为紧邻下层中构造单元的数量的三倍。
所述功能部分包括药学活性试剂、药代动力学改性剂或相互作用试剂(诸如靶向试剂或捕获试剂)的残基。第一和第二功能部分可以是相同或不同的，且任选地，树状聚体的表面还可以携带一种或多种不同的其它功能部分，例如，第三、第四或第五功能部分。功能部分可以是单一类型试剂(例如，药物活性试剂)的残基，或可以包括作为单一实体的两种试剂，例如，连接或相连在一起的两个药学活性试剂，或者与药代动力学改性剂连接或相连在一起的药学活性试剂，或者与靶向试剂连接或相连在一起的药学活性试剂。功能部分，例如当指第二功能部分时，认为指单一类型的功能部分，例如，多个第二功能部分的每一个是相同的。
在本发明的一些实施方案中，单一类型、或两种、三种或四种类型的功能部分与所有的表面氨基连接。在其它实施方案中，只有一部分表面氨基，例如，改变结构单元的那些或每个结构单元的两个表面基团的一个或每个结构单元的三个表面基团的一个或两个具有连接的功能部分。
如本文所使用的，药学活性试剂包括任何分子或其前体，或其残基，其能在给受试者单独施用或与另一个药学活性试剂联合施用后赋予生理效应或反应。所述术语还包括这样的试剂或其残基，其自身不赋予生理效应或其所需的水平，但与一种或多种其他药学试剂联合时，或当与树状聚体连接时提供所需的生理活性。本文包括的药学活性试剂可以是天然的，包括天然分子的修饰物和衍生物，或可以是合成的，本文包括的实例包括小分子、聚合物、(非-树枝状和树枝状的，其中对于大分子，所述树枝状部分可以具有相同数目的代或不同数目的代)、糖、寡糖、多糖、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白、糖蛋白、核酸和核苷酸。所包括的具体药学活性试剂打算用于治疗性或预防性应用。药学活性试剂赋予的生理效应或反应性的实例包括抑制或刺激生物反应，例如通过与底物结合，物质的置换或加成，有害物质的去除和细胞死亡。
已经研发了基于蛋白的药物，其为患者提供了显著的临床益处，但在许多情况下，这些药物需要频繁给药和大的给药剂量。这是因为蛋白药物的理化性质导致其快速的肾排泄或代谢清除。有利地是，当与本文所述的树状聚体相连时，可以有利地改变蛋白的药代动力学性质。
因此，在本发明的某些实施例中，大分子的药学活性试剂可以是基于氨基酸的，诸如蛋白、糖肽、肽、寡肽、多肽、酶或其衍生物。
所述酶可以选自糖类特异性酶、蛋白水解酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。酶的实例包括天冬酰氨酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨基酶、腺苷脱氨基酶、超氧化物歧化酶、内毒素酶(endotoxinase)、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、腺苷二磷酸酯酶(adenosine diphosphatase)、酪氨酸酶和胆红素氧化酶。目标糖类特异性酶包括葡萄糖氧化酶、糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖醛酸糖苷酶等。
不含多糖部分的肽和蛋白可以使用糖基化转移酶通过酶催化进行糖基化，或例如通过使用标准肽化学和糖基化氨基酸组分(诸如，N-半乳糖基化天冬酰氨酸)化学合成。备选地，可以将糖基化位点改造到在体内正常以其非糖基化形式产生的蛋白或肽中。
蛋白和肽的实例包括血红蛋白，血清蛋白诸如，血液因子包括因子VII、FX、FII、FV，蛋白C，蛋白S，tPA，PAI-1，组织因子FXI、FXII和FXIII，以及其序列FVIII、FIX变体；免疫球蛋白，细胞因子诸如白细胞介素、α-、β-、和γ-干扰素、集落刺激因子(包括粒细胞集落刺激因子)、血小板衍生生长因子和膦酯酶激活蛋白(phospholipase-activating protein(PUP))。其它蛋白和肽包括胰岛素、植物蛋白诸如凝集素和蓖麻毒蛋白，肿瘤坏死因子和相关等位基因，肿瘤坏死因子的可溶形式、白细胞介素受体和白细胞介素受体的可溶形式，生长因子诸如组织生长因子，诸如TGFa′s或TGFps和表皮生长因子、激素、生长调节素、红细胞生成素、色素激素(pigmentary hormones)、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲状腺激素(thyroid-stimulatinghormone)、组织纤溶酶原激活物等。目的的免疫球蛋白包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段。
大分子的药学活性试剂备选地或另外可以包括水不溶性药物、水溶性药物、亲脂性药物或其混合物。
药学活性试剂可以列举为，但不限于选自表1中的一类或多类。
表1药学活性试剂 丙酮血症制备物合成代谢剂 麻醉剂镇痛剂 抗酸剂抗关节炎剂 抗体 抗惊厥剂 抗真菌剂 抗组胺剂 抗感染剂 抗炎剂 抗代谢剂 抗菌剂 抗有丝分裂剂 杀寄生虫剂 抗原虫剂 抗溃疡剂 抗病毒药物行为矫正药 生物制剂 血液和血液替代品 支气管扩张剂和祛痰剂 癌症治疗和相关药物 心血管药物中枢神经系统药物 利尿剂避孕剂 生长激素 糖尿病治疗 补血药致育药物 激素替代治疗 生长促进剂 免疫抑制剂止血剂 激素和类似物 免疫激活剂 矿物质肌肉松弛剂 营养食品(Nutraceuticals)和天然产物 营养品 眼科剂物 肥胖治疗剂 疼痛治疗剂骨质疏松剂物 蛋白肽和多肽 类视黄醇呼吸剂物 止痛剂和镇定剂 移植产物 尿道酸化剂 类固醇 维生素 疫苗和佐剂 本发明特别适合于这类药物，其甚至在非常小量时都是非常有活性的，且可实现其持续长期的施用，特别是克服标准剂量的毒性问题。非限制性实例包括紫杉醇和多柔比星。
根据本发明的大分子特别可用于促进药物对炎症位点的被动靶向。由于与炎症相关的脉管系统渗透性的增加以及有限的淋巴引流，对大分子的靶向是可能。因此，在某些实施方案中，所述药学活性试剂是抗炎试剂。
在一个实施方案中，根据本发明的大分子包括作为功能部分的两种或多种不同的药学活性试剂、及其衍生物、其前体或其残基，以分开的部分或一起在单一实体中。根据本发明这一方面的大分子因此可在联合疗法中有应用。
所述的药学活性试剂可以是选自下述一种或多种的抗肿瘤试剂利妥昔单抗(rituximab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、多西他赛(docetaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、伊立替康(irinotecan)、紫杉醇(paclitaxel)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、卡铂、西妥昔单抗(cetuximab)、多柔比星(doxorubicin)、培美曲塞(pemetrexed)、表柔比星(epirubicin)、硼替佐米(bortezomib)、拓扑替康(topotecan)、阿扎胞苷(azacitidine)、长春瑞滨(vinorelbine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氟达拉滨(fludarabine)、多柔比星(doxorubicin)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、卡莫司汀(carmustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素(mitomycin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、美法仑(melphalan)、砒霜(arsenic)、地尼白介素2(denileukin diftitox)、阿糖胞苷(cytarabine)、左亚叶酸钙(calcium levofolinate)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、依托泊苷(etoposide)、西洋檞寄生(viscum album)、美司钠(mesna)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、奥佐米星(ozogamicin)、白消安(busulfan)、喷司他丁(pentostatin)、克拉屈滨(cladribine)、博莱霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、苯达莫司汀(bendamustine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、长春新碱(vincristine)、福莫司汀(fotemustine)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、卟非姆钠(porfimer sodium)和长春花碱(vinblastine)。
所述药学活性试剂可以是表1中所列举类别中的任何两种或多种和/或上面所列的抗肿瘤试剂的组合，作为单一实体(当适当时)或作为分开的功能部分。
示例性组合包括，但不限于下述组合化疗药物；抗炎药物和抗关节炎药物；肥胖治疗剂和糖尿病治疗剂；生长激素和生长促进剂；肌肉松弛剂和抗炎剂；呼吸药物和支气管扩张剂或抗菌剂；化疗剂和维生素等。
本文包括的另一组药学活性试剂是这样的分子或其残基，其自身可能不一定提供任何所需的或有意义的生理活性，但当与树状聚体的表面或核心连接时，或当与一种或多种其它药学活性试剂联合(分开地、顺序地或作为均质组合物)施用时，赋予生理效应。
国际专利申请号PCT/AU95/00350(WO 95/34595)(其内容以引用方式并入本文)描述了一类抗病毒化合物，其包括具有多个表面基团的树状聚体聚合物，其中至少一个表面基团具有与其键合或相连的含阴离子或阳离子的部分(或端基)，特别时含磺酸的部分、含羧酸的部分或含三甲基铵的部分。国际专利申请号PCT/AU97/00447(WO98/03573)(其内容以引用方式并入本文)描述了含阴离子或阳离子的树状聚体聚合物在预防性或治疗性抑制人或非人动物患者中血管生成的用途。与树状聚体聚合物的表面连接或键合的含阴离子或阳离子的部分(或端基)包括由含磺酸的部分、含羧酸的部分、含磷酸或膦酸的部分、含硼酸的部分、含神经氨酸或唾液酸的部分、或含在其4-或其它位置上进行修饰的神经氨酸或唾液酸的部分。
本文包括所述阴离子或阳离子部分(及其药学可接受的盐)为药学活性试剂的实例。所述试剂的两个具体实例包括-CO-3，5，-Ph(SO3Na)2、COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2。
在本发明的一些实施例中，所述第一功能部分包括药学活性试剂。在其他实施例中，所述第二功能部分包括药学活性试剂。在其他实施例中，所述第一功能部分包括药学活性试剂且所述第二功能部分包括不同的药学活性试剂。在其他实施例中，所述第二和第三功能部分包括药学活性试剂。
药代动力学改性剂包括任何这样的分子或其残基，其可以修饰或调节药学活性试剂或携带所述药学活性试剂的树状聚体的药代动力学特征，包括吸收、分配、代谢和/或排泄。在一个具体的实施方案中，选择所述药代动力学改性剂以延长药学活性试剂或大分子的血浆半衰期。
在本发明的某些实施方案中，至少一种功能部分是药学活性试剂且另一种功能部分是药代动力学部分。
所述的药代动力学改性剂可以包括多氟代烃、脂肪酸、脂质、寡糖和多糖、脱氧胆酸(胆汁酸)或聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，及其烷基加帽形式，或聚乙基噁唑啉(polyethyloxazoline)(例如PEOX)基序。
预期当药学活性试剂(诸如多肽或小分子药物)与至少一种药代动力学改性剂(诸如，PEG基团)联合呈递时，本发明的大分子将是特别有用的。在一个实施方案中，PEG分子可以与核心连接，且第二功能部分是呈递在大分子剩余表面上的小分子药物或多肽。任选地，第二功能部分可以是小分子药物和其他药代动力学改性剂部分的组合，作为单一功能部分或不连续的功能部分。
所述PEG基团可以包括相对短的乙二醇链，例如包括下述的一种或多种的PEG基团
备选地，所述第二功能部分可以包含聚谷氨酸类型的结构。聚谷氨酸基团是优选的，因为它们通常在体内具有很好的耐受性并且是水溶性的。
可以修饰和定制PEG、聚乙基噁唑啉基团或聚谷氨酸基团的百分比和/或PEG、聚谷氨酸或聚乙基噁唑啉基团的大小以适合不同的药学活性试剂。
先前的研究已显示在静脉内施用后，未加帽的3H标记的聚-L-赖氨酸大分子快速代谢成游离的赖氨酸。然而，令人吃惊地是，已经确定了大分子的PEG化降低蛋白水解酶和血清蛋白对所述树状聚体的识别，并抑制吞噬细胞的清除(phagocytic clearance)，从而延长血浆循环时间。此外，PEG化可以增加大分子的流体力学体积，从而降低肾清除率。
例如，本发明人发现3H标记的PEG化的赖氨酸大分子的血浆半衰期和尿排除程度取决于分子量。与较小的树状聚体(即，＜20kD)相比，较大的PEG化的大分子(即，＞30kD)相对慢地从血浆向尿中清除。尽管这一事实，即较小的大分子复合物显示与血浆成分相互作用的迹象，导致较大分子量种类的产生。这些复合物的去除是快速的，且在尿中只有完整的大分子被回收。因此，显而易见的是，通过任何方式增加大小并不一定导致大分子的血浆周期的延长。发现较大的大分子在肝和脾中累积。然而，这在长的时间周期内发生且累积的量低于剂量的10％。
在进一步优选的实施方案中，其中第一功能部分与大分子相连，作为第二功能部分的PEG或PEOX相对于第一功能部分可以构成不同的量。优选地，PEG或PEOX部分与其它功能部分的比例在128∶1至2∶1，诸如64∶1至4∶1，且特别是32∶1至8∶1的范围内。
在一个实施方案中，其中PEG或PEOX功能部分在所选的连接点处连接，PEG或PEOX部分与其它功能部分的比例优选在1∶2至1∶128，更优选为1∶4至1∶64，和最优选为1∶8至1∶32的范围内。
可以降低单个PEG或PEOX基团的相对大小以降低或消除对药学活性试剂的干扰。
在一个优选的实施方案中，PEG基团是相对单分散性的，且选自200和10,000道尔顿之间的分子量，更优选PEG基团选自在300和5000道尔顿之间的分子量，且最优选地在500和3500道尔顿之间的分子量。
PEG化还可以提高化合物的溶解度，并由此可以有助于连接在大分子表面上的其它不溶药物的溶解度。
此外，可以将药代动力学改性部分整合到大分子中以降低非特异性结合。这可以通过增加候选物与所述部分结合的特异性的相互作用部分，或通过通常称为具有“防污(anti-fouling)”性质(因为其使不想要或非特异性结合最小化)的部分。如本文所述的，PEG是这样一种部分，其例如能降低非特异性血清蛋白对大分子的识别。
由此本发明提供这样的方式，通过其能改造具有高毒性、或差的溶解度或两者的药物以提供一种媒介物，所述媒介物将提供药物的可控释放以维持在治疗性但不是毒性血浆水平上的长期药物浓度。
根据本发明的大分子可有利地包含一种或多种功能部分，其能选择性地与其它分子相互作用，诸如通过结合或其它连接(“相互作用”)。所述功能部分的存在由此可以允许大分子被靶向或浓缩至体内或体外的具体细胞类型或组织类型，或蛋白(例如，受体或酶)，多糖或DNA或RNA靶，或被另一分子捕获以促进所述大分子与表面的连接。具体实例包括血凝素和细胞表面受体的抗体和其他配体(包括小分子)。相互作用可以通过任何类型的键合或连接(包括共价键、离子键和氢键、范德华力)发生。
在一个实施方案中，所述相互作用试剂是肽或多肽抗体。有利地是，通过所述抗体与其底物的选择性结合，所述抗体通过与所述靶结合优先将大分子定向或浓缩至适当的体内或体外靶(诸如细胞表面受体或多糖)。这种小分子在本文中还被称为“靶向试剂”。
在另一实施方案中，所述相互作用功能部分是非肽小分子。有利地是，所述小分子通过与所述靶相互作用优先将大分子定向或浓缩至适当的体内或体外靶(诸如受体或其它小分子)。这种小分子在本文中被进一步称为“捕获试剂”。
本发明特别适合于药学活性试剂的靶向，其中药学活性试剂是小的药物分子。因此，在一个实施方案中，相互作用部分可以通过第一氨基氮原子与核心相连，且第二功能部分是在大分子表面上的小分子药物。任选地，第二功能部分可以是小分子药物和部分的组合，所述部分修饰所述小分子药物和/和大分子的药代动力学，诸如PEG、PEOX或聚谷氨酸，作为不连续的功能部分或作为联合单一类型的功能部分。
一些不同的细胞表面受体用作用于结合的靶，并优选地，提高对大分子的摄取。特别的是，用于本发明的受体及其相关配体包括，但不限于叶酸受体、肾上腺素能受体、生长激素受体、促黄体激素受体、雌激素受体、表皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体(例如，FGFR2)、IL-2受体、CFTR和血管内皮生长因子(VEGF)受体。
叶酸是一种维生素，其是核苷酸碱基生物合成的关键，因此在增殖细胞中需要大量叶酸。在癌细胞中，这种对叶酸增加的需要经常反映在叶酸受体的过表达中，所述叶酸受体负责运输叶酸穿过细胞膜。相反，减少的叶酸载体(而不是叶酸受体)促进正常细胞中叶酸的摄取。叶酸受体在许多人癌症中被上调，包括恶性的卵巢癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、骨髓细胞癌和肺癌，且细胞表面上叶酸受体的密度似乎随着癌症的发展而增加。
叶酸受体对肿瘤细胞的相对特异性，且特别是对晚期肿瘤细胞的相对特异性，表示叶酸受体的配体(叶酸)可以成为将化疗剂靶向肿瘤的有用的候选物。叶酸受体与叶酸受体配体-化疗药物缀合物相互作用的特异性通过某些未转化的上皮细胞和恶性转化的上皮细胞之间的叶酸受体的细胞表面表达模式的差异，进一步得到增强。在未转化的细胞中，所述叶酸受体优先在细胞的顶膜表面上表达，其面向体腔且不能接近血液中存在的试剂。然而，经转化后，细胞丧失极性且受体能接近循环系统中靶向叶酸受体的药物。因此，叶酸或叶酸衍生物可能是本发明大分子的一种有用的结合(捕获)部分。
在本发明的一些实施方案中，相互作用部分是抗体(靶向试剂)形式的肽或多肽，且可以被合成为在N或C端上具有多个邻接的组氨酸残基(聚组氨酸基序)、半胱氨酸标签、或其组合，以促进与去保护树状聚体的反应。
可以表达与N或C端，优选N端的聚组氨酸基序融合的靶向肽和抗体。可以利用所述的末端聚组氨酸基序，通过镍复合物使靶向肽与本发明造影剂的树状聚体进行缀合，其中所述镍离子作为树状聚体上或在延伸自树状聚体的连接体端上的表面基团存在，其与氨三乙酸部分络合。备选地，聚组氨酸基序可用于使用镍亲和树脂的一步纯化，且任选地通过包含肠激酶或内肽酶切割识别位点而从纯化分子中除去。所述纯化方法对本领域技术人员而言是熟知的。
更优选地，可以表达与N或C端，优选N端的半胱氨酸尾部融合的靶向肽或抗体。半胱氨酸含有高度亲核的硫醇基团，可在硫醇特异性反应基团(诸如氯代、溴代或碘代乙酰氨基团或马来酰亚胺部分)存在下利用所述硫醇基团以形成硫醚键；或在二硫化物交换反应中与反应性二硫化物部分(诸如2-吡啶基二硫代部分)形成二硫键；在任一种情况下，导致靶向多肽或抗体与树状聚体连接。这些硫醇反应性基团将在树状聚体材料中提供，通过适当的衍生化试剂(诸如，活化的卤代乙酸或者甘氨酸或3-氨基丙酸的马来酰亚胺衍生物，或者活化的3-(2-吡啶基二硫代)丙酸)与大分子的一种或多种选择性去保护的表面胺反应。
还可以表达具有半胱氨酸和组胺酸尾部组合的靶向肽或抗体。所述半胱氨酸和组胺酸尾部可以在彼此相对的端分别表达(例如，N端半胱氨酸尾部和C端组氨酸尾部)，或两者都在N或C端表达。
大分子可以进一步在各种应用中利用以修饰设备的表面，其中经修饰的设备捕获或结合具体分子、细胞或组织类型，或者蛋白、DNA或RNA靶的能力，或者修饰其非特异性生物相互作用的能力是有利的。在使用时，合适相互作用试剂的存在可以提供更有效和可重复的将大分子与诊断或医学设备组件的表面相连的方法。反之，由于大分子经限定和控制的性质，所述设备的组件将具有更好的可重复性。
所述相互作用试剂可以是下述之一反应性的化学部分、过渡金属的螯合试剂或高亲合性的的配体-受体对的配体配偶体，例如生物素-链霉亲和素或地高辛-“抗-地高辛抗体”(Mudgett-Hunter M，Margolies M N，Ju A，Haber E.J Immunol.1982；1291165-1172)。
本发明所包括的示例性大分子可以根据下式方便地示出 [第一功能部分]核心[构造单元]m[第二功能部分]p[第三功能部分]q 其中 所述的核心、构造单元和功能部分如本文所述； m表示构造单元(包括表面和表面以下的层)或大分子的总数。例如，在每层都包含具有2个氨基的构造单元的情况下，m为2-32的整数，例如2、4、8、16或32； p表示第二功能部分的数量，其中所述的第二功能部分与构造单元表面(最外)层上的氨基氮原子连接。例如，在每层都包含具有2个氨基的构造单元的情况下，p为1-64的整数，例如2、4、8、16、32或64；和 q表示第三功能部分的数量，其中所述的第三功能部分与构造单元表面(最外)层上的氨基氮原子连接。例如，在每层都包含具有2个氨基的构造单元的情况下，q为0-63的整数，例如pa dn q不大于64。
本发明包括的功能部分的具体组合在下表中表示。
第一功能部分第二功能部分第三功能部分 相互作用试剂药学活性试剂- 相互作用试剂药代动力学改性剂- 相互作用试剂药代动力学改性剂药学活性试剂 药学活性试剂(例如，蛋白)药学活性试剂(例如，药物)- 药学活性试剂药代动力学改性剂- 药学活性试剂(例如，蛋白)药代动力学改性剂药学活性试剂(例如，药物) 药代动力学改性剂药学活性试剂- 药代动力学改性剂相互作用试剂- 药代动力学改性剂相互作用试剂药学活性试剂 术语“连接体”在本文中是指起到将功能部分与表面上的氨基原子或核心氨基原子相连的作用的任何化学实体。本发明所包括的示例性的连接体包括诸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚芳基(polyaryl)、肽、烷基和烯基链、以及糖类(单糖、寡糖和多糖)之类的聚合物。
在具体的实施方案中，所述的连接体包含PEG链，例如1-100亚乙氧基重复单元，例如2-20或20-40的重复单元。
可以使用基于PEG的长链基团作为连接体部分。例如，可以按照与普通肽相似的方法来使用PEG肽，不同之处在于PEG部分提供了额外的体内稳定性以及用于载体的物质。通常，PEG肽用于将药物与抗体载体缀合，并且具有以下优点在暴露酶切除位点的同时增大抗体与药物之间的距离；降低缀合体的免疫原性；增加血液循环的时间以及增大所述复合体的溶解性。在缀合体内化并且活性药物在经过酶的作用而释放(其不必以游离药物的形式释放)以后，观察到阿霉素与多卡米星(Duocarmycin)衍生物的抗增殖作用。
在将连接体部分用于将功能部分与所述大分子的核心或表面上的胺相连的情况下，可以在连接体部分与树状聚体的合适的胺发生反应之前或者之后来进行连接体与功能部分之间的反应。
因此，可以采用多种方法来使用连接体，从而将第一功能部分与所述的核心相连。在第一种方法中，可以将连接体与所述的核心相连，而将第一功能部分与连接体相连。备选地，可以首先将连接体与功能部分相连，然后与所述的核心相连。在第三种方法中，所述的核心和功能部分这二者都可以与连接体或连接体成分相连，随后使两个连接体一起反应，从而在所述的核心和第一功能部分之间形成连接体部分。
类似地，可以采用多种方法来使用连接体，从而将第二(或者第三或第四)功能部分与所述树状聚体的表面相连。可以使连接体与所述树状聚体的表面上的氨基氮原子相连，然后将第二(或者第三或第四)功能部分与连接体相连。备选地，可以首先将连接体与功能部分相连，然后与表面上的氨基氮原子相连。如上文所述，可以将连接体部分或其成分与表面上的氨基氮原子以及第二(或者第三或第四)功能部分这二者相连，随后使两个连接体或成分发生反应，从而在所述的表面与功能部分之间形成连接体部分。
此外，可以将连接体部分引入到根据本发明的大分子的合成中，例如在构造单元之间。如上文所述，可以将连接体与表面上的氨基氮原子或形成下一层的构造单元相连，或者与这二者均相连，从而最终在构造单元之间形成连接体。
实施用于将一个或多个连接体部分引入到树状聚体或树状聚体基序上(在所述的表面上或者在核心中)的反应，从而确保在具有连接体部分的大分子的所有脱保护表面上的胺能够完全反应。通常，上述过程通过使用过量的所选连接体部分来完成。
可以在连接体与功能部分发生反应之前，使连接体与脱保护树状聚体基序或大分子发生。在其他实施方案中，与大分子相连的连接体可以反之带有保护基团，而该保护基团需要脱保护从而能够与功能分子发生反应。
优选的是，胺保护基团选自Boc，CBz，4-硝基苄氧基氨基甲酸酯(4-NO2-CBz)Fmoc，Dde，CF3CO2，2-卤代-CBz，Alloc，Me3SiEtSO2，Troc，o-NO-2PhSO2以及2，4-二硝基苯-磺酰基，并且优选的是选自Boc，CBz，4-硝基苄氧基氨基甲酸(4-NO2-CBz)，Fmoc 2-卤代-CBz，Aloc以及Me3SiEtSO2。
根据所连接的功能部分的需要，连接体可以为可切除的或者为不可切除的。可以对可切除的连接体加以设计，使得其可以被酶促切除，并且例如可用于靶向表达所述酶的组织的大分子中。备选地，酸性不稳定的连接体可以为优选的，使得与其相连的化合物可以在酸性条件(例如在缺氧组织中)下被释放。
连接体部分可以包括经选择使其主链变硬化(stiffen)的重复单元，或者可以为部分交联的，从而使主链变硬化。
连接体可以通过使该连接体中具有合适的稳定或不稳定的基团而制成可切除的或不可切除的。连接体中合适的可切除的和不可切除的基团的实例包括 i)氨基化合物连接体 酰胺键的性质在确定游离药物是否由缀合体中释放出来中是重要的。例如，药物(例如多柔比星)与载体通过酰胺键缀合形成了缀合体，该缀合体是水解稳定的，并且在体外不能发挥任何抗癌作用。通过酰胺键而直接与载体键合的药物还不容易被切除形成游离药物，但是如果载体本身是可降解的，则所述的药物可以被切除形成药物-氨基酸。由载体(通过直接的氨基化合物连接体键合)中释放出游离药物仅能够在稀少的环境中取得，其中在所述的环境下，所述的药物本身是类肽分子，并且药物与载体之间的键为可酶切的。
ii)腙、肟和亚胺连接体 对于将药物从载体上切除而言，腙、肟和亚胺键不需要酶的存在。在低pH(例如在肿瘤血管外的空间中或者在溶酶体内)环境下，所述的连接体能够在C＝N键处被水解切除。通常使用的腙、肟和亚胺连接体得自连接体的腙、肟和胺部分分别与药物活性部分的羰基(酮或醛)所进行的反应。所述的连接体还可以通过改变在C＝N键部分周围的烷基的数量，或者通过使用吸电子的部分(增大酸性不稳定性)或者供电子(降低酸性不稳定性)部分进行取代，从而减慢水解的速率。
iii)酯连接体 可以制备酸不稳定且可代谢的酯连接体。已经使用原酸酯来使PEG与结合阴离子膜载体的脂质缀合。所述的缀合体在酸性条件(pH4-6)下的稳定性取决于酯或原酸酯连接体的结构。通常，α-甲氧基-ω-{N-(2-十八烷氧基-[1，3]二氧戊环-4-基)甲基氨基}-聚乙二醇110在pH4和5下均显示出良好的稳定性，α-甲氧基-ω-{N-(2-胆甾醇氧基-[1，3]二氧戊环-4-基)甲基氨基}-聚乙二醇110在pH5下是非常稳定的，但是在pH4下会适度的不稳定，α-甲氧基-ω-{N-(2-甲基-s-十八烷氧基-[1，3]二氧戊环-5-基)-氨基}-聚乙二醇110以及α-甲氧基-ω-{N-2-(3-羟丙基-胆甾醇基氨基甲酸酯)-2-甲基-[1，3]二氧戊环-5-基-氨基}-聚乙二醇110是不稳定的。就与小分子缀合的简单酯而言，与单酯(其比二硫化物更稳定，但是比酰胺键不稳定)相比，二酯的功能性提供了更多的代谢切除位点。
iv)肽连接体 到目前为止，肽连接体是所有可切除的连接体中最通用的，这是因为可以使用氨基酸的许多不同组合来控制切除的速率和切除的酶类。但是，这些连接体具有与其作为药物和载体的缀合体用途有关的两个问题1)它们通常可以被遍布全身的非特异性肽酶切除，并由此可以在非肿瘤分布位点处形成非特异性的药物毒性；以及2)切除可以在所述的连接体位点处进行，这会形成仍保持与药物分子键合的氨基酸。这种情况可能会妨碍药物分子的化疗效果。备选地，所结合的氨基酸不会改变药物的药理学作用，但会影响其药物动力学。然而，这些切除作用可以通过在肽连接体(其与药物分子直接结合)中选择合适的氨基酸(例如脯氨酸)来控制。
通常，将组织蛋白酶B可切除的连接体设计成在药物缀合体经过溶酶体系统的内吞作用之后切除，这是因为组织蛋白酶位于溶酶体中，而在细胞质中不存在。内吞作用通常在载体(其通常为直接针对癌特异性细胞表面受体的抗体或者癌特异性细胞表面受体的配体的抗体)与细胞膜结合后被引发。
非特异性蛋白酶(即，对具体的肽序列为非特异性的蛋白酶)可以在PEG化的大分子发生充分的外渗并在肿瘤组织中累积之后由该PEG化的大分子上切除药物。
关于肽切除的速率的以下指导指出，a＞b的情况表明a的切除速率大于b的切除速率。对于用作活性药物与树状聚体末端氮之间的连接体的肽序列而言末端Cys＞非末端CysGly＞末端Gly＝末端，GlyPheGly＞末端GlyGlyGly和末端GlyGlyGlyPhe＝末端GlyProGly。
注意CysGly键由GSH还原。相对于其他肽键而言，GlyGlyGly键通常非常稳定。二肽的切割通常对具体蛋白酶是特异性的，并且可以根据肿瘤细胞内所包含的多种蛋白酶的表达来控制。
v)二硫化物连接体 二硫化物连接体是如今使用的最不稳定的连接体，并且在体外发生快速还原性切除。然而，它们的体内稳定性通常高于它们的体外稳定性。它们可以在含硫氨基酸之间通过二硫化物键或者在非肽类二硫化物键之间形成。它们还对机体内的其他亲核硫醇显示出较高的反应性，因此显示出快速的血浆清除作用。
连接体切除性的一般概述 在循环中，连接体切除性的顺序如下 二硫化物＞长链肽≥酯＞腙≥四肽(GlyGlyGlyPhe)＝三肽(GlyPheGly＞GlyGlyGly＝GlyProGly)≈或＞二肽(AlaVal、AlaPro、GlyPro、PheLeu、Val-Cys)＞戊二醛＝氨基化合物。
多种连接体的稳定性是基于它们所缀合(即，酶与连接体的易接近性)的基团、缀合体在所需活性的位点处的表现(即，细胞吸收或细胞外累积)以及缀合体的性质(即，酯对比氨基化合物)的。二硫化物缀合体与所述的当前系统的体内表现被认为是相对不可预测的。虽然长链肽更容易被蛋白酶所接近，从而被快速切除，但是它们在非特异性位点处被切除的太快，从而导致释放出不具有生物学活性的药物活性肽/氨基酸种类。
基于C＝N的连接体(腙、肟和亚胺)、酯或肽缀合体的切除至少要在多天内发生，这允许缀合体在肿瘤组织中累积。每种连接体都具有它的优点，但是酯或腙连接体是优选的。将药物活性物质与大分子相连的酯键提供了可快速切除的键，虽然这种切除并非是靶位点特异性的，但是这种切除会释放出游离的药物活性物质。与酯相比，形成腙键的缀合体在普通的循环中是更稳定的，并且在肿瘤位点处通过水解C＝N键而以更高的特异性进行切割。但是，所述的药物活性分子需要通过引入羰基部分或肼部分来进行改性，从而形成腙。
在一些实施方案中，所述的连接体部分可以包含两个反应性基团，F′和Y′，它们通过一个或多个碳或杂原子(优选的是通过烃主链)相连。所述的反应性基团F′可以是活化的，从而与反应性胺部分(例如核心上或者树状聚体基序表面层或表面以下的层上的那些)发生反应。通常，所述的反应性基团F′为羧基或其残基。其他的功能部分Y′为包含保护基团的胺，或者是对该部分进行选择使得其具有特异的反应性，该反应性与所需功能部分(其与核心上或者树状聚体基序表面层或表面以下的层连接)的反应性基团是互补的。Y′的典型实例包括胺基、羟基、硫醇、烯基或炔基、腈、卤化物、羧酸酯或叠氮基团。
除了上文所述的连接体以外，根据本发明可以使用光切除性(photocleabable)连接体。例如，可以使用光切除性异双功能连接体。光切除性异双功能连接体可以为溶于水的或者溶于有机溶剂的。光切除性异双功能连接体包含可以与胺或醇发生反应的活化的酯、以及可以与硫醇基发生反应的环氧化物基团。在酯与环氧化物基团之间为3，4-二甲氧基-6-硝基苯基光异构基团(photoisomerisationgroup)，当该光异构基团暴露于近紫外光(365nm)中时，其释放出完整形式的胺或醇。因此，当使用所述的连接体将药学活性成分与大分子相连时，该药学活性成分可以通过将靶区域暴露与近紫外光而以生物学活性或可活化形式释放。
在其他实施方案中，大分子的制备可以进一步包括对胺基和/或连接体和/或功能部分进行改性的步骤，从而有助于功能部分与胺直接连接，或者通过可切除或不可切除的连接体连接。
因此，在大分子表面或核心中的胺基可以通过改性剂基团来进行改性，从而有助于与连接体或功能部分的连接。备选地或此外，可以对连接体进行改性，从而有助于与表面或核心中的胺基相连接。
用于与功能部分连接的连接体的末端可以通过改性剂基团来进行改性，从而有助于与功能部分的连接。备选地或此外，功能基团可以通过改性剂基团来进行改性，从而有助于与连接体连接，或者直接与表面或核心中的胺基连接。
在具体的实施方案中，用于与第一功能部分和/或第一功能部分连接的核心上的第一氨基氮原子、和/或第一功能部分被进一步修饰，从而有助于第一功能部分与核心的连接。
可以对氨基(表面上的或核心中的)部分和/或连接体和/或功能部分进行改性，从而允许任一功能部分与氨基原子通过连接体相连，其中所述的功能部分通过使用能够对化学部分进行诱导的基团而衍生得到，其中所述的化学部分选自卤代乙酰胺、马来酰亚胺或其他硫醇反应性部分、反应性硫醇或可互换的二硫化物部分、脂肪族或芳香族醛、酮、烷氧基胺、肼、叠氮化物、炔、低聚组氨酸阵列和任何肽阵列、次氮基三乙酸基团、任何羧酸酯或其反应性残基(例如活化酯)；能够与有机卤化物发生反应的化学部分，例如有机甲锡烷基(organostannyl group)、丙烯酸酯、硼酸(或酯)以及通过金属催化的偶联反应而生成的有机炔(分别命名为Stille、Heck、Suzuki和Sonogashira)，能够进行酶连接(例如通过使用谷氨酰胺转移酶)的任何部分，以及天然形成化学连接的任何部分。用于衍射，从而引入改性剂的方法是本领域已知的。
更优选的是，所述的化学改性剂可以选自以下的物质 (i)马来酰亚胺
(ii)卤代乙酰胺(X＝Cl、Br和I)
(iii)酰肼
(iv)烷氧基胺
(v)3-(2-吡啶基二硫代硫代)丙酸酯
在某些实施方案中，可以对表面上或核心中的胺进行改性，从而允许通过使用包含化学部分的基团衍生的功能部分的连接，其中所述的化学部分选自卤代乙酰胺(haloacetamide)、马来酰亚胺或其他硫醇反应性部分、可反应的硫醇或可互换的二硫化物部分、醛、酮、烷氧基胺部分、肼、叠氮化物、炔、低聚组氨酸阵列、次氮基三乙酸基序。
在优选的方法中，除去所选的胺(例如核心胺)的保护基团，并使这种胺在可以形成酰胺键的条件下与卤代乙酸衍生物或马来酰亚胺衍生物(例如3-马来酰亚胺丙酸或4-马来酰亚胺丁酸)发生反应。用于将含硫醇的肽和蛋白质与所述的硫醇活性基团偶联的一般方法在Hermanson，G.T.Bioconjugate Techniques(Academic Press 1996)中有所描述，并且该文献被本文所引用。
用于将大分子与诸如肽和抗体之类的分子共价偶联的一般方法在本领域的技术水平范围内。此类方法在Hermanson，G.T，Bioconjugate Techniques(Academic Press 1996)(该文献被本文所引用)，Blatter et al，Biochem.，24；1517(1985)和Jue et al，Biochem.，175399(1978)中有所描述。用于将包含相邻组氨酸残基的肽或蛋白质与包含次氮基三乙酸基序的大分子或固体支持物(通过与镍络合)相连的方法在Hochuli et al J.Chromatogr，1987 411 177，Sigal et al Anal.Chem.1996 68 490和Gershon et al J.Immunol.Meth，1995 183 65中有所描述。上文所引述的文献均以引用方式全文并入本文。
本发明的大分子可以通过分支(devergent)或汇聚(convergent)树状聚体合成来制备。分支和汇聚的合成是本领域已知的方法。在一个实施方案中，所述的大分子通过分支合成构建，其中所加入的构造单元的最后一层(表面)可以任选地具有被保护的氨基，和/或带有氨基(其具有已经连接的功能部分，或者经改性剂改性)，和/或带有连接体部分(其用于随后连接功能部分)。
备选地，在汇聚合成方法中，包含多于一个单一构造单元的树状聚体基序或楔(wedge)可以与树状聚体的核心或表面上的氨基连接。此外，树状聚体基序的表面上的氨基可以任选地被保护，和/或可以已经具有一个或多个连接的功能基团，和/或被改性剂改性，和/或带有用于功能部分的相似部分。
本发明的另一方面还包括组合物，其包括本文所述的大分子以及其药学可接受的赋形剂、载体或佐剂。
本发明进一步提供本文所述的大分子在疗法中的用途。
待治疗的受试者包括哺乳动物受试者人、灵长类、家畜动物(包括牛、马、绵羊、猪和山羊)、宠物(包括狗、猫、兔、豚鼠)、以及捕获的野生动物。此外，还包括了诸如兔、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠之类的实验室动物，这是因为它们可以提供方便的测试系统。在本发明的某些实施方案中，还可以包括诸如鸟、两栖动物和鱼之类的非哺乳动物种类。
在某些实施方案中，根据本发明的大分子，当根据所需给药方案进行施用时，至少部分达到所需的治疗或预防效果，包括下述的一种或多种减轻正在治疗的具体障碍或病症的症状、预防或延迟正在治疗的具体障碍或病症的发作、抑制正在治疗的具体障碍或病症的进展、或者停止或完全逆转正在治疗的具体障碍或病症的发作或进展。
活性成分可以以单一剂量或一系列剂量施用。虽然单独施用活性成分是可能的，但优选将其以组合物(优选以药物组合物)与一种或多种药学可接受佐剂一起呈递。
所述组合物的制剂是本领域技术人员熟知的，例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，MackPublishing，1990。组合物可以包含任何合适的载体、稀释剂或赋形剂。这些包括所有常规的溶剂、分散介质、填充物、固体载体、包衣、抗真菌和抗细菌试剂、皮渗透剂、表面活性剂、等渗试剂和吸收剂等。将理解本发明的组合物还可以包括其他补充的生理学活性剂。
在与组合物的其他成分相容并对受试者无害方面，载体必须是药学可接受的。组合物包括适合口服、直肠、鼻内、局部(包括皮肤、口腔和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)施用。组合物可以方便地以单一剂量形式，且可以通过药学领域中熟知的任何方法制备。所述方法包括将活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体相连接的步骤。通常，组合物通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均一和紧密连接而制备，然后形成产品(如果需要的话)。
适合于口服施用的本发明的组合物可以作为各自含有预定量活性成分的不连续单元(诸如胶囊、小袋或片剂)；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水性溶液中的溶液或悬浮液；或作为水包油的液体乳液或油包水的液体乳液。
片剂可以通过任选与一种或多种助剂压制或模制制备。压制片剂可以通过下述方式制备在合适的机器中压制自由流动(free-flowing)形式的活性成分(诸如，粉末或颗粒)，任选与粘合剂(例如，惰性稀释剂)、防腐性崩解剂(例如，羧甲基淀粉钠、交联的聚乙烯吡咯烷酮、交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。可以通过在合适机器中对用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物进行压模得到模制片剂。任选地，可以对所述片剂进行包衣或划痕(scored)，且可以制备所述片剂以提供其中活性成分的慢的或受控的释放，例如以各种比例使用羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放特征。可以任选提供具有肠衣包衣的片剂从而提供在肠部分而不是胃部分中的释放。
适合于在口中局部施用的组合物包括在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)中包含活性成分的锭剂；在惰性基质(诸如，凝胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)中包含活性成分的软锭剂；和在合适的液体载体中包含活性成分的漱口水。
适合给皮肤局部施用的组合物可以包括溶于或悬浮于任何合适载体或基质的化合物，且可以为洗液、凝胶、霜剂、糊剂、软膏等形式。合适的载体包括矿物油、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、乳化蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。经皮递送的装置(诸如，贴剂)也可以用于施用本发明的化合物。
直肠施用的组合物可以是具有合适的基质(例如，可可脂、甘油、凝胶或聚乙二醇)的栓剂。
适合阴道施用的组合物可以是除了活性剂外，还含有在本领域中已知适当的载体的阴道栓剂、卫生棉条、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
适合肠胃外施用的组合物包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲溶液、杀菌剂和溶质，使得组合物与目的接受者的血液等渗透压；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。组合物可以以单一剂量或多剂量密封容器(例如，安瓿和小瓶)，且可以储存在冷冻干燥(冻干)的条件下，在即刻使用之前只需加入无菌液体载体，例如，注射用水。临时的注射溶液和悬浮液可以由之前提到类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
优选的单位剂量组合物包含如上所述的活性成分的每日剂量或单元，每日次剂量，或其适当部分。
应该理解，除了上面特别提到的活性成分外，本发明的组合物可以包含本领域中的其他常规试剂，考虑到目的组合物的类型，例如，适合口服施用的那些可以包括其他试剂，如粘合剂、甜味剂、增稠剂、调味剂、崩解剂、包衣试剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿司帕坦或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、膨润土、褐藻酸或琼脂。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃调味剂、桔子调味剂或树莓调味剂。合适的包衣试剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、虫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
可以以与其他治疗剂类似的方式给哺乳动物(包括人)施用治疗有效量的本发明的药物组合物。治疗有效量旨在包括当根据所需给药方案施用时，至少部分达到所需的如上治疗或预防效果的量。施用的剂量和施用模式取决于多种因素，包括年龄、体重、性别、患者情况和遗传因素，并在本文所述的实验测定各种剂量再进行成像后，最终由医务人员决定。通常，诊断灵敏度或治疗功效所需的剂量为约0.001至50,000μg/kg，优选在0.01至25.0μg/kg的寄主体重之间。最佳剂量将根据本文公开的内容通过经验确定。
将理解功能部分，特别是药学活性试剂可以以药学可接受的盐或前药存在。术语“前药”以其最广泛的含义使用，且包括在体内酶促或水解转变为本发明化合物的那些衍生物。所述衍生物对于本领域技术人员来说是容易发生的，例如包括，游离的硫醇或羟基被转变成酯的化合物，诸如乙酸酯、或硫酯或其中游离氨基被转变成酰胺。对本发明化合物进行酰化，例如以制备酯和酰胺前药的步骤在本领域中是熟知的，且可以包括在合适催化剂或碱的存在下用适当的羧酸、酸酐或氯化物处理所述化合物。还包括羧酸(羧基)基团的酯。合适的酯为C1-6烷基酯；C1-6烷氧基甲基酯，例如甲氧基甲基或乙氧基甲基；C1-6烷酰氧基甲基酯，例如，新戊酰氧基甲基；酞基酯；C3-8环烷氧羰基C1-6烷基酯，例如，1-环己基羰基氧乙基；1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基酯，例如，5-甲基-1，3-二氧杂环戊烯-2-酮基甲基；和C1-6烷氧羰基氧乙酯，例如，1-甲氧基羰氧乙基。氨基官能团的前药包括氨基化合物(例如，参见Adv.BioSci.，1979，20，369，Kyncl，J.等)，烯胺(例如，参见J.Pharm.Sci.，1971，60，1810，Caldwell，H.等)，席夫碱(例如，参见美国专利No 2,923,661 and Antimicrob.Agents Chemother.，1981，19，1004，Smyth，R.等)，噁唑烷(例如，参见J.Pharm.Sci，1983，72，1294，Johansen，M.等)，曼尼希碱(例如，参见J.Pharm.Sci.1980，69，44，Bundgaard，H.等and J.Am.Chem.Soc，1959，81，1198，Gottstein，W.等)，羟基甲基衍生物(例如，参见J.Pharm.Sci，1981，70，855，Bansal，P.等)和N-(酰氧基)烷基衍生物和氨基甲酸酯(例如，参见J.Med.Chem.，1980，23，469，Bodor，N.等，J.Med.Chem.，1984，27，1037，Firestone，R.等，J.Med Chem.，1967，10，960，Kreiger，M.等，美国专利No 5,684,018和J.Med Chem.，1988，31，318-322，Alexander，J.等)。其他选择和制备合适前药的常规步骤是本领域中已知的，例如描述于WO 00/23419；Design of Prodrugs，H.Bundgaard，Ed.，Elsevier Science Publishers，1985；Methods in Enzymology，42309-396，K.Widder，Ed，Academic Press，1985；A Textbookof Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen and H.Bundgaard，Eds，Chapter 5，p113-191(1991)；Advanced DrugDelivery Reviews，8；1-38(1992)；Journal of PharmaceuticalSciences，77；285(1988)，H.Bundgaard等；Chem Pharm Bull，32692(1984)，N.Kakeya等和The Organic Chemistry of Drug Desig andDrug Action，Chapter 8，pp352-401，Academic press，Inc.，1992。
合适的药学可接受的盐包括，但不限于药学可接受的无机酸(诸如，盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸)的盐，或药学可接受的有机酸(诸如，乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、反丁烯二酸、马来酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲烷磺酸、甲基苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、丹宁酸、抗坏血酸、芬地酸(fendizoic)、4-4′-亚甲基二-3-羟基-2-奈甲酸、o-(p-羟基苯甲酰)苯甲酸、4′-4″-二羟基三苯基甲烷-2-羧酸和戊酸)的盐。碱盐包括，但不限于与药学可接受的阳离子(诸如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵)形成的那些。含氮的碱性基团可以用试剂诸如低级烷基卤化物(诸如甲基、乙基、丙基和丁基氯，溴化物和碘化物)或二烷基磺酸酯(诸如二甲基磺酸酯和二乙基磺酸酯))进行季铵化。
应当理解在说明书中公开和定义的本发明延伸至文本或附图
中提到的或从文本或附图来看显而易见的各个特征中的两个或多个的所有备选组合。所有这些不同组合构成了本发明各个备选方面。
现在将参考下述实施例来更详细地描述本发明。然而应该理解，下述说明仅仅是说明性的，不应以任何方式认为是对上述本发明一般性的限制。
实施例 现在，参照以下的非限定性示意性实施例和附图来对本发明进行描述。
为了鉴定本发明所述的多种单个化合物，已经开发出命名系统。该命名法用于简化化合物的描述，并且用于替代复杂的IUPAC名称(使用该名称可能易于出错并难以解释)。
所述大分子树状聚体的命名利用了以下缩写


其他缩写如下 缩写全称 PyBop 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷基 -磷鎓 DIPEA N，N-二异丙基乙胺 TEA 三乙胺 DCC 1，3-二环己基碳化二亚胺 HOBt1-羟基苯并三唑水合物 DMAP4-(二甲基胺)吡啶 NHS N-羟基琥珀酰亚胺 TFA 三氟乙酸 DCM 二氯甲烷 EtOAc 乙酸乙酯 MeOH甲醇 MeCN乙腈 DMF 二甲基甲酰胺 DMSO二甲亚砜 PBS 磷酸缓冲盐溶液 TLC 薄层色谱 HPLC高效液相色谱 MS 质谱 MTX氨甲蝶呤 THF四氢呋喃 HPLC和MS设备的详细情况 HPLC-具有2996二极管阵列检测器(Diode Array Detector，DAD)的Waters 2795 MS-具有ESI探针的Waters ZQ4000，其中输入流被分流，从而使进入MS的量为约50μL/min。
如所述的那样，在正、负电喷雾离子化模式下获得质谱数据。使用Maximum Entropy运算法(MaxEnt)(其由MassLynx软件v4.0执行，该软件由Waters Corporation提供)对原始数据进行去卷积。在实验内容中报告的数据对应于对理论零带电状态去卷积后所观察到的数值。所有的PEG试剂获自商购来源并按收到时的状态进行使用。
实施例1 β-乳球蛋白-MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 i.苄氧基羰基氨基-3，6-氧杂-8-氨基辛烷[CBz]NEOEOEN 在20分钟内，向由2，2′-(次乙二氧基)二乙基苯胺(4.45g，30mmol)和TEA(0.7mL，50mmol)在MeCN(50mL)中形成的溶液中滴加由N-(苄氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(1.2g，5.0mmol)在MeCN(10mL)中形成的溶液。一旦该加入过程完成，便在室温下对所得的溶液搅拌过夜。真空除去乙腈，并将得到的无色残余物再次溶解于水(50mL)中。用DCM(3×25mL)洗涤所得的水性溶液，并在真空下还原合并的有机提取物。将残余物溶解于2M HCl(25mL)中，并用二乙醚(3×25mL)洗涤。然后，将水层用NaOH中和至pH 7，并在真空下蒸发至干态。将所得的残余物加入到EtOAc(25mL)中，并过滤，然后在Na2SO4上干燥。真空除去溶剂后得到无色油状物(840mg，2.9mmol，60％)。ESI MS(+ve)283[M+H]+；C14H22N2O4[M+H]+的计算m/z283.34。
ii.2-({2-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丙基氨基甲酸叔丁酯 在室温下，将由二亚丙基三胺(171g，1.32mol)在THF(200mL)中形成的溶液在1h内滴加到由叔丁基-1H-咪唑-1-羧酸酯(444g，2.64mol)在THF(1.2L)中形成的溶液中。将所得的溶液回流4h，然后在室温下搅拌过夜。在真空下除去THF，并将残余物溶解于DCM(2L)中。将DCM溶液首先用NaOH(2M，2×1L)洗涤，然后用10％w/v柠檬酸(2×1L)洗涤。将水性柠檬酸溶液用NaOH(4M，直至pH 14)碱化，再用DCM(3×600mL)萃取，然后将合并的DCM提取物真空浓缩，从而得到澄清的油状物，该油状物通过冷却而固化，从而得到白色固体(346g，80％)。
iii.HO-Su(NPN)2[Boc]2 将2-({2-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丙基氨基甲酸叔丁酯(208.5g，0.63mol)和甲苯(900mL)装入装配有顶置式搅拌器的3L容器中。一次性加入琥珀酸酐(63g，0.63mol)，并将所得溶液在60℃下加热过夜。将混合物冷却至室温，然后加入二乙醚(1×200mL)，并过滤出固体。将该固体用二乙醚(2×200mL)洗涤，然后进行干燥，从而得到白色固体(230g，91％)。
iv.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Boc]2 向由[CBz]NEOEOEN(Example li)(440mg，1.6mmol)在DMF(4mL)中形成的溶液中加入TEA(0.22mL，1.6mmol)和PNPO-Su(NPN)2-Boc2(950mg，1.8mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。真空除去溶剂，并将残余物溶解于EtOAc(250mL)中。将该溶液用盐水(125mL)、1MNa2CO3(3×50mL)、水(125mL)和1M KHSO4洗涤，再用盐水(125mL)进行二次洗涤，然后在Na2SO4上干燥。将溶液真空浓缩，并通过硅胶色谱(MeOH/DCM梯度)纯化，从而得到澄清的粘性油状物(165mg，0.23mmol，15％)。ESI MS(+ve)496[M+H]+；C24H41N5O6[M+H]+的计算m/z496.61。
v.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2.TFA]2 以将溶液的温度保持为5℃或低于5℃的速率加入经冰冷却的TFA(50mL，0.73mol)中。移走冰浴，并将该溶液在室温下搅拌5h。然后，以将混合物保持在5℃以下的速率，加入经冷却的和冰冷却的水(100mL)。真空蒸发挥发物，并将水加入到油状残余物中。然后，将该溶液真空浓缩，并用更多的水(2×100mL)重复上述过程。将所得的油状物溶解于水(50mL)中，并将所得的溶液过滤并冷冻干燥，从而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2.TFA]2(17.1g)的无色玻璃状固体。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.90(外观五重峰，J＝6.6Hz，2H)；1.99(m，2H)；2.57(m，2H)；2.65(m，2H)；2.89(t，J＝6.6Hz，2H)；3.00(t，J＝7.5Hz，2H)3.30-3.38(复合体，6H)；3.42-3.58(复合体，6H)；3.61(s，4H)；5.08(s，2H)；7.25-7.40(复合体，5H)；HPLC(亲水/TFA)Rt＝8.0min；ESI MS(+ve)496.2[M+H]+；C24H42N5O6+[M+H]+的计算m/z496.3。
vi.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[Boc]4 在室温下，将由DBL-OPNP(12.8g，17.7mmol)在DMF(80mL)中形成的溶液加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2.TFA]2(19.5g，35.4mmol)和TEA(17.9g，0.177mol)在DMF(80mL)中形成的溶液中。经过16h的搅拌后，加入由甘氨酸(1.50g，29.0mmol)在水(50mL)中形成的溶液，并持续搅拌16h。真空除去挥发物，并将残余物溶解于EtOAc(200mL)中，然后将该溶液依次用5％w/v Na2CO3(10×50mL)、盐水(50mL)和1M HCl(2×50mL)洗涤，再用盐水(50mL)洗涤。将所得的EtOAc溶液干燥(Na2SO4)，并过滤，然后真空除去溶剂，从而得到无色油状产物(20.74g)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.15-1.95(复合体，16H)；1.43(s，18H)；1.44(s，18H)；2.51(m，2H)；2.64(m，2H)；3.02(t，J 6.6Hz，4H)；3.17(ma，2H)；3.25-3.45(复合体，8H)；3.48-3.58(复合体，4H)；3.61(s，4H)；5.08(s，2H)；7.25-7.40(复合体，5H)。HPLC(疏水/TFA)Rt＝8.6min；ESI MS(+ve)1153.0[M+H]+；C56H98N9O16+[M+H]+的计算m/z1152.7。
vii.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[NH2.TFA]4 将[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[Boc]4(20.74g，18.0mmol)溶解于乙酸(50mL)中，并将经搅拌的溶液在冰浴中冷却。以将溶液的温度保持在5℃或5℃以下的速率，加入冰冷却的TFA(50mL，0.73mol)。移走冰浴，并将所得溶液在室温下搅拌5h。然后，将该溶液冷却至5℃，并以将所得混合物保持在低于5℃的速率下加入冰冷的水(100mL)中。真空蒸发挥发物，并将水(100mL)加入到残余油状物中。然后将所得的溶液真空浓缩，并用更多的水(2×100mL)重复上述过程。将油状物溶解于水(50mL)中，然后将溶液过滤并冷冻干燥，从而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[NH2.TFA]4(25.1g)，其为浅黄色玻璃状固体。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.44(m，4H)；1.70(m，6H)；1.86(m，6H)；2.50(m，2H)；2.64(m，2H)；2.99(t，J 7.2Hz，2H)；3.12-3.47(复合体，12H)；3.52-3.63(复合体，12H)；3.95(m，2H)；5.12(s，2H)；7.32-7.50(复合体，5H)；HPLC(亲水/TFA)Rt＝10.4min；ESI MS(+ve)752.4[M+H]+；C36H66N9O8+[M+H]+的计算m/z752.5。
viii.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[Boc]8 在室温下，将由DBL-OPNP(16.8g，13.9mmol)在DMF(100mL)中形成的溶液加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[NH2.TFA]4(33.98g，61.3mmol)和TEA(13.5g，0.134mol)在DMF(100mL)中形成的溶液中。搅拌11h后，加入1M的甘氨酸水性溶液(10mL)；在1h和1.5h后，再次加入等量的甘氨酸溶液。再持续搅拌2h，然后真空蒸发挥发物。将残余物溶解于EtOAc(200mL)中，并将所得溶液依次用0.5M HCl(2×50mL)，10％w/v Na2CO3(6×50mL)和盐水(50mL)洗涤。将EtOAc溶液干燥(Na2SO4)，并过滤，然后真空除去溶剂，从而得到所需的无色油状产物(26.26g，91％)。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ(ppm)1.00-1.75(复合体，112H)；2.32(m，2H)；2.47(m，2H)；2.75-3.50(复合体，32H)；3.75-3.90(复合体，4H)；4.10-4.25(复合体，2H)；5.01(s，2H)；6.38(br.m，1H)；6.60-6.95(复合体，8H)；7.25(m，1H)；7.28-7.39(复合体，5H)；7.60-8.05(复合体，7H)。HPLC(Hydrophobic/TFA)Rt＝15.2min；ESI MS(+ve)1033.8[M+2H]2+/2；C100H179N17O282+[M+2H]2+/2的计算m/z1033.7。
ix.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[NH2.TFA]8 将[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[Boc]8(24.52g，11.9mmol)溶解于乙酸(108mL)中，并将经搅拌的溶液在冰浴中冷却，直到乙酸开始冻结为止。然后，以将溶液的温度保持在10℃或10℃以下的速率下加入TFA(108mL，1.40mol)。然后，移出冰浴，并将所得溶液在室温下搅拌15h。真空蒸发乙酸和TFA，并将水(100mL)加入到残余的油状物中。然后，将溶液真空浓缩，并使用更多的水(3×100mL)重复上述过程。将所得的油状物溶解于水(100mL)中，并将溶液过滤，然后冷冻干燥，从而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[NH2.TFA]8(29.2g)的无色玻璃状固体。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.25-2.05(复合体，40H)；2.53(m，2H)；2.65(m，2H)；2.95-3.10(复合体，8H)；3.10-3.45(复合体，16H)；3.55-3.75(复合体，8H)；3.95(t，J 6.6Hz，2H)；4.06(t，J 6.6Hz，2H)；4.20-4.30(复合体，2H)；5.15(s，2H)；7.35-7.55(复合体，5H)；HPLC(亲水/甲酸盐)Rt＝8.4min；ESIMS(+ve)1265.1[M+H]+，633.0[M+2H]2+/2；C60H114N17O12+[M+H]+的计算m/z1264.9，C60H115N17O122+[M+2H]2+的计算m/z633.0。
x.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16 在室温下，将由DBL-OPNP(48.2g，87.2mmol)在DMF(120mL)中形成的溶液加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[NH2.TFA]8(25.83g，11.87mmol)和Et3N(23.9g，0.228mol)在DMF(150mL)中形成的溶液中。在搅拌19h后，加入由甘氨酸(3.27g，43.6mmol)在水(80mL)中形成的溶液。持续搅拌2h，然后真空蒸发挥发物。将残余物溶解于EtOAc(200mL)中，并将溶液依次用5％w/v Na2CO3(1×100mL；4×50mL)和1M HCl(2×50mL)洗涤，再用盐水(50mL)洗涤。将EtOAc溶液干燥(Na2SO4)，并进行热过滤，然后真空除去溶剂，从而得到所需的产物，其为黄色玻璃状固体(27.12g，59％)。在波纹滤纸上沉淀出一部分产物，然后将该材料溶解于甲醇中，再进行过滤并真空除去甲醇，从而得到额外的产物(9.02g，20％)，其为黄色泡沫。对这两部分产物进行分析，从而得到了一组相同的1H-NMR和ESI MS数据。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.00-1.75(复合体，232H)；2.51(m，2H)；2.65(m，2H)；2.75-3.50(复合体，40H)；3.50-3.65(复合体，8H)；3.90-4.50(复合体，14H)；5.08(s，2H)；7.25-7.40(复合体，5H)。HPLC(疏水/TFA)Rt＝19.7min；ESI MS(+ve)1947.3[M+2H]2+/2，1298.3[M+3H]3+/3；C188H339N33O522+[M+2H]2+/2的计算m/z1946.8，C188H340N33O523+[M+3H]3+/3的计算m/z1298.2。
xi.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16 将[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16(25.75g，6.62mmol)溶解于乙酸(122mL)中，并将经搅拌的溶液在冰浴中冷却直到乙酸开始冻结为止。移除冰浴，并小心加入TFA直到乙酸刚好溶解。将经搅拌的溶液再次放置在冰浴中，然后以将所得溶液的温度保持在10℃或10℃以下的速率加入剩余的TFA(所用的TFA的总量为108mL，1.40mol)。移除冰浴，并将溶液在室温下搅拌17h。将该溶液在冰上冷却，然后加入到冰冷的水(400mL)中，同时确保所得溶液的温度被保持在10℃以下。真空蒸发发挥成分，并将水(250mL)加入到所得的油状残余物中。然后，将所得溶液真空浓缩，并使用更多的水(2×250mL)重复上述过程。将最终的油状物溶解于水(200mL)中，并将溶液过滤，然后冷冻干燥，从而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16(27.6g)的无色玻璃状固体。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.25-1.65(复合体，40H)；1.65-2.05(复合体，48H)；2.50(m，2H)；2.62(m，2H)；2.95-3.05(复合体，16H)；3.05-3.45(复合体，24H)；3.55-3.70(复合体，8H)；3.94(t，J 6.6Hz，4H)；4.05(t，J 6.6Hz，4H)；4.15-4.30(复合体，4H)；4.30-4.40(复合体，2H)；5.13(s，2H)；7.35-7.50(复合体，5H)；HPLC(亲水/TFA)Rt＝8.9min；ESIMS(+ve)763.9[M+3H]3+/3，573.4[M+4H]4+/4；C108H212N33O203+[M+3H]3+的计算m/z764.2，C108H213N33O204+[M+4H]4+的计算m/z573.4。
xii.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32 在室温下，将ca.2-3g份的DBL-OPNP(27.66g，59.2mmol)加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16(13.83g，3.36mmol)和TEA(13.1g，0.129mol)在DMF(150mL)中形成的溶液中。在搅拌17h后，加入由甘氨酸(2.22g，29.6mmol)在水(50mL)中形成的溶液。持续搅拌3h，然后将溶液加入到经快速搅拌的水(400mL)中。从所得的沉淀出的橡胶中倒出上清液体。将橡胶状材料溶解于DMF(100mL)中，并将溶液缓慢加入到由片冰(500g)和水(500mL)形成的经充分搅拌的混合物中。通过过滤收集沉淀的白色固体，并将其再次悬浮于5％w/v Na2CO3中，进行超声波处理，再进行过滤。将所得的固体用水(4×100mL)充分洗涤，并干燥，从而得到所需的产物(22.10g，87％)，其为浅褐色粉末。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.95(复合体，472H)；2.52(m，2H)；2.65(m，2H)；2.95-3.10(复合体，30H)；3.10-3.30(复合体，30H)；3.30-3.45(复合体，12H)；3.45-3.65(复合体，8H)；3.80-4.15(复合体，16H)；4.20-4.45(复合体，14H)；5.09(s，2H)；7.25-7.40(复合体，5H)。由于不溶于HPLC流动相中，所以不能得到该产物的HPLC和ESI MS数据。相反，除去Boc基团，并由衍生的的聚三氟乙酸盐来得到这些数据。
xiii.[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32 将活性碳(28mg)上10％w/w的钯炭和甲酸铵(6mg，95mol)加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(348mg，46.13mol)在DMF(4.5mL)和水(0.5mL)中形成的溶液中。在氮气下搅拌所述混合物16小时，然后通过0.54μm的过滤器。在真空下浓缩该溶液，然后溶于甲醇中并再次在真空中浓缩得到[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32，为玻璃状固体(433mg)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(复杂，474H)；2.52(m，4H)；2.67(m，4H)；2.95-3.45(复合物，80H)；3.55(m，8H)；3.63(s，8H)；3.85-4.50(复合物，28H)。HPLC(样品不溶于LC相容的溶剂中)。在1H-NMR中CBz信号的缺失证实产物的形成。
xiv.[p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32 向[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(287mg，0.038mmol)在DMF(3ml)中形成的溶液中加入DIPEA(20uL，0.116mmol)，然后在搅拌下加入4-硝基苯甲基氯甲酸酯(12mg)。在氮气下，室温搅拌所述溶液16小时。真空下除去挥发物得到所需产物(294mg)。TLC(10％MeOH/DCM)证实反应完全。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(复合物，474H)；2.52(m，4H)；2.67(m，4H)；2.95-3.45(复合物，80H)；3.55(m，8H)；3.63(s，8H)；3.85-4.50(复合物，28H)；7.55(d，2H)；8.25(d，2H)。HPLC(样品不溶于LC相容的溶剂中)。
xv.[p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32 在室温下，向[p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(294mg，0.038mmol)在DCM(4mL)中形成的经搅拌的溶液中加入TFA(1mL)。室温下搅拌所述溶液16小时。在真空中除去挥发物，并将残余物溶于1∶1 MeCN/H2O(5mL)中。在真空下除去溶剂。重复该步骤两次。用将残余物与乙醚(20mL)一起研磨，通过慢慢倒出(decanting)除去溶剂。在真空下干燥残余物得到产物(354mg)，为白色泡沫状状物。HPLC(亲水/TFA)Rt＝5.59min；ESI MS(+ve)4386[M+H+]；C204H399N66O38+[M]+的计算m/z4384.77。
xvi.[p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 向m-dPEG570-NHS(1.24g，1.805mmol)在DMF(0.5mL)中形成的经搅拌的溶液中逐滴加入[p-NO2-CBz]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32(410.4mg，0.052mmol)和TEA(572μL，4.103mmol)在DMF(0.5mL)形成的溶液。在氮气下，室温搅拌所述溶液16小时。在真空下除去挥发物并将残余物溶于50mL水中，在Centramate(10KDa膜，100mL样品池(sample reservoir))上通过切向流过滤进行纯化。将滞留物浓缩至干得到所需产物(906mg，78％)，为油状残余物。HPLC(亲水/TFA)Rt＝10.76min。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(复合物，Lys(3×CH2)，184H)；2.20-2.70(复合物，Lys(N-CH2)，64H)；3.0-3.20(复合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(复合物，PEG-CH2，1536H)；4.10-4.40(宽的单峰，36H)；7.60(d，J＝8.38Hz，ArH，2H)；8.20(d，J＝8.33Hz，ArH，2H)。
xvii.[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 该反应按与实施例1xiii相同的方式进行；使用[p-NO2-CBz]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(347mg，0.0153mmol)和甲酸铵(68mg，1.08mmol)，活性碳上10％w/w的钯(320mg)在DMF(6.4mL)和水(0.6mL)中。在反应完成后，产生玻璃状固体产物(310mg，90％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(复合物，Lys(3×CH2)，184H)；2.20-2.70(复合物，Lys(N-CH2)，64H)；3.0-3.20(复合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(复合物，PEG-CH2，1536H)；4.10-4.40(宽的单峰，36H)。HPLC(亲水/TFA)Rt＝10.69min；ESI MS(+ve)22，472[M+4H+]；C1028H1995N65O450+[M]+的计算m/z22，468.01。
xviii.MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 向MAL-PEG1100-NHS(1.25mg，0.895μmol)在DCM(0.5mL)中形成的经搅拌的溶液中逐滴加入[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(20.1mg，0.895μmol)和TEA(5μL)在DCM(0.5mL)中形成的溶液中。在氮气下，室温搅拌所述溶液16小时。在减压下除去挥发物，使用产物(21mg)，无需进一步纯化。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(复合物，Lys(3×CH2)，184H)；2.20-2.70(复合物，Lys(N-CH2)，64H)；3.0-3.20(复合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(复合物，PEG-CH2，1628H)；4.10-4.40(宽的单峰，36H)；6.82(br s，MAL，2H).HPLC(亲水/TFA)Rt＝10.72min。
xix.β-乳球蛋白-MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 将MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(13.0mg，10当量)在PBS缓冲溶液(pH 7.64，250mL)中形成的溶液加入牛β-乳球蛋白B(1mg，pH 7.64，250mL)的PBS缓冲溶液中。然后振荡混合物16小时(600rpm，26℃)并通过SDS-PAGE(12％Tris-Glycine Gel，200mV，60min)进行分析，用考马斯亮蓝和BaI2染色。由用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE观察到所需的树状聚体-蛋白结构，并且其出现在相对蛋白MW标记的适当MW处。
实施例2 β-乳球蛋白-NHCO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 i HO2C-(CH2)2CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 向琥珀酸酐(5mg，0.047mmol)在DMF(0.5mL)中形成的经搅拌的溶液中加入[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(实施例1xvii)(53mg，2.36μmol)和TEA(14μL)在DMF(0.5mL)中形成的溶液，室温下搅拌所述溶液16小时。在真空下除去挥发物，并将残余物溶于水中，在Centramate(10KDa膜)上通过切向流过滤进行纯化。将滞留物浓缩至干得到所需产物(69mg)，为油状残余物。HPLC(亲水/TFA)Rt＝10.83min.1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(复合物，Lys(3×CH2)，184H)；2.20-2.70(复合物，Lys(N-CH2)+琥珀酰(CH2)2，68H)；3.0-3.20(复合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(复合物，PEG-CH2，1536H)；4.10-4.40(宽的单峰，36H)。
ii t-BuO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 在0℃下，向HO2C-(CH2)2CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(30.6mg，1.36μmol)，H2N-PEG570-CO2t-Bu(22mg，0.033mmol)和TEA(8μL)在DCM(0.5mL)中形成的经搅拌的溶液中加入DCC(6.2mg，0.03mmol)和HOBt(4.6mg，0.034mmol)在DMF(0.5mL)中形成的溶液中。在0℃下，搅拌所述溶液10分钟，然后使其到达室温并在氮气下再搅拌16小时。在真空下除去挥发物并将残余物溶于水中，在Centramate(10KDa膜)上通过切向流过滤进行纯化。将滞留物浓缩至干得到所需产物(29.5mg)，为油状残余物。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(复合物，Lys(3×CH2)+tBu，193H)；2.20-2.70(复合物，Lys(N-CH2)+琥珀酰(CH2)2，68H)；3.0-3.20(复合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(复合物，PEG-CH2，1582H)；4.10-4.40(宽的单峰，36H)。
iii HO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 在室温下，向t-BuO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(29.5mg，1.27μmol)在DCM(2ml)中形成的经搅拌的溶液中加入TFA(0.5ml)；室温下搅拌所述溶液2小时。将反应混合物浓缩至干，并将残余物溶于5mL 1∶1 MeCN/H2O中，然后在真空下除去溶剂。将其溶于1∶1 MeCN/H2O中，然后完全除去溶剂，重复两次以上(33.2mg)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.90(复合物，Lys(3×CH2)，184H)；2.20-2.70(复合物，Lys(N-CH2)+琥珀酰(CH2)2，68H)；3.0-3.20(复合物，58H)；3.35(s，PEG-OMe，96H)；3.40-3.90(复合物，PEG-CH2，1582H)；4.10-4.40(宽的单峰，36H)。
iv NHS-CO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 向HO2C-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(33.2mg，1.43μmol)和DIPEA(11μL，0.063mmol)在DCM(2ml)中形成的经搅拌的溶液中加入固体状的DCC(12.2mg，0.059mmol)，室温下搅拌所述溶液10分钟。加入于DCM(0.5ml)中的NHS(5.2mg，0.045mmol)，并在氮气下，室温搅拌所述溶液16小时。在真空下除去挥发物，将DCM(2mL)加入到残余物中，通过4.5μm的过滤器过滤悬浮液，在真空下除去溶剂(31.7mg)。使用该材料无需进一步纯化。
v.β-乳球蛋白-NHCO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 在PBS缓冲溶液(pH 7.64，250mL)中的NHS-CO-PEG570-NHCO(CH2)2-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(相对蛋白为10当量)与牛β-乳球蛋白B(pH 7.64)反应。振荡所述反应混合物16小时(600rpm，26℃)，并通过SDS-PAGE(12％ Tris-Glycine Gel，200mV，60min)进行分析，用考马斯亮蓝和BaI2染色。由用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE观察到所需的树状聚体-蛋白结构，并且其出现在相对蛋白MW标记的适当MW处。
实施例3 HSA-MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32 在PBS缓冲溶液(pH 7.64，250mL)中的MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[PEG570]32(实施例1xviii)(相对蛋白为10当量)与人血清白蛋白(pH 7.64)反应。振荡所述反应混合物16小时(600rpm，26℃)，并通过SDS-PAGE(12％Tris-Glycine Gel，200mV，60min)进行分析，用考马斯亮蓝和BaI2染色。由用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE观察到所需的树状聚体-蛋白结构，并且其出现在相对蛋白MW标记的适当MW处。
实施例4 NDP-2-MSH-CH2CO NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4 i.HO-Su(NPN)2[CBz]2 在65℃下加热(NPN)2[CBz]2(20.0g，0.05mol)和琥珀酸酐(6.0g，0.06mol，1.2当量)于甲苯(180mL)中的混合物16小时。冷却反应至室温，过滤白色固体并用甲基叔丁醚(3×100mL)洗涤得到高产率的产物23.54g(94％)。
ii.PNPO-Su(NPN)2[CBz]2 在室温下，向4-硝基苯酚(1.91g，13.7mmol)和HO-Su(NPN)2[CBz]2(13.7mmol)于EtOAc(150mL)的经搅拌的溶液中加入DCC(2.97g，14.4mmol)在EtOAc(50mL)中形成的溶液。在室温下搅拌混合物过夜，过滤并用K2CO3(1.0M)、盐水1∶1(3×300mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩，得到7.80g PNPO-Su(NPN)2[CBz]2。
iii.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][CBz]2 向[Boc]NEOEOEN(3g，12mmol)在1∶1 DMF/DMSO(60mL)中形成的溶液中加入PNPO-Su(NPN)2[CBz]2(7.5g，12mmol)在DMSO(30mL)中形成的溶液和TEA(3.4mL，240mmol)。室温下搅拌所述溶液15小时。在真空下浓缩所述溶液并重新溶于水(300mL)中。用EtOAc(3×300mL)洗涤水性溶液并用Na2SO4干燥合并的有机洗涤液。真空下除去溶剂，通过硅胶色谱(3％MeOH/DCM)纯化原油得到[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][CBz]2，为无色粘性油(8.2g，93％)。HPLC(亲水/TFA)Rt＝9.20min；ESIMS(+ve)730.3[M+1H]；C37H55N5O10)的计算m/z729.9。
iv.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2]2 向[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][CBz]2(500mg，0.68mmol)在三氟乙醇(13mL)中形成的溶液中加入碳上的10％w/w钯(723mg，34mmol)。在氢气气氛在大气压下搅拌悬浮液15小时。然后通过0.2μm的过滤器过滤悬浮液，在真空下浓缩滤液得到[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2]2(250mg，80％)，为无色的油。
HPLC(亲水/TFA)Rt＝4.50min.ESI MS(+ve)462.5[M+H+]；C21H43N5O6的计算m/z461.6。
v.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Boc] 在室温下，向MeOGly.HCl(12.56g，0.11mol)和DMF(200mL)的经搅拌悬浮液中缓慢加入TEA(42mL，0.30mol)。将活性酯，PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(50.15g，0.10mol)以2-3g的份数加入到所述悬浮液中。在室温下搅拌嫩黄色混合物18小时。在真空下除去挥发物并将所得的残余物在EtOAc(200mL)，10％ Na2CO3(100mL)和水(175mL)之间分配。依次用5％ Na2CO3(4×200ml)、0.25M HCl(3×50mL)和盐水(1×50mL)洗涤有机层，干燥(MgSO4)，过滤并浓缩得到无色油状产物(44.39g，98％)。HPLC(疏水/甲酸酯)Rt＝5.22min。ESI MS(+ve)452.02[M+H]+；C22H33N3O7的计算m/z451.52。
vi.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-NH2.TFA] 向MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Boc](43.4g，96.03mmol)在乙酸(150mL)中形成的冷冻的经搅拌的溶液中分批加入无水TFA(总共170mL)。在室温下搅拌反应5小时。在减压下除去挥发物；用甲醇(5×200mL)共沸来除去残余的TFA和乙酸。得到浅黄色的油状产物(46.04g)。HPLC(亲水/甲酸酯)12.33min；ESI MS(+ve)352[M+H]+；C17H25N3O5的计算m/z351.40。
vii.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2 在室温下，向MeO-GlyLys[ε-CBz][α-NH2.TFA](96mmol)在DMF(200mL)中形成的经搅拌的溶液中加入TEA(33.5mL，0.24mol)，然后加入DBL-OPNP(49.4g，0.106mol)。在室温下搅拌所述溶液17小时。将甘氨酸(3.98g，53mmol)在水(50mL)中形成的溶液加到粗反应产物中并继续搅拌18个小时。加入水(200mL)，并通过过滤收集黄色沉淀，然后重悬浮于5％Na2CO3(200mL)；搅拌1.5小时。通过过滤收集粗产物并重悬浮于水(3×200mL)中，通过过滤收集固体，空气干燥得到细的黄色粉末状的产物(61.07g，94％)。HPLC(疏水/甲酸酯)Rt＝7.90min；ESI MS(+ve)680.15[M+H]+；C33H53N5O10的计算m/z679.82。
viii.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][NH2.TFA]2 在0℃下，向MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2(4g，7.36mmol)在乙酸(15mL)中形成的经搅拌悬浮液中逐滴加入TFA(15mL)。使混合物回温至室温，并在室温下搅拌过夜。除去溶剂并将残余物溶于水(100ml)中，并过滤。冻干滤液得到无色的油(4.4g)。HPLC/(亲水/TFA)Rt＝5.03min；ESI MS(+ve)＝480[M+H+]；C23H37N5O6的计算m/z479.5。
ix.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2 向MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][NH2.TFA]2(735mg，1.04mmol)在DMF(无水，20ml)中形成的经搅拌悬浮液中加入TEA(1.5mL，5当量/胺)，然后加入m-dPEG570-NHS(1.5g，1.05当量/胺)在DMF(10mL)中形成的溶液。室温下搅拌混合物过夜。除去所述溶剂并在硅胶柱(0.063-0.04mm，洗脱液7％-30％MeOH/DCM)上纯化残余物得到所需产物(1.0g)，为无色的油状物。HPLC(亲水/TFA)Rt＝7.87min；ESI MS(+ve)828[M+2xNH4]2+，811[M+2H]2+，541[M+3H]3+；C75H137N5O32的计算m/z1620.9。
x.HO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2 向MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2(1.0g，0.62mmol)于THF(20mL)中形成的经搅拌悬浮液中加入1M LiOH(2mL)。在室温下搅拌混合物3小时；然后用1M HCl酸化至pH 6。除去溶剂，并将残余物溶于水中，冻干得到无色固体状产物。HPLC(亲水/TFA)Rt＝7.61min；ESI MS(+ve)821[M+(2xNH4)]2+，804[M+2H]2+，536[M+3H]3+；C74H135N5O32的计算m/z1606.9。
xi.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4 在0℃下，向[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2]2(实施例4iv)(100mg，0.22mmol)和HO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2(700mg，0.44mmol)在DMF(无水，9mL)中形成的经搅拌的溶液中加入PyBop(250mg)和DI PEA(160μL)。在室温下搅拌混合物过夜。在真空下除去挥发物，得到残余物，所述残余物在硅胶柱(0.063-0.04mm，洗脱液10％-30％ MeOH/DCM)上进行色谱分析得到600mg无色油状产物。HPLC(亲水/TFA)Rt＝9.18min；ESI MS(+ve)886[M-Boc+4H]4+，729[M+5H]5+，709[M-Boc+5H]5+；使用变换计算对数据进行去卷积得到3638.9[M+H]+；C169H309N15O68的计算m/z3639.3。
xii.[TFA.NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4 将[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4悬浮于20％TFA/DCM中，并室温下搅拌1小时。除去挥发物得到产物。
xiii.[ClCH2CO]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4 向[TFA.NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4在缓冲溶液(100mL 0.1M Na2HPO4；100mL 0.1M HCl，pH～8.5)中形成的溶液中加入氯乙酰氯。搅拌2小时，通过HPLC/MS可检测到产物[ClCH2CO]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4。
xiv.NDP-2-MSH-CH2CO NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4 向过量的巯基-NDP-α-MSH(巯基-Ser-Tyr-Ser-Nle-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2)加入新鲜制备的[ClCH2CO]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4在0.1M正磷酸氢钠/0.1M HCl(pH 8.5)缓冲溶液中形成的溶液。在室温下搅拌16小时后，通过HPLC-MS应该在反应混合物中检测到缀合的产物。
实施例5 [生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]32 i.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32 将PyBOP(20mg，0.04mmol)加入到[NH2]EOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(实施例1xiii)(109mg，0.015mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(3ml)中形成的经搅拌的溶液中。逐渐加入生物素-NHS酯(13mg，0.38mmol)和DIPEA(40μL，0.23mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(2mL)中形成的溶液。在室温下搅拌混合物16小时。将反应混合物到入MeCN(300mL)中，形成沉淀。通过过滤收集沉淀，并在真空中干燥得到白色固体状的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(119mg，106％)。HPLC(疏水/TFA)Rt＝10.9min；ESI MS(+ve)m/z＝1910.02(M-4H)4+；1528.33(M-5H)5+.使用最大熵计算对数据进行去卷积得到MW＝7638[M+]；C366H665N67O100S(H form)[M+]的计算m/z7636.76。
ii.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32 将TFA和DCM(1∶1)(2mL)的溶液逐滴加入到[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(56mg，0.007mmol)在DCM(3mL)中形成的经搅拌悬浮液中。室温下搅拌混合物14小时。在减压下除去溶剂并将残余物与乙醚(3×10mL)一起研磨。在真空下干燥产物得到白色固体状的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32。HPLC(亲水/TFA)Rt＝4.35min；ESI MS(+ve)m/z＝1478.96(M-3H)3+；1109.38(M-4H)4+；887.70(M-5H)5+；739.84(M-6H)6+。使用最大熵计算对数据进行去卷积得到MW＝4433[M+]，(H form)；C206H409N67O36S(H form)[M+]的计算m/z4433.01。
iii.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]32 将PyBOP(0.26g，0.50mmol)加入到[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32(56mg，0.007mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(6mL)中形成的经搅拌的溶液中。逐渐加入HOCOCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2(0.21g，0.53mmol)和DIPEA(0.4mL，2.30mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(5mL)中形成的溶液。室温下搅拌混合物16小时。将反应混合物倒入水(0.2L)中并过滤。在Centramate(2K膜，0.5L样品池)上通过切向流过滤进行纯化。在最初用Milli-Q水(5L)洗涤后，用两等分试样的1M Na2SO4(100mL)洗涤滞留物，期间通过Milli-Q水洗涤(1L)隔开，然后继续过滤直至滤液pH为中性(约5L)。在真空下浓缩滞留物，冷冻干燥得到白色固体状的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]32(80mg，68％)。HPLC/MS(离子配对)Rt＝8.74min；ESI MS(-ve)m/z＝1544.32(M-10H)10-；1403.91(M-11H)11-；1286.51(M-12H)12-；1187.62(M-13H)13-；1102.86(M-14H)14-；1029.21(M-15H)15-；964.96(M-16H)16-；907.83(M-17H)17-；857.56(M-18H)18-；812.29(M-19H)19-；771.62(M-20H)20-；734.82(M-21H)21-；701.41(M-22H)22-；670.74(M-23H)23-；642.88(M-24H)24-；617.15(M-25H)25-；593.49(M-26H)26-；571.50(M-27H)27-。使用最大熵计算对数据进行去卷积得到MW＝15453[M-](H form)；C590H665N67O292S65(H form)[M-]的计算m/z15451。
实施例6 [生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[CO-3，5-Ph(SO3Na)2]32 将PyBOP(0.23g，0.44mmol)加入到[生物素][NEOEOEN(Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32(实施例5ii)(48mg，0.006mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(6mL)总形成的经搅拌的溶液中。逐渐加入4-磺基苯甲酸(0.12g，0.60mmol)和DIPEA(0.3mL，1.72mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(5mL)形成的溶液。在室温下搅拌混合物16小时。将反应混合物倒入水(0.2L)中并过滤。在Centramate(1K膜，0.5L样品池)上通过切向流过滤进行纯化。在最初用Milli-Q水(5L)洗涤后，用两等分试样的1M Na2CO3(100mL)洗涤滞留物，期间通过Milli-Q水洗涤(1L)隔开，然后继续过滤直至滤液pH为中性(约5L)。在真空下浓缩滞留物，冷冻干燥得到白色固体状的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]16[Ph-3，5-(SO3Na)2]32(103mg，123％)。HPLC/MS(离子配对)Rt＝8.60min；ESI MS(-ve)m/z＝919.70(M-14H)14-；858.30(M-15H)15-；804.56(M-16H)16-；757.08(M-17H)17-；715.01(M-18H)18-；677.48(M-19H)19-；643.61(M-20H)20-。使用最大熵计算对数据进行去卷积得到MW＝12889[M-](H form)；(C430H537N67O260S65)(H form)[M-]的计算m/z12888。
实施例7 [生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]16 i.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16 将PyBOP(20mg，0.04mmol)加入到[NH2]EOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16(实施例7i)(55mg，0.015mmol)在DMF(1∶1)(3mL)中形成的经搅拌的溶液中。逐渐加入生物素-NHS酯(13mg，0.38mmol)和DIPEA(20μL，0.12mmol)在DMF(1mL)中形成的溶液中。室温下搅拌混合物16小时。将反应混合物倒入MeCN(0.2L)中，形成沉淀。通过过滤收集沉淀并在真空下干燥得到白色固体状的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16(34mg，58％)。HPLC(疏水/TFA)Rt＝8.27min；ESI MS(+ve)m/z＝1328.87[(M-3H)3+]；996.98[(M-4H)4+].使用变换计算对数据进行去卷积得到MW＝3984[M+]；C190H345N35O52S(H form)[M+]的计算m/z3984.10. ii.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16 将TFA和DCM(1∶1)(2mL)的溶液逐滴加入到[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16(34mg，0.009mmol)在DCM(3mL)中形成的经搅拌悬浮液中。在室温下搅拌混合物14小时。在减压下除去溶剂并将残余物与乙醚(3×10mL)一起研磨。在真空下干燥产物得到白色固体状的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16。HPLC(亲水/TFA)Rt＝4.27min；ESI MS(+ve)m/z＝1191.87[(M-2H)2+]；795.03[(M-3H)3+]；596.44[(M-4H)4+]；477.23[(M-5H)5+]。使用最大熵计算对数据进行去卷积得到MW＝2382[M+](H form)；C110H217N35O20S(H form)[M+]的计算m/z2382.22。
iii.[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]16 将PyBOP(0.16g，0.31mmol)加入到[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16(20mg，0.009mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(4mL)中形成的经搅拌的溶液中。逐渐加入HOCOCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2(0.12g，0.28mmol)和DIPEA(0.2mL，1.15mmol)在DMF/DMSO(1∶1)(2ml)中形成的溶液。在室温下搅拌混合物16小时。将反应混合物倒入水(0.25L)中并过滤。在Centramate(2K膜，0.5L样品池)上通过切向流过滤进行纯化。在最初用Milli-Q水(5L)洗涤后，用两等分试样的1M Na2CO3(100mL)洗涤滞留物，期间通过Milli-Q水洗涤(1L)隔开，然后继续过滤直至滤液pH为中性(约5L)。在真空下浓缩滞留物，冷冻干燥得到白色固体状的[生物素]NEOEOEN[(Su(NPN)2][Lys]8[COCH2O-3，6-Naph(SO3Na)2]16(69mg，94％)。HPLC/MS(离子配对)Rt＝10.8min；ESI MS(-ve)m/z＝1314.25(M-6H)6-；1126.54(M-7H)7-；985.30(M-8H)8-；875.91(M-9H)9-；787.96(M-10H)10-；716.35(M-11H)11-；656.60(M-12H)12-；605.97(M-13H)13-；562.90(M-14H)14-；525.03(M-15H)15-。使用最大熵计算对数据进行去卷积得到MW＝7891[M-](H form)；C302H345N35O148S33(H form)[M-]的计算m/z7891.39.CE(pH 9)；Rt＝8.00min75.5％的纯度。
实施例8 [p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[Su(NPN)2(PEG1100)(MTX-α-OtBu)]4 在0℃下，向Su(NPN)2(PEG1100)(MTX-α-OtBu)(75mg，41.2μmol)和[p-NO2-CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[NH2.TFA]4(8.4mg，8.2μmol)在DMF(3.0mL)中形成的经搅拌的混合物中加入PyBop(23mg，44μmol)和DIPEA(29μL，0.16mmol)。将混合物在0℃下放置30分钟，然后回温至室温过夜。除去溶剂并通过PREP HPLC(Waters XTerra Prep RP18 10μm，19×250mm，5-45％ ACN/H2O，然后保持15-55min，0.1％TFA，Rt＝58min)纯化粗产物得到40mg(74％)所需产物，为粘性黄色油状物。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.48(s，OtBu，36H)，1.54-1.95(复合物，Lys(3×CH2)+NPN(2×CH2)，32H)；2.05-2.32(复合物，Glu(CH2)，8H)；2.34-2.78(复合物，琥珀酰(CH2)2+PEG-CH2+Glu(CH2)，36H)；3.06-3.48(复合物，NPN(4×CH2)+PEG-Me+N-Me+Lys(N-CH2)，68H)；3.50-4.06(复合物，PEG-OCH2，388H)；4.20-4.28(复合物，Lys(α-CH)，2H)，4.40-4.48(复合物，Glu(α-CH)，4H)；4.94(s，N-CH2，8H)；5.20(s，CBz-CH2，2H)；6.87(d，8.7Hz，MTX，8H)；7.58(d，8.4Hz，p-NO2-CBz，2H)；7.78(d，8.7Hz，MTX，8H)；8.20(d，8.4Hz，p-NO2-CBz，2H)；8.68(s，MTX，4H)。HPLC(亲水/TFA)Rt＝9.58min；ESI MS(+ve)8,019[M+H+]；C372H645N54O134[M+H+]的计算m/z 8,018.38。
实施例9 [CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[Su(NPN)2(PEG570)(MTX-α-OtBu)]8 在0℃下，向Su(NPN)2(PEG570)(MTX-α-OtBu)(36mg，27.8μmol)和[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[NH2.TFA]8(6.0mg，2.8μmol)在DMF(2.0mL)中形成的经搅拌的混合物中加入PyBop(16mg，30.6μmol)和DIPEA(16μL，89μmol)。将混合物在0℃下放置30分钟，然后回温至室温过夜。除去溶剂并通过PREP HPLC(Waters XTerra Prep RP18 10μm，19×250mm，5-45％MeCN/H2O，然后保持15-55min，0.1％TFA，Rt＝58min)纯化粗产物得到17mg(53％)所需产物，为粘性黄色油状物。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.16-1.56(复合物，Lys(3×CH2)+NPN(2×CH2)+OtBu，150H)；2.02-2.27(复合物，Glu(CH2)，16H)；2.30-2.75(复合物，琥珀酰(CH2)2+PEG-CH2+Glu(CH2)，68H)；3.00-3.42(复合物，NPN(4×CH2)+PEG-Me+N-Me+Lys(N-CH2)，134H)；3.43-3.88(复合物，PEG-OCH2，380H)；4.04-4.32(复合物，Lys(α-CH)，7H)，4.34-4.50(复合物，Glu(α-CH)，8H)；4,91(s，N-CH2，16H)；5.03(s，CBz-CH2，2H)；6.83(d，8.7Hz，MTX，16H)；7.28(br s，CBz，5H)；7.75(d，8.7Hz，MTX，16H)；8.64(s，MTX，8H)。HPLC(亲水/TFA)Rt＝9.41min；ESI MS(+ve)11，477.42[M+H+]；C540H890N105O164[M+H+]的计算m/z 11,477.44。
备选/关键中间体 实施例10 [CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32 将[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(实施例1xii)(389mg，51.6μmol)溶于乙酸(1.9mL)中并在冰浴中冷却搅拌的溶液直至乙酸开始冻结。除去冰浴并小心加入TFA直至所述乙酸恰好融化。再次将搅拌的溶液置于冰浴中并加入剩下的TFA(所使用的TFA的总量为1.9mL，24.8mmol)。除去冰浴并在室温下搅拌所述溶液21小时。在真空下蒸发TFA和乙酸并将水(5mL)加入到油残余物中。然后在真空下浓缩所述溶液并用更多的水(2×5mL)重复该步骤。将最终的油溶于水(5mL)中，过滤溶液并冷冻干燥得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32(397mg，96％)，为无定形白色固体。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.20-1.65(复合物，92H)；1.65-1.85(复合物，62H)；1.85-2.05(复合物，30H)；2.51(m，2H)；2.61(m，2H)；2.95-3.10(复合物，34H)；3.10-3.45(复合物，38H)；3.55-3.70(复合物，8H)；3.94(t，J＝6.6Hz，8H)；4.05(t，J＝6.6Hz，8H)；4.15-4.28(复合物，8H)；4.28-4.39(复合物，6H)；5.00(s，2H)；7.32-7.49(复合物，5H)；HPLC(亲水/TFA)Rt＝8.8min；ESI MS(+ve)1447.8[M+3H]3+/3，1086.1[M+4H]4+/4，868.9[M+5H]5+/5，724.3[M+6H]6+/6；C204H404N65O363+[M+3H]3+的计算m/z1447.1，C204H405N65O364+[M+4H]4+的计算m/z1085.6，C204H406N65O365+[M+5H]5+的计算m/z868.6，C204H407N65O366+[M+6H]6+的计算m/z724.0。
实施例11 [CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]2[Boc]4 向[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Boc]2(11.8g，17mmol)于乙酸(25mL)的溶液中加入TFA(25mL)。搅拌所述溶液10个小时然后用水(100mL)淬灭。在真空下除去溶剂并将所得的油状残余物溶于水(50mL)中，通过4.5μm的过滤器过滤，然后冷冻干燥。在DMF(100mL)中溶解冷冻干燥的材料并向该溶液中加入TEA(19mL)和PNPO-Su(NPN)2-Boc2(20.7g，21mmol)在DMF(100mL)中形成的溶液。然后室温下搅拌所述溶液过夜。然后向所述溶液中加入甘氨酸(2g)在水(120mL)中形成的溶液。在室温下搅拌合并的溶液16个小时。在真空下除去溶剂并将所得黄色沉淀重新溶于EtOAc(200mL)中。然后用水(50mL)，0.5M HCl(50mL)和1M Na2CO3(4×50mL)洗涤该溶液。然后用Na2SO4干燥所述有机层并在真空下除去溶剂。然后通过硅胶色谱纯化所得的黄色油得到澄清的粘性油(18.5g，14mmol，82％)。ESI MS(+ve)562[(M+2H+-2Boc)/2]；C64H111N11O18[M+H]的计算m/z1323.63。
实施例12 [CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]4[Boc]8 向[CBz]NEOEOEN[Su(NPN2]2[Boc]4(12.8g，9.7mmol)在乙酸(50mL)中形成的溶液中加入TFA(50mL)。在室温下搅拌该溶液过夜，然后真空除去溶剂得到澄清的粘性油。将所述油溶于DMF(75mL)并向该溶液中加入TEA(28mL)和PNPO-Su(NPN)2-[Boc]2(25.7g，47mmol)的浆液。室温下搅拌所述反应混合物过夜。向所述反应混合物中加入甘氨酸(2g)在水(60mL)中形成的溶液。搅拌合并的溶液16个小时。真空下除去溶剂并将所得的黄色沉淀重新溶于EtOAc(400mL)。然后用水(50mL)、0.5M HCl(2×50mL)和1M Na2CO3(5×50mL)洗涤所述溶液。然后用Na2SO4干燥有机层并在真空下除去溶剂得到黄色泡沫状物(24g，9.3mmol，96％)。然后通过硅胶色谱(MeOH/DCM梯度)纯化该材料的一部分(22.5g)得到白色泡沫状物(15g，5.8mmol，66％)。ESI MS(+ve)1289[(M+2H+)/2]；760[(M+3H+-3Boc)/3]；C124H219N23O34[M+H]的计算m/z2577.3。
实施例13 [CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]8[Boc]16 向1∶1乙酸/TFA(100ml)溶液中加入[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]4[Boc]8(12g，4.7mmol)。室温下搅拌反应混合物20个小时。真空下除去溶剂并在DMF(150mL)中重新溶解澄清的残余物。向该溶液中加入TEA(42mL)和在DMF(75mL)的PNPO-Su(NPN)2-Boc2(24.9g，45mmol)的浆液。室温下搅拌反应混合物过夜。真空下除去溶剂并将所得的黄色沉淀重新溶于EtOAc(2L)中。然后用盐水(2×50mL)、1M Na2CO3(2×1mL)洗涤该溶液。真空下除去溶剂得到黄色的油。ESI MS(+ve)1695[(M+3H+)/3]；1272[(M+4H+)/4]；1018[(M+5H+)/5]；C244H435N47O66[M+H]的计算m/z5084.3。
权利要求
1.一种大分子，其包含
(i)核心部分，其具有用于与第一功能部分连接的第一氨基氮原子，以及用于与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元连接的至少两个其他的氨基氮原子；
(ii)第一功能部分，其通过所述的第一氨基氮原子与所述的核心部分连接；
(iii)至少一层赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元，其最外层具有用于与一个或多个第二功能部分连接的表面氨基氮原子，这些所述的层通过所述的核心部分的至少两个其他氨基氮原子而与所述的核心部分连接；以及
(iv)一个或多个第二功能部分，其与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元的最外层的表面氨基氮原子连接；
其中
所述的第一和第二功能部分均包含选自药学活性试剂、相互作用试剂和药代动力学改性剂试剂。
2.根据权利要求1的大分子，其中所述的构造单元选自
赖氨酸*1，其具有以下结构
甘氨酰-赖氨酸*2，其具有以下结构
类似物3，其具有以下结构，其中a为整数1或2；而b和c独立地为整数1、2、3或4，
类似物4，其具有以下结构，其中a为整数0、1或2；而b和c独立地为整数2、3、4、5或6，
类似物*5，其具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5，
类似物6，其具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数0、1、2、3、4或5，
类似物7，其具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5，
类似物8，其具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b、c和d独立地为整数1、2、3、4或5，
类似物9，其具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5，
其中，所述构造单元的任何亚甲基都可以被亚甲氧基(CH2-O)或亚乙氧基(CH2-CH2-O)替代，前体条件是这种替代不会导致在所述的构造单元内形成碳酸酯(-O-C(O)-O-)或氨基甲酸酯(-O-C(O)-N-)部分。
3.根据权利要求2的大分子，其中所述的构造单元选自赖氨酸1、甘氨酰-赖氨酸2或赖氨酸类似物5
其中a为整数0、1或2，并且其中1、2或5的任何亚甲基可以被亚甲氧基或亚乙氧基替代，前体条件是这种替代不会导致在所述的构造单元内形成碳酸酯或氨基甲酸酯部分。
4.根据权利要求1-3的任意一项中的大分子，其中所述的核心为三氨基化合物，该化合物得自赖氨酸或赖氨酸类似物与二氨基化合物的一个氨基氮原子的反应，其中所述的二氨基化合物选自
其中a为1-9的整数，例如1、2、3、4或5，
其中a、b和c独立地为整数1、2、3、4或5，例如2或3；而d为0-100的整数，例如1-30，特别是1-5、6-10、11-15、16-20、21-25或26-30，
其中a和b独立地为整数0、1、2、3、4或5，
其中a和c独立地为整数1、2、3、4、5或6，并且其中c为整数0、1、2、3、4、5或6，
其中a和d独立地为整数1、2、3、4、5或6，并且其中b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6。
5.根据权利要求4的大分子，其中所述的二氨基化合物选自
其中a为整数1、2、3、4或5，
其中a、b和c独立地为整数2或3；而d为1-30的整数，
其中a和d独立地为整数1或2；而b和c独立地为整数0、1或2。
6.根据权利要求5的大分子，其中所述的核心得自化合物11和类似物5，在化合物11中a、b、c和d均为1，而在类似物5中a、b和c均为2。
7.根据权利要求1-4的任意一项中的大分子，其中所述的核心为三氨基化合物或四氨基化合物，或者四氨基化合物或五氨基化合物，其中所述的四氨基化合物或五氨基化合物得自赖氨酸或赖氨酸类似物与三氨基化合物或四氨基化合物的一个氨基氮原子的反应，其中所述的三氨基化合物和所述的四氨基化合物选自
其中a、b和c独立地为整数1、2、3、4、5或6，
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6，
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6，
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；而d、e和f独立地为整数1、2、3、4、5或6，
其中a、b、c和d独立地为整数0、1、2、3、4、5或6，
其中a、b、c和d独立地为整数1、2、3、4、5或6，
其中a、b、c和d独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；而e、f、g和h独立地为整数1、2、3、4、5或6。
8.根据权利要求6的大分子，其中所述的三氨基化合物或四氨基化合物选自
其中a、b和c可以相同或不同，并且为整数1至2，
其中a、b和c独立地为整数0、1或2；而d、e和f独立地为整数1或2，
或者四胺化合物
其中a、b、c和d独立地为整数0或1，
其中a、b、c和d独立地为整数1或2，
其中a、b、c和d独立地为整数0、1或2；而e、f、g和h独立地为1或2。
9.根据权利要求1-8的任意一项中的大分子，其包含1、2、3、4或5层构造单元。
10.根据权利要求9所述的大分子，其包含2、3或4层构造单元。
11.根据权利要求1-10的任意一项中的大分子，其在所述的表面上进一步包含至少一个第三功能部分。
12.根据权利要求1-11的任意一项中的大分子，其中每个表面氨基氮原子均与功能部分连接。
13.根据权利要求1-12的任意一项中的大分子，其中所述第一功能部分包括药学活性试剂。
14.根据权利要求1-13的任意一项中的大分子，其中所述第二功能部分包括药学活性试剂。
15.根据权利要求1的大分子，其中所述药学活性试剂是肽。
16.根据权利要求1-12的任意一项中的大分子，其中第一和/或第二，和/或任选地第三功能部分包括药代动力学改性剂。
17.根据权利要求16的大分子，其中所述药代动力学改性剂是聚乙二醇。
18.根据权利要求1的大分子，其中第一和/或第二功能部分是相互作用试剂。
19.根据权利要求1-12的任意一项中的大分子，其具有如表1所定义的功能部分的组合。
20.根据权利要求1-19的任意一项中的大分子，其中一种或多种功能部分通过连接体与所述的核心或表面氨基氮原子连接。
21.根据权利要求20的大分子，其中所述连接体是具有1-100个重复单元的聚乙二醇连接体。
22.根据权利要求1-21的任意一项中的大分子，其中第一核心或表面氮原子和/或任何连接体和/或所述的功能部分通过改性基团改性，从而有助于连接。
23.根据权利要求21的大分子，其中改性剂基团可以选自马来酰亚胺、卤代乙酰胺、酰肼、烷氧基胺或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯。
24.一种组合物，其包括根据权利要求1-23的任意一项中的大分子，及其至少一种可药用的赋形剂、载体或佐剂。
25.根据权利要求1的大分子在治疗中的用途。
全文摘要
本发明总体上涉及分支大分子及其作为成像剂或造影剂的用途。具体而言，本发明涉及由赖氨酸或赖氨酸类似物衍生而来并具有多个功能部分的树状聚体，本发明还涉及所述大分子的用途，特别是在治疗应用中的用途，以及包含其的组合物。
文档编号A61K38/07GK101516969SQ200780035348
公开日2009年8月26日 申请日期2007年8月10日 优先权日2006年8月11日
发明者G·Y·克里普纳, C·C·威廉姆斯, B·D·凯利, S·A·汉德森, 吴泽民, P·拉兹诺 申请人:星药股份有限公司