专利名称：：一种生物活性肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物活性肽及其制备方法和在抗肿瘤方面的应用，该生物活性肽是一种来自海洋的、具有抗肿瘤活性的链式七肽。技术背景海洋生物活性多肽目前大多来自海绵、海鞘、海藻和海兔等，其新颖的结构和显著的生物活性引起了合成化学家和药物化学家的极大兴趣。然而，海洋来源的活性多肽中多富含iV-甲基氨基酸及其它高度变异的氨基酸，这给合成化学家带来巨大的挑战。Tasiamide是Moore小组(Williams,P.G.;Yoshida,W.Y.;Moore,R.E.;Paul,V.J.,,A^t尸d.,2002,65,1336-1339)从海洋藻青菌5^wp/ocasp.中分离到的一个结构新颖的链式七肽，其对KB和LoVo细胞的IC5o值分别为0.48和3.47^g/mL，Moore小组最初推定该活性肽的立体绝对构型为(1S,8i,26S,325，38S)，结构如下所示Tasiamide然而，随着对该活性物质的深入研究，本发明人发现上述推定的结构并不正确，该生物活性肽正确的立体绝对构型为(1S,8/,26/,38幻。因此合成具有正确结构的生物活性肽对了解和进行活性肽类药物的构效关系研究是非常重要的。另外由于天然产物的量过少，纯化、分离、鉴定都较为困难，大大限制了海洋生物活性肽的活性研究进展。其中化学合成就是一种替代方法，因此发展一种有效的制备生物活性肽的方法是非常必要的。
发明内容本发明的目的是提供一种生物活性肽有效的制备方法和应用，它能为抗肿瘤药物的研究提供足够的原料和有效的合成路线。一种生物活性肽，其特征是它的分子式为C42H67N70w，结构式为式中l位、8位、20位、26位、32位及38位的立体绝对构型为(1S,8i,2(XS,26i,38幻时，立体结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>Tasiamide-D-Gln式中l位、8位、20位、26位、32位及38位的立体绝对构型为(1S，8i,20S,26S32i,时，立体结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>OIITasiamide-D-Leu式中l位、8位、20位、26位、32位及38位的立体绝对构型为(1S,8i,20<S,26i32i，时，立体结构式为Tasiamide-D-Gln-D"Leu上述生物活性肽的制备方法，其特征是首先使L-脯氨酸在二氯亚砜和甲醇的存在下进行甲基化，得到L-脯氨酸甲酯的盐酸盐，使W-叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸在氢化钠和碘甲垸的作用下进行氮甲基化，得到iV-(叔丁氧羰基)-iV-甲基-D-苯丙氨酸，将上述的L-脯氨酸甲酯的盐酸盐和AK叔丁氧羰基)-iV-甲基-D-苯丙氨酸在縮合剂l-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺的盐酸盐的作用下縮合，得到二肽片段iV-(叔丁氧羰基)-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯，脱除该二肽片段的叔丁氧羰基保护基，再与^V-(9-芴甲氧羰酰基)-甘氨酸縮合，得到三肽片段W-(9-芴甲氧羰酰基)-甘氨酸-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯，脱除该三肽片段的9-芴甲氧羰酰基保护基，再与7V-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸缩合，得到四肽片段iV-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸-甘氨酸-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯；接着使A^-(9-芴甲氧羰酰基)-A^-(三苯甲基)-谷氨酰胺在多聚甲醛和对甲苯磺酸的作用下生成噁唑垸酮中间体，该中间体在三氟乙酸和三乙基硅垸存在下还原开环并脱除三苯甲基保护基得到7V-(9-芴甲氧羰酰基)-7V-甲基-谷氨酰胺；然后使L-异亮氨酸通过偶氮中间体水解的方法得到L-2-羟基-3-甲基缬草酸，使亮氨酸在甲苯、苄醇和对甲苯磺酸的存在下回流得到O-苄酯-亮氨酸的对甲苯磺酸盐，将上述的L-2-羟基-3-甲基缀草酸和0-苄酯-亮氨酸对甲苯磺酸盐在縮合剂l-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺的盐酸盐的作用下縮合，得到L-2-羟基-3-甲基缬草酸-0-苄酯-亮氨酸；最后在三氟乙酸的作用下脱除上述四肽片段7V-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸-甘氨酸-7V-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯的叔丁氧羰基保护基，并与iV-(9-芴甲氧羰酰基)-7V-甲基-谷氨酰胺缩合，得到五肽片段7V-(9-芴甲氧羰酰基)-7V-甲基-谷氨酰胺-L-异亮氨酸-甘氨酸-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯，该五肽片段脱除9-芴甲氧羰酰基保护基，得到中间体7V-甲基-谷氨酰胺-L-异亮氨酸-甘氨酸-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯，将上述的L-2-羟基-3-甲基缬草酸-0-苄酯-亮氨酸在钯制剂的氢解条件下脱除苄基后，再与上述的中间体缩合得到本发明的生物活性肽。上述的生物活性肽在抑制多种肿瘤细胞生长中的应用。本发明提供一种生物活性肽及其有效的制备方法和应用，能为抗肿瘤药物的研究提供足够的原料和有效的合成路线，制备方法简便，条件易于控制，可为药物筛选和进一步的构效关系研究提供结构不同的化合物。附图1为立体构型为(1S，8/,26&32&385)的Tasiamide与天然产物碳谱化学位移的差值图。附图2为立体构型为(1S，8i，26i，38幻的Tasiamide-D-Gln与天然产物碳谱化学位移的差值图。具体实施方式本发明的生物活性肽的立体绝对构型为(1&8i,26i，38幻时，命名为Tasiamide-D-Gln，它的制备方法包括以下步骤1.四肽片段iV-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸-甘氨酸-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯的制备，其各分步骤如下门<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>步骤a:使L-脯氨酸在甲醇和二氯亚砜的条件下进行甲酯化。操作时将50mL甲醇冷却至一1(TC，搅拌下缓缓滴入13mL二氯亚砜(S0Cl2)，25min后加入5.75g(50mmol)L-脯氨酸(L-Pro-OH)，室温下搅拌2天。薄层层析(TLC)显示反应结束后，减压蒸除溶剂，再加入25mL甲醇反复浓縮2次，向残渣中加入100mL乙醚，冰盐浴下研磨，抽滤，得浅黄色固体O-甲基-L-脯氨酸盐酸盐(0-Me-L-Pro.HC1)5.4g,收率65%。步骤b:将530mg(2mmol)A^-叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸(Boc-D-Phe-OH)溶于10mL无水四氢呋喃(THF)中，在冰浴下加入1.02g(7.2mmol)碘甲烷(CH31)，10分钟后分2批共加入256mg(7.2mmol)NaH(重量百分浓度为60%)，加毕使其自然升至室温，并继续搅拌24h后蒸除溶剂，将残余物溶于200mL蒸馏水中，并用正己垸洗涤三次，每次用20mL。水层用盐酸调pH-l后，以乙酸乙酯萃取5次，每次用乙酸乙酯的体积为40mL。合并萃取液并用10%(重量百分浓度，下同)的硫代硫酸钠水溶液洗三次，每次20mL，再用饱和食盐水20mL洗涤一次后，使乙酸乙酯有机层浓缩，得iV-叔丁氧羰基-W-甲基-D-苯丙氨酸(Boc-7V-Me-D-Phe-OH)552mg，收率99%。步骤C:在縮合剂的作用下合成二肽片段iV-(叔丁氧羰基)-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯。操作时，将644.3mg(3.89mmol)O-Me-L-Pro.HCl溶于20mL二氯甲垸中，冰浴下加入391.4mg(4.66mmol)碳酸氢钠，10分钟后，依次加入1.09g(3.89mmol)Boc-7V-Me-D-Phe-OH、縮合剂1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)634.2mg(4.66mmol)和l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺的盐酸盐(EDC.HCl)894.4mg(4.66mmol)，冰浴30分钟后室温反应过夜。TLC显示反应结束后，蒸除溶剂，加入200mL乙酸乙酯稀释反应液，依次用5%碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤2次，每次10mL，将乙酸乙酯层干燥浓縮后，用硅胶柱层析，乙酸乙酯和石油醚(二者体积比为l:1)洗脱，得白色固体.二肽片段7￥-(叔丁氧羰基)-丛甲基-0-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯(Boc-iV-Me-D-Phe-L-Pro-OMe)1.47g，收率96.7%。步骤d-e:脱除上述二肽片段的叔丁氧羰基保护基，使所得产物与iV-(9-芴甲氧羰酰基)-甘氨酸縮合/导三肽片段iV-(9-芴甲氧羰酰基)-甘氨酸-7V-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯。操作时，将上述.150mg(0.38mmol)Boc-7V-Me-D-Phe-L-Pro-OMe溶于3mL浓度为4M的HCl/EtOAc的体系中，室温下反应30分钟。TLC显示反应完毕后，减压蒸馏除去溶剂，向残留物中加入乙醚重蒸2次，得白色固体粉末，真空干燥后直接溶于4mLMW-二甲基甲酰胺与二氯甲烷(二者体积比为l:3)的混合溶液中，加入65.0mg(0.77mmol)碳酸氢钠，10分钟后，依次加入137.0mg(0.46mmol)iV-(9-芴甲氧羰酰基)-甘氨酸、88.0mg(0.46mmol)EDC.HCl和63.0mg(0.46mmol)HOAt，冰浴30分钟后恢复至室温反应12小时。减压蒸去二氯甲垸，加入IOOmL乙酸乙酯溶解残渣，依次用10%柠檬酸水溶液洗、5%碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水洗2次，每次10mL，将乙酸乙酯层干燥浓縮后，用硅胶柱层析，用乙酸乙酯和石油醚(二者体积比为l:4-1:1)洗脱，得白色固体三肽片段iV-(9-芴甲氧羰酰基)-甘氨酸-A^甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酉旨(Fmoc-Gly誦iV画Me-D画Phe-L-Pro-OMe)217.0mg，收率99,0%。步骤f-g:将所得三肽片段脱除9-芴甲氧羰酰基保护基，再与W-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸缩合，得到四肽片段。操作时，将927mg(1.63mmol)Fmoc-Gly-7V-Me-D-Phe-L-Pro-OMe溶于30mL乙腈和二乙胺(二者体积比为1:1)的混合溶剂中，室温反应2小时，减压浓縮除去溶剂，然后将残留物溶于二氯甲垸中再浓縮，重复操作2次，得粘稠油状物，真空干燥后，溶于30mL二氯甲烷中，加入7V-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸471.0mg(1.96mmol)，冰浴降温至0。C，依次加入碳酸氢钠164,6mg(1.96mmol)、HOAt266.8mg(1.96mmol)和EDC.HC1375.8mg(1.96mmol)，冰浴反应30分钟，恢复至室温反应12小时。接着减压蒸去二氯甲垸，加入200mL乙酸乙酯溶解残渣，依次用10%柠檬酸水溶液、5%碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水洗涤2次，每次10mL，将乙酸乙酯层干燥浓縮后，用硅胶柱层析，用乙酸乙酯和石油醚(二者体积比为l:2-2:1)洗脱，得白色泡沫状固体四肽片段iV-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸-甘氨酸-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酉旨(Boc國L-Ile-Gly-7V-Me-D隱Phe-L-Pro-OMe)730.0mg，收率为80.0%。四肽片段的结构表征如下迁移值为IV=0.26(petroleum-EtOAc,l:l);比旋光度为[a]21D=+19.3。(c0.4,CHC13);核磁共振氢谱数据为111NMR(CDC13,600MHz)5:7.18-7.29(m，5H,ArH)，6.81(brt,1H，Ng陽Ile),5.58(t-like,1H,/=7.7,7.4Hz,a陽CH-Phe)，4.42(dd,1H，/=8.2，6.0Hz，a-CH-Pro),4.05-4.13(m，2H,a-CH-Ile,CH2-a-Gly)，3,91(dd,1H,/=17.4，3.7Hz,CH2-b-Gly),3.73(s,3H，COOCH3),3.31-3.42(m,2H,5-CH2-Pro)，3.26-3.30(m,1H,|3-CH2-a-Phe),2.99(s，3H,A^-CH3),2.84(dd,1H，/=13.7,7.3Hz,p-CH2-b-Phe),2.13-2.20(m,1H,P-CH2-a-Pro),1.81-1.97(m,4H，p-CH2-b-Pro,卩-CH-Ile,Y-CH2-Pro),1.44(m,10H，y-CH2-a-Ile,(CH3)3),1.09-1.13(m，1H,y-CH2-b-Ile),0.89-0.93(m,6H,Y-CH3-Ile,S-CH3-Ile);核磁共振碳谱数据为13CNMR(CDC13)5:172.5,171.5,167.9,137,0,129.4,128.6，128.4,126.8，126.7，79.9,59.3,59.0，56.2,52.3，46.8,41.2，37.5,35.0,29.7,28.8,28.3,25.0,24.6,15.7,11.6;质谱数据为ESIMS:calcedforC29H44N407[M+H]+561.3;found561.4。2.7V-(9-荷甲氧羰酰基)-7V-甲基-D-谷氨酰胺的制备，其各分步骤如下所示o恥A^NHF削c(CH2O)n，cat，T0SOH.H2Or^cONH_Trt;-^-*^、N、1oCONHTrtTES/TFA0HOCHC國3，rt,2dCONH，首先以iV"-(9-芴甲氧羰酰基)-f-(三苯甲基)-D-谷氨酰胺为原料，通过Fredinger法得到噁唑烷酮中间体，该中间体在三氟乙酸和三乙基硅垸条件下还原开环，并脱除三苯甲基保护基得到iV-(9-芴甲氧羰酰基)-7V-甲基-D-谷氨酰胺。操作时，将2.00g(3.28mmol)iV"-(9-芴甲氧羰酰基)-A^-(三苯甲基)-D-谷氨酰胺加入到装有分水器的100mL三口瓶中，加入3mlJV,iV-二甲基甲酰胺，搅拌溶解，加入甲苯60mL，然后依次加入一水合对甲苯磺酸38mg和多聚甲醛3.2g，升温回流反应6小时。接着减压浓縮蒸除溶剂，再将残留物溶于200mL乙酸乙酯中，有机层用饱和的碳酸氢钠水溶液洗涤至中性，将乙酸乙酯层干燥浓縮，用硅胶柱层析，乙酸乙酯和石油醚(二者体积比为1:2)洗脱得白色固体噁唑垸酮中间体1.16g，收率为57%。接着将1.16g(0.02mmol)噁唑垸酮中间体溶于14mL氯仿中，然后依次加入1.2mL三乙基硅烷和14mL三氟乙酸。反应液在室温下搅拌2天。然后减压浓縮除去溶剂，将残留物溶于二氯甲垸中再浓縮，重复操作3次，用硅胶柱层析，用氯仿和甲醇(二者体积比为IO:1)的混合溶液洗脱，得白色固体iV-(9-芴甲氧羰酰基)-W-甲基-D-谷氨酰胺(Fmoc-7V-Me-D-Gln)410mg，收率57%。3.L-2-羟基-3-甲基缬草酸-0-苄酯-L-亮氨酸的制备，其各分步骤如下所示步骤a:使L-异亮氨酸通过偶氮屮间体水解的方法得到L-2-羟基-3-甲基缬草酸。操作时，将4.0g(31mmol)L-异亮氨酸加入到冰盐浴中冷却至一5。C的10mL浓度为1M的稀硫酸水溶液中，然后在冰盐浴下缓慢逐滴加入含3.6g(52mmol)亚硝酸钠的60mL水溶液。冰盐浴下反应2小时后，室温反应16小时。将反应液用乙醚萃取，干燥浓縮得黄色油状物，加入lmL丙酮，在-78。C条件下研磨，得粘稠固体，真空干燥得浅黄色固体L-2-羟基-3-甲基缬草酸(Hmp)0.77g，收率19.3%。步骤b:将L-亮氨酸在甲苯、苄醇和对甲苯磺酸的存在下，回流得到O-苄酯-L-亮氨酸的对甲苯磺酸盐。操作时，向装有分水器和回流冷凝管的50mL反应瓶中加入2.62g(20mmol)L-亮氨酸、一水合对甲苯磺酸4.56g(24mmol)，然后加入20mL甲苯以及苄醇8.35g(77.2mmo1)，回流反应6h后停止加热。当反应体系温度渐降至室温后，加入35mL乙醚和35mL石油醚，抽滤析出的结晶，再用乙醇-乙醚体系重结品，抽滤得到白色绵状固体O-苄酯-L-亮氨酸的对甲苯磺酸盐(L-Leu-OBn.TsOH)5.33g，收率67.8%。步骤c:将上述的0-苄酯-L-亮氨酸的对甲苯磺酸盐和L-2-羟基-3-甲基缬草酸在縮合剂的催化下縮合得到L-2-羟基-3-甲基缬草酸-0-苄酯-L-亮氨酸。操作时，将394mg(1.00mmol)L-Leu-OBn.TsOH溶于10mL无水二氯甲烷中，加入缚酸剂AA-甲基吗啉133//L(1.20mmol)，冰浴10分钟后，依次加入Hmp132mg(1.00mmol)、縮合剂HOAt164mg(1.20mmol)和EDC.HC1230mg(1.20mmol)，冰浴30分钟后，室温反应过夜。减压蒸去二氯甲垸，加入200mL乙酸乙酯溶解残渣，依次用10%柠檬酸水溶液、5%碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水各洗2次，每次10mL，将乙酸乙酯层干燥浓縮后，用硅胶柱层析，用乙酸乙酯和石油醚(二者体积比为1:2)洗脱，得油状物250mgL-2-羟基-3-甲基缬草酸-0-苄酉旨-L-亮氨酸(Hmp-L-Leu-OBn)，收率74%。4.生物活性肽Tasiamide-D-Gln的制备，具体各分步骤如下所示步骤a-b:脱除上述四肽片段的叔丁氧羰基保护基，然后与iV-(9-芴甲氧羰酰基)—AT-甲基-D-谷氨酰胺缩合，得到五肽片段iV-(9-芴甲氧羰酰基)-iV-甲基-D-谷氨酰胺-L-异亮氨酸-甘氨酸-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯。操作时，将IOOmg(0.18mmol)四肽片段Boc-L-Ile-Gly-7V隱Me-D-Phe-L-Pro-OMe溶于4mL二氯甲烷中，室温下加入4mL三氟乙酸并搅拌反应2小时。然后减压浓縮除去溶剂，将残留物溶于二氯甲烷中再浓縮，重复操作2次，得粘稠油状物。真空干燥后，溶于10mL干燥的THF中，力[]入Fmoc陽7V-Me-D曙Gln98.8mg(0.26mmol)，冰浴降温至0。C，再依次加入W-甲基吗啉48(0.43mmol)、HOAt58.0mg(0.43mmol)禾口EDC.HC182.0mg(0.43mmol),冰浴反应30分钟后，室温反应20小时。然后减压蒸去溶剂，加入IOOmL乙酸乙酯溶解残渣，依次用10%柠檬酸水溶液、5%碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水各洗2次，每次5mL，将乙酸乙酯层干燥浓縮后，用硅胶柱层析，用氯仿和甲醇混合溶剂(二者体积比为20:1)洗脱，得白色泡沫状固体五肽片段iV-(9-芴甲氧羰酰基)-iV-甲基-D-谷氨酰胺-L-异亮氨酸-甘氨酸-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-腩氨酸甲酯(Fmoc-iV-Me-D-Gln-L-Ile-Gly-7V-Me-D-Phe画L-Pro-OMe)143.6mg，收率为97.9%。五肽片段的结构表征如下迁移值为R/^0.61(CHCl3-MeOH,5:1);比旋光度为[a]21D=+13.0。(c0.2,CHC13);核磁共振氢谱数据为'HNMR(CDC13,600MHz)S:7.77(d,2H，J"=7.3Hz,4,5-CS陽Fl雨enyl),7.60(d,2H,/=6.6Hz,1，8-CS.Fluorenyl),7.40(t-like，2H,J=7.7,7.3Hz，3,6-CE-Fluorenyl)，7.32(m,2H，2,7-CH陽Fl丽enyl)，7,17-7.23(m,5H,A邸，6.97(brs，1H,Nil-lie),6.83(brs,1H,NH-Gly),5.92(brs,1H,NH2-a-Gln),5.61(brs,1H,NH2-b-Gln),5.50(t-like,1H,/=7.3,6.6Hz,a-CH-Phe),4,67(brs，1H,a-CH-Gln)，4.45-4.52(m,2H,CH2-Fluorenyl),4.40(dd,1H,/=8.8，5,8Hz,a-CH陽Pro),4.32(brs，1H，a-CH墨Ile),4.28(brt,1H,9-CH-Fluorenyl)，4.06(dd,117.9,4.8Hz,CH2-a-Gly),3.83(d,1H，J=16.5Hz,CH2-b-Gly),3.71,3.73*(s，3H,COOCH3),3.31(t,2H,■/=6.2Hz,S-CH2-Pro),3.25(dd,1H,/=13.6,8,0Hz,(3-CH2-a-Phe),2.95,2.96*(s，3H，W-CH3-Gln),2.84(s,3H,7V-CH3-Phe),2.80(dd，1H,/=13.9,7.3Hz,p-CH2-b-Phe)，2.30-2.33(m,1H,p-CH2-a-Gln)，2.10-2.20(m，3H，Y-CH2-Gln,|3-CH2-a-Pro)，2.04(brs，1H,(3-CH2-b-Gln),1.76-1.93(m,4H,|3-CH2-b-Pro，卩-CH-Ile,y-CH2-Pro),1.41-1.43(m,1H,y-CH2-a-Ile)，1.11(brs,1H,y-CH2-b-Ile),0.87(t，6H，/=7.3Hz，y-CH3-Ile，5-CH3-Ile)(*表示旋转异构体)；核磁共振碳谱数据为13CNMR(CDC13,150MHz)3:172.5,167.9,143.9,143.8，141.3,136.9,129.4,128.4,127.8,127.1,126.7，125,0，120.1,68.0，59.1,58.9，58.0,56,3,52.3,47.2,46.8，41.1，37,0,35.0，32.2,29.8,29.7,28.8,25.0,24.8,24.1,15.6,11.3;质谱数据为ESIMS:calcedforC45H56N609CM+H]+824.5;found825.5。步骤c-e:使上述五肽片段脱除9-芴甲氧羰酰基保护基得到一中间体，将L-2-羟基-3-甲基缬草酸-0-苄酯-L-亮氨酸在钯制剂氢解的条件下脱除苄基得到L-2-羟基-3-甲基缬草酸-L-亮氨酸，接着与上述中间体在縮合剂的条件下縮合得到本发明的生物活性肽Tasiamide-D-Gln。操作时，将20.0mg(0.02mmol)五肽片段Fmoc-7V-Me-D-Gln-L-Ile-Gly-7V-Me-D-Phe-L-Pro-OMe溶于4mL乙腈和二乙胺的混合溶剂中(二者体积比为1:1)，室温下反应1小时，TLC显示反应完毕后，蒸干反应溶液，真空干燥，得五肽片段中间体。另将L-2-羟基-3-甲基缬草酸-0-节酯—L-亮氨酸(Hmp-L-Leu-OBn)100.0mg(0.30mmol)溶于乙酸乙酯和乙醇的混合溶剂中(二者体积比为1:4)，加入催化量的10%钯碳，充氢气球氢解16小时，TLC显示反应完毕，用硅藻土助滤除去钯碳，蒸干滤液，加入10mL二氯甲院，蒸干得白色固体L-2-羟基-3-甲基缬草酸-L-亮氨酸(Hmp-L-Leu)，并真空干燥1小时。将上述脱除保护基的两种中间体全部溶于20mL无水二氯甲烷中，冰浴10分钟后，依次加入縮合剂EDC.HC169.6mg(0.36mmol)，HOAt49.4mg(0.36mmol)和TV-甲基吗啉44.0mg(0.36mmol)，冰浴反应30分钟后，恢复至室温反应过夜。然后减压蒸去二氯甲烷，加入50mL氯仿溶解残渣，然后依次用10。/。柠檬酸水溶液、5%碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水洗涤2次，每次5mL,将有机相干燥浓縮后，用硅胶柱层析，用氯仿和甲醇(二者体积比为20:1)洗脱，得无色固体Tasiamide-D-Gln10.0mg，收率49.7%。Tasiamide-D-Gln的结构表征如下迁移值为R/=0.18(CHCl3-MeOH,20:1);比旋光度为+830,5028,found830.5045。本发明中所述的氢解的条件下的钯制剂为钯-碳或氢氧化钯。所述的缩合剂为l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺的盐酸盐、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑或1-羟基苯并三氮唑。所述的7V"-(9-芴甲氧羰酰基)-A^-(三苯甲基)-谷氨酰胺为7V"-(9-芴甲氧羰酰基)-,-(三苯甲基)-L—谷氨酰胺或7V、(9-芴甲氧羰酰基)-A^-(三苯甲基)-D-谷氨酰胺。所述的亮氨酸为L-亮氨酸或D-亮氨酸。所述的L-2-羟基-3-甲基缬草酸4-亮氨酸与五肽片段中间体进行縮合时的摩尔比为1:1.21:5.0。本发明的生物活性肽Tasiamide-D-Gln的结构式为Tasiamide-D-Gln为了进一步确定本发明所合成的生物活性肽Tasiamide-D-Gln的立体绝对构型为(IS,8i,20<S，26/,38幻，本发明人也合成了立体绝对构型为(1S,8i，32<S,38幻的Tasiamide，两者的制备方法相同，只在合成iV-(9-芴甲氧羰酰基)—iV-甲基-谷氨酰胺的过程中，前者采用iy、(9-芴甲氧羰酰基)-A^(三苯甲基)-D-谷氨酰胺为原料，而Tasiamide采用,-(9-芴甲氧羰酰基)-A^-(三苯甲基)-L-谷氨酰胺为原料。本发明合成的Tasiamide的结构表征迁移值为R/=0.18(CHC13:MeOH=20:1);比旋光度为[a]o21=-12.6°(c0.4,CHC13);核磁共振氢谱数据为！HNMR(CDC13):57.19-7.35(m,5H,ArH)，6.99(brs,1H,丽-Gly),6.80,6.29(2brs,2H,N//2-Gln),5,52(t陽like,1H，/=7.3,7.8Hz,a-C//-Phe),5.11(t,1H,■/=7.1Hz,a-C//-Gln),4.94(m,1H,0//-Hmp),4.81(brs,1H,a陽C/Z墨Leu),4.41(dd,1H,J=8.3,5.5Hz，a-C//-Pro),4.28(t,1H,J=7.3Hz,a-C/Mle),4.13,3.89(2dd，2H,J=17.4,4.6Hz,a-Ci/2-Gly),3.72(s,3H,COOC//3),3.34(m,2H,5-C//2-Pro),3.28，2.81(2dd,2H，J=13.7,8.3Hz,卩-C//2-Phe)，3.13(s,3H,A^-C7/3-Gln)，3.00(s，3H,tv-C//3-Phe),1.80-2.99(m，10H，Y-C//2-Gln，(3-C//2-Gln,p-dPro,y-C//2-Pro，卩-C//-Ile，P-C//-Hmp),1,10-1.75(m,7H,y-C/Z-Leu,(3-C//2-Leu,Y-C//2-Ile，Y-C//2-Hmp)，0.98(d,3H，J"=6.9Hz,y-C//3-Hmp),0.96,0.95(2d,6H,/=7.0Hz,25-C//3-Leu),0.89(t，3H,J=7.3Hz，5-C//3-Hmp)，0.87(d,3H,/=6.9Hz,y-C//3-lie),0.85(t,3H,/=7.3Hz，S-CZ/3-Ile);核磁共振碳谱数据为13CNMR(CDC13)5:175.5(C-37),174.1(C-29),174.0(C-31),172.5(C-l),171.2(C-19),170.4(C-25),167.9(C-7),167.9(C-17),137.0(C-10),129.4(C-11,15),128.5(C-12,14),126.8(C-13),76.2(C-38),59.0(C-2),58.0(C-20),56.5(C-8)，55.4(C-26),52,3(C-6),47.8(C-32),46.8(C-5)，41.2(C-18),41,0(C-33),38.6(C-39)，36,5(C-21),35.0(C-9),31.5(C-28),31.0(C-30),29.9(C-16),28.8(C-3)，25.0(C-22),24.9(C-34),24.4(C陽4)，23.9(C-27),23.4(C-40),23.2(C-35),21.4(C-36),15.7(C-23),15.5(C-41),11.8(C-42)，11.3(C墨24);高分辨质谱数据为H固S(ESI):calcdforC42H68N7Ol0[M+H]+830.5028,found830.5035。将本发明合成的生物活性肽Tasiamide和Tasiamide-D-Gln谱图数据与天然产物的碳谱比较，如附图所示，其中图1为本发明合成的(1S，8i,32&Tasiamide与天然产物碳谱化学位移的差值，图2为本发明合成的(1S，8凡2(XS，26i,38幻Tasiamide-D-Gln与天然产物碳谱化学位移的差值，标准值为天然产物的化学位移值。由附图l可以看出本发明合成的Tasiamide与天然产物碳谱化学位移值的相差较大，由附图2可以看出Tasiamide-D-Gln与天然产物碳谱化学位移值的相差无几，由此可见天然产物的真实立体绝对构型应为(1S,8i,20<S,26/，32&38幻，即为本发明的生物活性肽Tasiamide-D-Gln。为了进一歩研究Tasiamide-D-Gln立体构型对活性的影响，本发明人也合成了立体绝对构型为(1S,8i,20S,26S，32i,的Tasiamide-D-Leu和立体绝对构型为(1S,8i,205，26/，32/，的Tasiamide-D-Gln-D-Leu，制备方法与Tasiamide-D-Gln类似，区别在于在合成Tasiamide-D-Gln时(见具体实施例)，使用的7V"-(9-芴甲氧羰酰基)-7Vy-(三苯甲基)-谷氨酰胺为iV-(9-芴甲氧羰酰基)-7V-甲基-D-谷氨酰胺，使用L-亮氨酸在甲苯、苄醇和对甲苯磺酸的存在下回流得到O-苄酯-L-亮氨酸的对甲苯磺酸盐；而在合成Tasiamide-D-Leu时，则分别采用iV-(9-芴甲氧羰酰基)-TV-甲基-L-谷氨酰胺和D-亮氨酸为原料，在合成Tasiamide-D-Gln-D-Leu时，分别采用7V-(9-芴甲氧羰酰基)-TV-甲基-D-谷氨酰胺和D-亮氨酸为原料。两者的结构式如下Tasiamide-D-Gln-D-Leu合成的Tasiamide-D-Leu禾nTasiamide-D-Gln-D-Leu的结构表征如下Tasiamide-D-Leu的迁移值为R/=0.18(CHC13:MeOH=20:1);比旋光度为[a]22D=-15.6°(c0.4,CHC13);核磁共振氢谱数据为'HNMR(CDCI3,600MHz)5:7.37(dd,2H,/=12.5,8.1Hz，NH-Leu,NH-Ile),7.15-7.28(m，5H,ArH),7.08*(t,2H,J=7.9Hz,NH-Leu,NH-Ile),7.00(dd,1H,■/=8.4,4.4Hz,NH-Gly),6.74(brs,1H,NH2-a-Gln),6.67承(brs,1H,NH2-a-Gln),6.44(brs，1H,NH2-b-Gln),5.74*(brs,1H,NH2-b-Gln),5.51，5.47*(t,1H,J"=7.5Hz，a-CH-Phe),5.12(dd,1H,/=9.7,5.7Hz,a-CH墨Gln),4.93*(dd,1H,=9.0,6.0Hz,a-CH-Gln),4.89-4.93(m，1H,a-CH-Leu)，4.75-4.79*(m，1H,a-CH-Leu),4.40,4.39*(dd，1H,J=5.7,1.8Hz,a-CH-Pro),4.28(dd,1H，/=8.0，6.6Hz，a-CH-Ile)，4.09-4,15(m,2H,(3陽OH-Hmp,CH2-a-Gly)，3.97，3.95*(d,1H,J=3,7Hz，a-CH-Hmp)，3.90，3.87*(dd，1H,/=14.3，3.8Hz,CH2-b-Gly)，3.72*，3,71,3.66*,3.65*(s,3H,COOCH3)，3.30-3.36(m，1H，5-CH2-a-Pro)，3.23-3.29(m，2H，(3-CH2-a-Phe,S-CH2-b-Pro),3.11*,3.08(s,3H,7V-CH3-Gln),3.00,2.99*(s，3H,W-CH3-Phe),2.82,2.79*(dd，1H,/=6.8,2.0Hz,P.CH2-b-Phe),2.18-2.39(m,3H,p-CH2-a-Gln,Y.CH2-Gln)，2.11-2.17(m，1H,(3-CH2-a-Pro),1.99-2.03(m，2H,p_CH2-b-Gln,卩-CH-Ile)，1.90-1.97(m,3H,"/-CH2-a-Pro,p-CH-Ile*,(3-CH2-b-Gln*)，1.84-1.89(m,1H,p-CH2-b-Pro),1.78-1.83(m，2H,卩-CH-Hmp，Y_CH2-b-Pro)，1,69-1.74,1.60-1.62*(m,1H,y-CH-Leu),1.63-1.68,1.56-1.59*(m,1H,p-CH2-a-Leu),1.35-1.49(m，3H,Y-CH2-a-Hmp,y-CH2-a-Ile，(3-CH2-b-Leu)，1.14-1.22(m，1H，y-CH2-b-Hmp)，1.04-1.12(m，1H,y-CH2-b-Ile),0.97(d,3H,/=6.6Hz,Y-CH3-Hmp),0.92-0.95(m,6H,5),S2-CH3-Leu),0.81-0.90(m，9H，S-CH3-Hmp,Y-CH3-Ile,S-CH3-Ile);(*表示旋转异构体)核磁共振碳谱数据为"CNMR(CDC13,150MHz)5:174.7,174.6,174.2,174.1,174.0，173.6，172.5，171.1，171.0，170.3，168.3，168.2,167,9,167.8,136.9,129.4,129.3，128.4,126.8,126.7，76.3,75.9,59.0，58.2,57.9,56.5，56.4，54.8,52.3,48.0,46.8,41.5,41.1，39.1，38.《36.5，36.0,35.0，34,9,32.0，31.9,31.2,30.5,29.9,29.8，29.7,28.8,25.0,24,8，24.6:23.9,23.6,23.3，21.6,21.2,15.7,15.6，15.5,15.4,11.8,11.3;高分辨质谱数据为H腹S(ESI)calcdforC42H68N7Ol0[M+H〗十830.5028,found830.5008。Tasiamide-D-Gln-D-Leu的迁移值为R/=0.18(CHC13:MeOH=20:1);比旋光度为210=+18.5°(c0.4，CHC13);核磁共振氢谱数据为'HNMR(CDC13,600MHz)5:7.21-7.25(m，5H,A邸，7.19(m,1H,,-Leu),7.11(brs,1H,賜-Ile),7.02(brs,1H，NH-Gly),6.06(brs,1H，NH2-a-Gln),5.76(brs，1H，NH2-b-Gln)，5.52(dd,1H,J=8.4，7.0Hz，a-CH-Phe),5.05(t,1H,■/=7.3Hz,a陽CH-Gln)，4.93(m,1H，a-CH-Leu),4.77(brs，1H，卩-OH-Hmp)，4.38(dd,1H,J=8.8，5.5Hz，。條械s「la,IT:嫌泰乾卓州悉超現徵虽,S:，鹏磁S每超賠鬆别S&I扭传B邻务帐^Kg彬is-^泰贫s悉碧現锲罢.sr沒T灰nlo-a-3pls5!SBl虽超-腔鬆7f、sK-扭*。MZAR贫t邑.fa昍，>一i-钼ffin,『、S寸A-13H您切悉連現傻罢sif^-班A必珠g顿(a,as)a浮.tf斷截磐^嵌。旺超S4"^-站^薪徵罢泰贫彬赵赵躯髿^S窓W长rl寸zs-3)//9寸-(s￡-3)rA寸"(9-0)rzs-(8-〕)r9S;9s-3)寸9S;02-〕)8一s6-9n;z.l-o)口91;s)6-/-91;S2)8.691;6T〕)rl卜I;s);A3)r寸u。(K-3)r寸u;6N-〕)S.寸z-I:々(ZHWOSl;13G3)"WN〕e-R瞎毅徵瞎瞎汰壞悠"(教瑟咏恶磐^帐*)(9II-。H3-SJII-〔H3-卜rd日H"H3-s。H6-曰)06.0-寸8.0-HIg)66.1;sd-。"H〕-d。Hl。s)n";UI0-￡3-/L-HZg)Ir2IT"s)6"￡;sd-q"H〕-s。HI-扫);ptd-NH3-s-HI。s)sr。。(T5〕00〕-￡M8I/Z-I城Jt浮每9.6ts9I00I800s生物活性肽Tasiamide-D-Gln对不同肿瘤细胞的生长抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>权利要求1.一种生物活性肽，其特征是它的分子式为C42H67N7O10，结构式为id="icf0001"file="S2008100162496C00011.gif"wi="98"he="35"top="58"left="57"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>式中1位、8位、20位、26位、32位及38位的立体绝对构型为(1S，8R，20S，26R，32S，38S)时，立体结构式为id="icf0002"file="S2008100162496C00012.gif"wi="138"he="45"top="126"left="17"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>式中1位、8位、20位、26位、32位及38位的立体绝对构型为(1S，8R，20S，26S，32R，38S)时，立体结构式为id="icf0003"file="S2008100162496C00013.gif"wi="99"he="41"top="201"left="58"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>式中1位、8位、20位、26位、32位及38位的立体绝对构型为(1S，8R，20S，26R，32R，38S)时，立体结构式为id="icf0004"file="S2008100162496C00021.gif"wi="98"he="42"top="30"left="58"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2、权利要求l所述的生物活性肽的制备方法，其特征是首先使L-脯氨酸在二氯亚砜和甲醇的存在下进行甲基化，得到L-脯氨酸甲酯的盐酸盐，使W-叔丁氧羰基-D-苯丙氨酸在氢化钠和碘甲烷的作用下进行氮甲基化，得到W-(叔丁氧羰基)-iV-甲基-D-苯丙氨酸，将上述的L-脯氨酸甲酯的盐酸盐和iV-(叔丁氧羰基)-W-甲基-D-苯丙氨酸在縮合剂1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺的盐酸盐的作用下缩合，得到二肽片段A4叔丁氧羰基)-W-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯，脱除该二肽片段的叔丁氧羰基保护基，再与iV-(9-芴甲氧羰酰基)-甘氨酸缩合，得到三肽片段iV-(9-芴甲氧羰酰基)-甘氨酸-W-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯，脱除该三肽片段的9-芴甲氧羰酰基保护基，再与yV-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸縮合，得到四肽片段AK叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸-甘氨酸-7V-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯；接着使7V^(9-芴甲氧羰酰基)-^-(三苯甲基)-谷氨酰胺在多聚甲醛和对甲苯磺酸的作用下生成噁唑烷酮中间体，该中间体在三氟乙酸和三乙基硅烷存在下还原开环并脱除三苯甲基保护基得到;v-(9-芴甲氧羰酰基HV-甲基-谷氨酰胺；然后使L-异亮氨酸通过偶氮中间体水解的方法得到1^2-轻基-3-甲基缬草酸，使亮氨酸在甲苯、苄醇和对甲苯磺酸的存在下回流搏到0-苄酯-亮氨酸的对甲苯磺酸盐，将上述的L-2-羟基-3-甲基缬草酸和0-苄酯-亮氨酸对甲苯磺酸盐在縮合剂l-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺的盐酸盐的作用下縮合，得到L-2-羟基-3-甲基缬草酸力-苄酯-亮氨酸；最后在三氟乙酸的作用下脱除上述四肽片段7V-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸-甘氨酸-7V-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯的叔丁氧羰基保护基，并与iV-(9-芴甲氧羰酰基)-iV-甲基-谷氨酰胺縮合，得到五肽片段7V-(9-芴甲氧羰酰基)-7V-甲基-谷氨酰胺-L-异亮氨酸-甘氨酸-iV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯，该五肽片段脱除9-芴甲氧羰酰基保护基，得到中间体7V-甲基-谷氨酰胺-L-异亮氨酸-甘氨酸-TV-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯，将上述的L-2-羟基-3-甲基缬草酸力-苄酯-亮氨酸在钯制剂的氢解条件下脱除苄基后，再与上述的中间体縮合得到本发明的生物活性肽。3、权利要求1所述的生物活性肽在抑制多种肿瘤细胞生长中的应用。4、如权利要求2所述生物活性肽的制备方法，其特征是所述的钯制剂为钯-碳或氢氧化钯。5、如权利要求2所述生物活性肽的制备方法，其特征是所述的A^-(9-芴甲氧羰酰基)-M-(三苯甲基)-谷氨酰胺为矿-(9-芴甲氧羰酰基)-^-(三苯甲基)丄-谷氨酰胺或7V"-(9-芴甲氧羰酰基)-A^-(三苯甲基)-D-谷氨酰胺。6、如权利要求2所述生物活性肽的制备方法，其特征是所述的亮氨酸为L-亮氨酸或D-亮氨酸。7、如权利要求2所述生物活性肽的制备方法，其特征是所述的L-2-羟基-3-甲基缬草酸-L墨亮氨酸与中间体进行縮合时的摩尔比为1:1.2~5.0。全文摘要一种生物活性肽，它的分子式为C<sub>42</sub>H<sub>67</sub>N<sub>7</sub>O<sub>10</sub>。制备时，先制备四肽片段N-(叔丁氧羰基)-L-异亮氨酸-甘氨酸-N-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯，再制备N-(9-芴甲氧羰酰基)-N-甲基-谷氨酰胺，然后制备二肽片段L-2-羟基-3-甲基缬草酸-O-苄酯-亮氨酸，最后将四肽片段脱除保护基后，与N-(9-芴甲氧羰酰基)-N-甲基-谷氨酰胺缩合，得到五肽片段N-(9-芴甲氧羰酰基)-N-甲基-谷氨酰胺-L-异亮氨酸-甘氨酸-N-甲基-D-苯丙氨酸-L-脯氨酸甲酯，脱除上述二肽和五肽片段保护基后缩合。本发明能为抗肿瘤药物的研究提供足够的原料和有效的合成路线，制备方法简便，条件易于控制。文档编号A61P35/00GK101274958SQ200810016249公开日2008年10月1日申请日期2008年5月17日优先权日2008年5月17日发明者李春霞,李英霞,鹏王,马振华申请人:中国海洋大学