专利名称：高纯度二咖啡酰奎宁酸类化合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及中药或天然产物中有效成分的分离纯化方法，主要涉及从
中药或天然产物中提取、分离单体化合物的方法，具体涉及一种高纯度3,5-二咖啡酰奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸的分离制备方法。
背景技术：
蒲公英是我国家喻户晓的中草药和野生蔬菜，为菊科蒲公英属植物蒙 古蒲公英(7^raxacww mowgo//cmw Hand. -Mazz.)、石咸i也蒲公英(7^n2xacww Wm'o/mKitag.)或同属数种植物的干燥全草，广布于东北、华北、西北、华 中、华东及西南各省区，西南和西北地区最多。具有清热解毒，消肿散结， 利尿通淋功效；用于疔疮肿毒，乳痈，瘰疠，目赤，咽痛，肺痈，肠痈， 湿热黄疸，热淋涩痛。蒲公英主要含有酚酸类、黄酮类、甾醇类、三萜类、 香豆素类等次生代谢产物，其药理作用有抗菌消炎、抗氧化、免疫调节、 保肝利胆和抗肿瘤等。目前利用蒲公英单味药制成的注射剂、片剂和颗粒 剂以及含有蒲公英的复方药广泛应用于临床，用于治疗急性乳腺炎、淋巴 腺炎、疔毒疮肿、急性结膜炎、感冒发热、急性扁桃体炎、急性支气管炎、 肝炎、肿囊炎及尿路感染等多种疾病。药理研究表明，蒲公英属植物中的 抗病毒活性成分主要为二咖啡酰奎宁酸类化合物。
二咖啡酰奎宁酸类化合物是由一分子的奎尼酸和两分子的咖啡酸组成 的一类多酚类化合物，广泛存在于植物界中，广为分布的为3，5-二咖啡酰奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎宁酸以及4,5-二咖啡酰奎宁酸。三个化合物为同分 异构体，三者之间的的区别在于两个咖啡酰基在奎宁酸上的连接位置不同，
分子式均为C25H24012，分子量为516。结构式如下
<formula>complex formula see original document page 6</formula>3,5-二咖啡酰奎宁酸= R3 =咖啡酰基，R2 = H
3，4-二咖啡酰奎宁酸 = R2 =咖啡酰基，R3 = H 4,5-二咖啡酰奎宁酸R, = H, R2 = R3 =咖啡酰基
近代药理学试验研究表明二咖啡酰奎宁酸类化合物具有多种重要生 理活性，主要是针对免疫系统的作用，抑制乙肝病毒、艾滋病毒、单纯疱 疹病毒及流感病毒，抑制白三烯合成和释放，抑制组胺释放，从而可用于 抗病毒、抗炎和治疗过敏性疾病。此外还发现其具有强效的抗氧化作用、 抑制脂氧酶抗动脉粥硬化作用、抗血小板聚集活性以及降血脂作用等活性。
二咖啡酰奎宁酸类化合物为白色粉末状固体，易溶于热水、热甲醇、 热乙醇，不溶于乙醚、苯等极性较小的有机溶剂，受热发生氧化分解或转 化为其它二咖啡酰奎宁酸类化合物，此外，三个化合物在溶液中不稳定， 能够相互转化，这给它们的分离纯化造成很大的困难。因此，建立一种高 效、快速的从中药或天然药物中分离纯化高纯度的三个二咖啡酰奎宁酸类 化合物，对开发具有特殊疗效的现代中药制剂和充分利用我国的药材资源 等具有重要意义。
目前通用的二咖啡酰奎宁酸类化合物分离提取方法是用甲醇、乙醇或 水回流提取，减压浓縮分离提取液得到浸膏，将浸膏悬浮于水，依次用石 油醚或正己垸、氯仿或乙酸乙酯、水饱和的正丁醇等不同极性的溶剂萃取。
二咖啡酰奎宁酸类化合物一般集中在乙酸乙酯相，再利用正相硅胶柱层析，
使用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等溶剂洗脱，以及过Sephadex LH-20
柱色谱或制备液相色谱得到单一化合物。这些方法步骤复杂，费时费力， 而且回收率低，成本高，不适合工业化。高速逆流色谱(high speed counter current chromatography, HSCCC)是20世纪80年代初期发展起来的一种无需 使用任何固态支持介质的液-液分配色谱技术，其基本原理是根据被分离的 物质在两相溶剂系统中的分配系数不同而得到最终分离；这种分离技术由 于不使用固体支持介质，避免了因与固体填料发生不可逆吸附而造成的样 品损失、失活变性等常规填料易产生的弊端，可使样品得以全部回收，且 具有分离容量大、性能强、高效、快速的特点，尤其适用于制备性分离， 逆流色谱已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯 化。逆流色谱技术的发展和应用解决了目前二咖啡酰奎宁酸类化合物分离 纯化技术面临的难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服传统分离技术的缺陷，提供一种从粗 提物中分离纯化3,5-二咖啡酰奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰 奎宁酸的制备方法，该方法具有操作简便，分离量大，回收率高等优点。
本发明的技术方案主要包括
a) 粗提物的制备
将蒲公英属植物粉碎，用水-强极性的有机溶剂提取，提取液减压浓縮 至无醇味，并经离心去除杂质后得到澄清的浓縮液，进行大孔吸附树脂柱 层析，先以水洗至近无色，再以不同浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，接收 30 40%的乙醇洗脱物，将洗脱液减压浓縮至无醇味，加入乙醇至含醇量 70 80%，除去沉淀，取上清液浓縮，得含二咖啡酰奎宁酸类化合物的粗品。
b) 目标化合物的分离纯化
将富含二咖啡酰奎宁酸类化合物的粗提物真空干燥后，用高速逆流色
谱分离，根据紫外检测谱图或者TLC图谱收集目标组份。
目标组分经真空干燥后，用有机溶剂或水-有机溶剂的混合液进行重结
晶即可得高纯度的3，5-二咖啡酰奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡
酰基奎宁酸单体化合物。
c)分离物的纯度检测和结构鉴定
采用高效液相色谱法对各组份进行纯度检测；样品用CD3OD或者 DMSO-A溶解，进行UV， MS， 1DNMR和2DNMR测定，根据波谱数据 进行结构确证。
制备方法中，步骤a)中所用原料优选菊科蒲公英属植物蒙古蒲公英， 碱地蒲公英，热河蒲公英、东北蒲公英、反苞蒲公英、兴安蒲公英等市场 上常见的蒲公英属植物药材；提取溶剂为醇水混合溶剂，其中醇可以是甲 醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇等或它们的混合物，优选甲醇或乙醇，醇 水混合溶剂可以是醇和水以任何比例混合的溶剂，优选乙醇和水混合溶剂， 其间优选70 80%的乙醇水溶液。提取溶剂的重量为药材重量的1 20倍， 优选6 10倍；提取时间为0.5-5小时，优选2小时；提取次数为1-5次， 优选3次；柱层析所用介质为大孔吸附树脂、聚酰胺、反相硅胶或葡聚糖 凝胶类，优选D101, AB-8, HPD100, HPD300， Dl或D2型大孔吸附树脂， 洗脱溶剂优选30 40%乙醇水溶液；步骤b)中，优选脂肪酯-脂肪醇-水或者 卤代烃-脂肪醇-水组成的溶剂体系进行高速逆流色谱，脂肪酯可以是乙酸乙 酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯，最优选为乙酸乙酯，卤代烃可以是 氯仿、二氯甲垸或四氯甲烷，最优选为氯仿，脂肪醇可以是甲醇、乙醇、 异丙醇或正丁醇，最优选为甲醇，其中主机转速正转为600 1200rpm，优 选800rpm，流动相泵入柱内的流速为0.5~5 mL/min，优选1.5mL/min，实 验条件温度为10 30 。C，优选为25。C，上相为固定相，下相为流动相；由 于二咖啡酰奎宁酸类化合物的不稳定性，分离和收集到的目标成分，必须
立即真空干燥后重结晶，重结晶溶剂为有机溶剂或水-有机溶剂的混合液，
优选80%甲醇水溶液或80%乙醇水溶液。
本发明采用高速逆流色谱仪，其根据被分离的物质在两相溶剂系统中 的分配系数不同而得到最终分离，这种分离技术由于不使用固体支持介质， 避免了因与固体填料发生不可逆吸附而造成的样品损失、失活变性等常规 填料易产生的弊端，可使样品得以全部回收，具有分离容量大、性能强、 高效、快速的特点。通过控制实验条件，可以获得高纯度的3，5-二咖啡酰 奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸单体化合物(纯度大于 98%)。本发明方法适合于从各种工艺途径制备的含不同含量的二咖啡酰奎 宁酸类化合物的粗提物中制备高纯度的3,5-二咖啡酰奎宁酸，3,4-二咖啡酰 奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸单体化合物，适合于各种型号高速逆流色谱 仪制备3,5-二咖啡酰奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸单 体化合物，能直接使用大量二咖啡酰奎宁酸粗提物或其中几种的混合物或 其它类似合成物进行进样。
下面通过实施例及附图进一步说明本发明。必须说明下述实施例是用 于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行简 单的改进都属于本发明要求保护的范围。
图1为本发明的工艺流程图
图2为蒙古蒲公英粗提物半制备型高速逆流色谱的色谱图(HSCCC)
图3为蒙古蒲公英粗提物及各逆流色谱流份重结晶后的高效液相色谱的色
谱图(HPLC)
具体实施例方式
1.将蒙古蒲公英全草于50。C干燥，粉碎。取200g生药，置2000mL圆底 烧瓶中，加入75%乙醇1600mL，回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤
液，减压浓縮至无醇味，回收有机溶剂。将浓縮液进行D101大孔吸附树
脂柱层析，先用水洗至无醇味，再依次用20%， 40%的乙醇水溶液进行洗 脱，收集40%乙醇洗脱液，减压浓縮至无醇味，加入乙醇至含醇量80%， 滤去沉淀，取上清液真空干燥得含二咖啡酰奎宁酸类化合物粗品。将粗品 进行高速逆流色谱分离纯化，条件为转速800rpm;溶剂体系乙酸乙酯 -正丁醇-水(3:2:5, v/v);流速1.5mL/min;温度25 。C;上相为固定相， 下相为流动相；固定相保留率65%。逆流色谱的操作步骤为将HSCCC 溶剂体系按比例配制于分液漏斗中并剧烈振荡，体系分相平衡后分离出上 下相，分别超声脱气30min。将固定相泵入高速逆流色谱仪的螺旋管，待 螺旋管完全充满后，开启速度控制器，使高速逆流色谱仪按顺时针方向以 800 rpm旋转，同时以1.5 mL/min的流速泵人流动相。当体系达到流体动 力学平衡后，将样品由进样阀注入分离管路。柱后流出物以紫外检测器检 测。根据色谱图收集色谱峰组分，分离得到三个流份(粗提物的逆流色谱图 见图2)。将各流份冻干，用80%乙醇进行重结晶得高纯度的3,5-二咖啡酰 奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸单体化合物(工艺流程 图见图1)。
将分离得到的i， n和m号峰进行纯度检测。HPLC分析条件色谱
柱Symmetry C18 (100 mm x 3.9 mm i.d., 5 (im)，流动相为甲醇0.1%醋酸 (40:60)，流速0.8mL/min，检测波长326 nm，柱温30。C。在此条件下， 蒙古蒲公英粗提物及各逆流色谱流份重结晶后的高效液相色谱图见图3， 其中A为蒙古蒲公英粗提物色谱图，B为'T，部分即3,5-二咖啡酰奎宁酸色 谱图；C为"II"部分即3,4-二咖啡酰奎宁酸色谱图；D为"in"部分即4,5-二 咖啡酰奎宁酸色谱图。
结构鉴定通过化合物的紫外谱图，质谱，氢谱和碳谱与已知化合物 进行对照，确定化合物为3,5-二咖啡酰奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸。
3,5-二咖啡酰奎宁酸:UV ^ax (MeOH) nm: 220, 248, 300 sh, 329; ESI-MS w/z: 515 [M-H]—; !H隱NMR (CDOD3, 400 MHz) <5 7.59 (1H, d, /= 16.0 Hz, H陽7")， 7.55 (1H, d, 16.0 Hz, H-7'), 7.04 (2H, br s, H陽2' and H-2"), 6.94 (2H, br d, J= 8.4 Hz, H隱6' and H-6"), 6.75 (2H, d， /= 8.4 Hz， H-5' and H-5"), 6.33 (1H， d, /= 16.0 Hz, H-8')， 6.24 (1H, d， 16.0 Hz, H-8")， 5.39 (1H， m， H-5), 5.36 (1H， m, H-3), 3.94 (1H, (!， /= 4.4 Hz, H隱4), 2.16 (2H, m, H画2)， 2.29 (1H， br d, J= 13.2 Hz, H-6a), 2.16 (1H， m, H-6b); 13C-NMR (CDOD3, 100 MHz) 3 177.8 (s, C-7), 168.9 (s, C-9')， 168.3 (s, C-9"), 149.6 (s, C隱4'), 149.5 (s, C-4"), 147.0 (d, C画7'), 146.8 (s， 2C， C-3' and C-3"), 146,8 (d, C陽7"), 127.9 (s， C网l'), 127.8 (s, C-l"), 123.1 (d, C-6'), 123.0 (d, C-6"), 116.5 (d, 2C, C-5' and C-5"), 115.6 (d, C-8'), 115.2 (d, C画2'), 115.1 (d, 2C, C-8" and C-2")， 74.9 (s, C-l)， 72.6 (d， C隱5), 72.1 (d, C-3), 70.7 (d, C-4), 37.8 (t, C-2), 36.1 (t, C-6)。
3.4- 二咖啡酰奎宁酸UV Xmax (MeOH) nm: 220, 247, 300 sh, 330; ESI-MS m/z: 515 [M-H].; ^-NMR (CDOD3， 400 MHz) 3 7.61 (1H， d, /= 16.0 Hz, H-7'), 7.57 (1H, d， 16.0 Hz， H-7")， 7.08 (1H, br s， H-2'), 7.07 (1H, br s， H-2")， 6.95 (2H， br d, /= 8.4 Hz, H-6' and H画6"), 6.78 (2H, d， 8.4 Hz, H-5' and H-5"), 6.32 (1H， d, /= 16.0 Hz， H隱8')， 6.30 (1H, d， /= 16.0 Hz, H-8"), 5.68 (1H, br s, H-3), 5.16 (1H， br s, H-4), 4.27 (1H, br s, H-5)， 2.16 (2H, m, H-6)， 2.03 (2H, m, H-2); 13C-NMR (CDOD3， 100 MHz) 3 176,8 (s， C-7), 168.5 (s， 2C: C-9' and C-9")， 149.6 (s, 2C, C隱4' and C隱4"), 147.3 (d， 2C， C-7' and C-7"), 146.8 (s， 2C, C陽3' and C-3"), 127.8 (s, C陽l'), 127.7 (s, C-l"), 123.2 (d, 2C, C-6' and C-6"), 116.5 (d, 2C, C陽5' and C誦5"), 115.2 (d， 3C, C-8', C隱2' and C-2")， 115.0 (d, C-8")， 75.9 (s, C-l)， 75.3 (d， C隱4)， 70.1 (d, C-3), 67.0 (d, C-5), 39.6 (t, C-2), 37.7 (t, C-6)。
4.5- 二咖啡酰奎宁酸UV wx (MeOH) nm: 218, 247, 300 sh, 326; ESI-MS m/二 515 [M-H]陽；^-NMR (CD0D3, 400 MHz) 3 7.56 (1H， d, J= 5.6
Hz, H-7'), 7.48 (1H， d, 15.6 Hz, H-7"), 6.99 (IH， br s, H-2')， 6.96 (1H, br s, H陽2")， 6.88 (1H, d, J= 8.0 Hz， H誦6')， 6.85 (1H, d, /= 8.0 Hz, H-6"), 6.71 (2H， m, H-5' and H誦5")， 6.25 (1H， d， /= 15.6 Hz， H-8'), 6.15 (1H, d, 15.6 Hz， H-8")， 5.74 (IH， br s, H-5)， 5.09 (IH， (!， /= 7.2 Hz, H-4), 4.35 (1H, br s, H-3), 2.26 (2H， m, H-2), 2.26 (1H, m， H-6), 2.10 (1H， m， H-6); 13C-NMR (CDOD3, 100 MHz) (5 176.8 (s, C-7), 168.6 (s， C-9'), 168.3 (s， C-9"), 149.6 (s， 2C, C-4' and C-4"), 147.7 (d, C-7')， 147.5 (d, C-7"), 146.7 (s, 2C, C-3' and C-3"), 127.6 (s, C-l，)， 127.5 (s, C-r), 123.2 (d, 2G, C-6， and C-6")， 116.4 (d, 2G， C-5' and C-5")， 114.7 (d， 2C, C-8' and C-8")， 76.2 (s, C-l), 76.1 (s， C-4), 69.8 (d， C-3), 69.2 (d, C-5), 39.8 (t， C画6)， 38.5 (t， C-2)。
权利要求
1.一种高纯度3，5-二咖啡酰奎宁酸，3，4-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸的分离纯化方法，由粗提物的制备和分离纯化两部分组成，其特征在于a)取含二咖啡酰奎宁酸类化合物的植物为原料，粉碎或切成小段，用水或水-强极性的有机溶剂的混合液提取，浓缩提取液，回收溶剂，得浓缩液；b)取步骤a)得到的浓缩液经柱层析，水洗，然后用醇、酮或它们与水的混合溶剂洗脱；c)将步骤b)得到的洗脱液减压浓缩至无醇味或无酮味，干燥得二咖啡酰奎宁酸类化合物粗品；d)将步骤c)得到的粗品醇沉除杂后，使用高速逆流色谱一步分离和纯化，根据检测谱图接收目标成分流份；e)将步骤d)得到的流份减压浓缩至一定体积，真空干燥得目标化合物；f)将步骤e)得到的化合物，采用重结晶的方法进行精制，得到高纯度的3，5-二咖啡酰奎宁酸，3，4-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸单体化合物。
2. 根据权利要求1所述的高纯度3，5-二咖啡酰奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎 宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸的分离纯化方法，其特征步骤在于a)中所用原料 优选菊科蒲公英属植物蒙古蒲公英、碱地蒲公英、热河蒲公英、东北蒲公 英、反苞蒲公英、兴安蒲公英等市场上常见的蒲公英属植物药材；提取溶剂 为醇水混合溶剂，提取溶剂的重量为药材重量的1 20倍，提取时间为0.5 5 小时，提取次数为1 5次；步骤b)中柱层析所用介质为大孔吸附树脂、聚酰 胺、反相硅胶或葡聚糖凝胶类；步骤c)减压浓縮至无醇味或无酮味；步骤d)中除杂优选醇沉工艺，高速逆流色谱溶剂系统优选脂肪酯-脂肪醇-水或者卤代烃-脂肪醇-水进行；步骤e)中为真空干燥；步骤f)中重结晶溶剂为有机溶 剂或水-有机溶剂的混合液。
3. 根据权利要求1和2的提取植物，其中提取部位是根、茎、叶、种子、 花、皮，或者它们的混合物。
4. 权利要求3的植物提取物的制备方法，步骤a)中用70 80。/。的乙醇提 取，提取1 5次，每次用3 10倍量，每次提取0.5 4小时。
5. 根据权利要求2的植物提取物，其中步骤b)中柱层析所用介质为市售 的大孔吸附树脂或聚酰胺树脂以及改良的大孔吸附树脂或聚酰胺树脂，先用 0~15%的乙醇水溶液洗脱，再用30~40%的乙醇水溶液洗脱，收集30~40%的 乙醇洗脱液。
6. 根据权利要求5的制备方法，步骤c)的乙醇洗脱液浓縮后，先加入乙 醇至含醇量70~80%，除去沉淀，取上清液浓縮，得二咖啡酰奎宁酸类化合物粗品o
7. 权利要求1~6之一的二咖啡酰奎宁酸粗提物中二咖啡酰奎宁酸类化 合物的总含量为10%-90%。
8. 根据权利要求2中所述的3，5-二咖啡酰奎宁酸，3,4-二咖啡酰奎宁酸 和4,5-二咖啡酰奎宁酸的纯化制备方法，其特征在于，所述的歩骤d)中优选 脂肪酯-脂肪醇-水或者卣代烃-脂肪醇-水组成的溶剂体系进行高速逆流色谱， 脂肪酯可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯等；卤代烃可以是 氯仿、二氯甲垸或四氯甲垸等，脂肪醇可以是甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇。 在氯仿-甲醇-水体系中，优选用量体积比为2:2: 1;在乙酸乙酯-正丁醇-水体 系中，优选用量体积比为3:2:5，以上相为固定相，下相为流动相。
9. 根据权利要求8所述的一种高纯度二咖啡酰奎宁酸类化合物的制备方 法，其特征在于先用固定相存满逆流色谱仪柱子，调节主机转速，将流动 相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阔进样，根据检测器紫外图谱接收目标成分；其中主机转速正转为600 1200rpm，所述的流动相泵入 柱内的流速为0.5 5 mL/min，实验条件温度为10~30 。C。
10. 根据权利要求2所述的三个目标产物的纯化方法，其特征在于，所 述的步骤f)中，优选80%的甲醇或80%的乙醇进行重结晶。
全文摘要
本发明公开了一种高效分离制备高纯度二咖啡酰奎宁酸类化合物的方法，主要包括使用醇水溶液提取蒲公英属植物鲜品或干品，浓缩后进行柱层析分离，制备富含二咖啡酰奎宁酸类化合物粗提物，然后对粗提物再以高速逆流色谱进行分离纯化，最后采用重结晶的方法进行精制，得到高纯度的3，5-二咖啡酰奎宁酸，3，4-二咖啡酰奎宁酸和4，5-二咖啡酰奎宁酸。该方法适用于以各种途径获得的各种含二咖啡酰奎宁酸类化合物中的一种或几种成分的天然产物或天然产物提取物为原料制备高纯度单体，并且步骤简单，操作简便，效率高，成本低，易于重复，分离制备量大。使用该方法制备的二咖啡酰奎宁酸类化合物的纯度可达98％。
文档编号A61P39/00GK101343225SQ20081003215
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月26日 优先权日2008年8月26日
发明者张宇平, 施树云 申请人:施树云;张宇平