专利名称：防治糖尿病肾病的中药制剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治糖尿病肾病的中药制剂；本发明还涉及该中药制剂的 制备方法及其在制备防治糖尿病肾病的药物中的应用。
背景技术：
据世界卫生组织(WHO)报告，全球范围内的糖尿病(diabetic mellitus， 以下称DM)患者高达1.25亿，预计到2025年将增加到3. 8亿。我国近年来其 发病率以惊人的速度激增，随着我国国民经济的快速发展和人民生活水平的进 一步提高，发病率还将继续升高，估计现今的糖尿病总患病人数在3000万以 上。预计到2010年将超过5000万，成为世界上患病人数最多的国家。糖尿病 肾病(diabetes n印hropathy，以下称DN)是糖尿病最常见的并发症，发生率 大约在40%左右，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。目前在西方国家的终 末期肾功能衰竭患者中糖尿病肾病占首位，在我国糖尿病的发病率不断上升， 糖尿病肾病也将成为导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一。因此.糖尿病肾 病正在成为21世纪医学界将要面临的一个重要问题。
针对糖尿病肾病尚缺乏理想的治疗方法，预防其发生发展极为重要，迄今 为止尚未有能非常有效地阻止糖尿病肾病进程的药物。糖尿病属中医"消渴" 范畴，传统中药，特别是中药复方治疗糖尿病具有悠久历史，在糖尿病及并发 症的防治方面具有独特的思维和实践优势，成为糖尿病并发症尤其是糖尿病肾 病防治药物研发的主要方向之一。有文献报道(1)临床上大黄、黄芩及黄芩 苷、黄连及黄连素用于早期糖尿病肾病患者，可延缓糖尿病肾病的进展；(2) 大黄醇提物及大黄酸和大黄素、黄芩及黄芩苷、黄连及其总生物碱和黄连素对 实验性糖尿病肾病有对抗作用；(3)大黄多糖有降血糖作用。这些应用和研究说明大黄、黄芩和黄连及相应的有效成分有抗糖尿病肾病作用。但研究表明大 鼠长期使用大黄及其总蒽醌有肾毒性，大黄素是主要的毒性成分。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提出一种防治糖尿病肾病的中药制剂。 本发明所要解决的另一技术问题是提出该中药制剂的制备方法。 本发明所要解决的再一技术问题是提出该中药制剂在制备防治糖尿病肾病 的药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提出的防治糖尿病肾病的中药制剂，由黄 连总生物碱、黄芩总黄酮、大黄多糖和药学上可接受的辅料制备而成，其中， 黄连总生物碱、黄芩总黄酮和大黄多糖的质量比为黄连总生物碱黄芩总黄酮: 大黄多糖=1: (2-4): (0.5-2)。
本发明的大黄多糖采用如下方法制备而成大黄用乙醇进行脱脂，药渣加 水提取3次，合并滤液，浓縮，浓縮液经乙醇沉淀，沉淀物经水溶解后反复冻 融、进行超滤，留取分子量在10000以上的滤液，浓縮，干燥，得大黄多糖。
本发明的黄芩总黄酮采用如下方法制备而成将黄芩煎煮3次，滤过，滤
液离心后取上清液浓縮，调药液至pH2，保温，静置，滤过，沉淀用水洗至pH 5-7.0， 7(TC减压干燥，得黄芩总黄酮。
本发明的黄连总生物碱采用如下方法制备而成黄连用乙醇加热回流提取
2次，合并滤液，减压浓縮，加入硫酸溶解，滤过，滤液用石灰乳调pH9，滤 过，用硫酸调pH 1-2，加入氯化钠使含盐达10%，摇匀，静置24h，滤过，沉 淀水洗至pH 5， 6(TC下减压干燥，得到黄连总生物碱。 本发明中药制剂的制备包括如下步骤
黄芩总黄酮和大黄多糖按黄芩总黄酮:大黄多糖=4: 1 1: l质量比混合; 混合物和淀粉按混合物淀粉二2: 1的质量比混合，并按常规方法制成小丸包 普通薄膜衣；黄连总生物碱和微晶纤维素按黄连总生物碱微晶纤维素=1: 4质量比混合， 以2%PVPK30制粒，并以乙基纤维素和邻苯二甲酸二乙酯为缓释包衣材料进行包衣；
混合上述两种包衣小丸制成制剂，使黄连总生物碱黄芩总黄酮大黄多糖的 质量比为h (2-4): (0.5-2)。
本发明随后的药效学试验将证明，本发明中药制剂有降低正常小鼠血糖，减小 灌服淀粉后血糖曲线下面积，提高小鼠糖耐量作用；可改善糖尿病肾病模型大鼠多 食、多饮、多尿症状，减少尿蛋白及尿白蛋白，降低糖化血红蛋白、血胆固醇和血 甘油三酯，使过高的肌酐清除率有所降低，降低肾脏指数，减轻肾脏病变，具有抗 早期糖尿病肾病作用。
图1是本发明中药制剂的色谱图(HPLC-UV)(图中l.黄连碱；2.药根碱;3. 小檗碱；4.巴马汀；5.黄萃苷；6.汉黄苳苷；7.黄苳素；8.汉黄萃素)。
图2本发明中药制剂对正常小鼠血糖影响图{mean ± sd， n = 10。其中，制 剂组1:黄连总生物碱+黄芩总黄酮+大黄多糖0.125+0. 25+0. 25 g/kg(l:2:2);制剂 组2:黄连总生物碱+黄芩总黄酮+大黄多糖0. 125+0.25+0. 125 g/kg(1:2:1);制剂组 3:黄连总生物碱+黄芩总黄酮+大黄多糖0. 125+0. 50+0. 25 g/kg(l:4:2)。血糖单位 空腹、食后0.5、 1、 2 h血糖mmol/L，血糖-时间曲线下面积AUC:mmol/L*h}。
图3本发明中药制剂对糖尿病肾病大鼠饮食、饮水和尿量的影响图(mean ± sd, n = 10。其中，制剂组l:黄违总生物碱+黄芩总黄酮+大黄多糖0. 10 + 0.20 + 0.20 g/kg(l:2:2);制剂组2:黄连总生物碱+黄芩总黄酮+大黄多糖0. 10 + 0.20 + 0.10 g/kg(l:2:l);制剂组3:黄连总生物碱+黄芩总黄酮+大黄多糖0. 10 + 0. 20 + 0.05 g/kg(l:2:0.5)}。
图4本发明中药制剂对糖尿病肾病大鼠尿总蛋白、白蛋白和肌酐清除率的影响 图(mean ± sd， n = 10)(图中制剂分组同图3)。图5本发明中药制剂对糖尿病肾病大鼠糖化血红蛋白和肾脏指数的影响图 (mean±sd，n=10)(图中制剂分组同图3)。
图6本发明中药制剂对糖尿病肾病大鼠血脂的影响图(mean ± sd， n = 10) (图中制剂分组同图3)。
图7是本发明中药制剂对糖尿病肾病大鼠肾组织学的影响图(图中制剂分 组同图3)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅 用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容 之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰 同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
实施例1
1. 1制备大黄多糖
称取大黄药材400g，粉碎成粗粉，先用95%乙醇回流提取3次，每次加入 5倍量95%乙醇，回流l小时，弃去滤液；药渣挥干溶剂，加蒸馏水煎煮提取 3次，每次加入10倍量水煎煮2小时，合并滤液，浓縮至粗浸膏；粗浸膏冷却 至室温，加入95%乙醇，使含醇量达到80%，静置12小时，滤过得沉淀；沉淀 用蒸馏水充分溶解，5000转离心15分钟，取上清液；进行超滤,得分子量10000 以上的超滤液，浓縮，低温干燥，得大黄多糖5.3g。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量称取大黄多糖43. 05 mg，加蒸馏水定容 至250 mL，分别吸取0.5， l.OmL于试管中，加水补足2 mL;各管中加入5% 的苯酚溶液l mL，摇匀后迅速加入浓硫酸5 mL，密塞，室温静置30 min。酶 标仪上490 nm下测吸光度，用葡萄糖标准曲线法计算得出大黄多糖含量为63%。
1.2制备黄芩总黄酮
称取黄芩药材500g，粉碎成粗粉，第一次加10倍量水，煎煮2'.小时，第二、三次分别加8倍量水，各煎1小时，合并煎液，3000 rpm离心10 min， 取上清液浓缩至0. 25g生药/ml(8(TC );在8(TC时用2 mol/L盐酸调pH至1-2， 保温1小时，静置12小时；滤过，沉淀用水冼至pH 5-7， 7(TC减压千燥，得 总黄酮提取物43.2克，提取物中总黄酮含量67.8%，其中黄苳苷、汉黄吝苷、 黄芩素和汉黄芩素总和占65. 8%。 1. 3制备黄连总生物碱
称取黄连药材200g，粉碎成粗粉，以少量5(^乙醇浸泡lh (以浸没为准)， 加入10倍量50%乙醇溶液，加热回流提取2次，每次1.5h，趁热过滤，合并 滤液，7(TC下减压浓縮，得到浓縮液；加入浓硫酸使溶液含硫酸为0. 5%，滤过； 滤液用石灰乳调pH9，滤过；用硫酸调pH1-2，加入氯化钠使含盐达10%，摇 匀，静置24h，滤过；沉淀水洗至pH 5，减压干燥(6(TC)，得到黄连总生物 碱11.3克，提取物中总生物碱含量72%，其中小檗碱、巴马汀、黄连碱和药根 碱总和占57.2%。
1.4制备中药制剂
(1) 制剂1 :称取黄芩总黄酮2g、大黄多糖2g，混合；称取淀粉2 g，加入黄 芩总黄酮和大黄多糖的混合物中，按照常规方法制成小丸包普通薄膜衣；
称取黄连总生物碱lg、微晶纤维素4g，混合，以296PVPK30制粒，以乙基 纤维素和邻苯二甲酸二乙酯为缓释包衣材料进行包衣；
混合上述两种包衣小丸制成制剂，制剂中黄连总生物碱黄芩总黄酮大
黄多糖的质量比为1:2:2。
(2) 制剂2:称取黄芩总黄酮2g、大黄多糖lg，混合；称取淀粉1. 5 g，加入 黄芩总黄酮和大黄多糖的混合物中，按照常规方法制成小丸包普通薄膜衣；
称取黄连总生物碱lg、微晶纤维素4g，混合，以2MPVPK30制粒，以乙基 纤维素和邻苯二甲酸二乙酯为缓释包衣材料进行包衣；
:混合上述两种包衣小丸制成制剂，制剂中黄连总生物碱黄芩总黄酮大黄多糖的质量比为1:2:1。
(3)制剂3:称取黄芩总黄酮4g、大黄多糖2g,混合；称取淀粉3g，加入黄
芩总黄酮和大黄多糖的混合物中，按照常规方法制成小丸包普通薄膜衣；
称取黄连总生物碱lg、微晶纤维素4g，混合，以2呢PVPK30制粒，以乙基
纤维素和邻苯二甲酸二乙酯为缓释包衣材料进行包衣；
混合上述两种包衣小丸制成制剂，制剂中黄连总生物碱黄芩总黄酮大
黄多糖的质量比为1:4:2。
1. 5中药制剂中黄芩总黄酮和黄连总生物碱含量的测定 取本实施例制得的中药制剂10 mg，精密称定，加50%甲醇10 mL超声处
理60min后，称重补足所失重量，9600 r/min离心10 min后取上清稀释十倍 进样分析。
采用分光光度法波长277 nm测吸光度，以黄芩苷标准曲线计算黄芩总黄 酮含量；波长346nm测吸光度，以小檗碱标准曲线计算黄连总生物碱含量。
HPLC色谱条件SUPELCO discover C18柱(4. 6X250mm， 5 (im);流动相 甲醇-2%甲酸水溶液(0. 1%三乙胺)；梯度洗脱0， 20， 30， 40， 55 rain甲 醇分别为20%， 30%， 30%， 55%， 80%;流速1. 0 mL min-1;柱温40°C; 进样体积30|aL;紫外检测波长346nm。如图1所示。
实施例2
2. 1制备大黄多糖
称取大黄药材8000g，粉碎成粗粉，用95%乙醇回流提 3次，每次加入5 倍量95%乙醇，回流l小时，弃去滤液；药渣挥干溶剂，加蒸馏水煎煮提取3 次，每次加入10倍量水煎煮2小时，合并滤液，浓縮至粗浸膏；粗浸膏冷却 至室温，加入95%乙醇，使含醇量达到80%，静置12小时，滤过得沉淀；沉淀 用蒸馏水充分溶解，5000转离心15分钟，取上清液；进行超滤,得分子量10000 以上的超滤液，浓縮，低温干燥，得大黄多糖106.6 g。 .采用苯酚-硫酸法测定多糖含量称取大黄多糖45.00mg，加蒸馏水定容至 250 mL，分别吸取0.5， 1.0 mL于试管中，加水补足2 mL;各管中加入5%的 苯酚溶液1 mL，摇匀后迅速加入浓硫酸5 mL，密塞，室温静置30 min。酶标 仪上490 nm下测吸光度，用葡萄糖标准曲线法计算得出大黄多糖含量为65%。
2. 2制备黄芩总黄酮
称取黄芩药材3000g，粉碎成粗粉，第一次加10倍量水，煎煮2小时，第 二、三次分别加8倍量水，各煎1小时，合并煎液，3000 rpm离心10 min离 心，取上清液浓縮至0. 25g生药/ml (8(TC);在8(TC时用2 mol/L盐酸调pH 至1-2，保温l小时，静置12小时；滤过，沉淀用水洗至pH 5-7， 7CTC减压 干燥得黄芩总黄酮提取物258.0克，提取物中总黄酮含量68.0%，其中黄芩苷、 汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素总和占64.8%。 2. 3制备黄连总生物碱-
称取黄连药材2000g，粉碎成粗粉，以少量50%乙醇浸泡lh (以浸没为准)， 加入10倍量50%乙醇溶液，加热回流提取2次，每次1. 5h，趁热过滤，合并 滤液，与7(TC下减压浓縮，得到浓縮液；加入浓硫酸使溶液含硫酸为0.5%， 滤过；滤液用石灰乳调pH 9，滤过；用硫酸调pH 1-2，加入氯化钠使含盐达 10%,摇匀，静置24h，滤过；沉淀水洗至pH5，减压干燥(60°C)，得到黄连 总生物碱112.4克，提取物中总生物碱含量73%，其中小檗碱、巴马汀、黄连碱 和药根碱总和占59.2%。
2.4制备中药制剂
(1)制剂l:称取黄芩总黄酮60g、大黄多糖60g，混合；称取淀粉60g，加
入黄芩总黄酮和大黄多糖的混合物中，按照常规方法制成小丸包普通薄膜衣； 称取黄连总生物碱30克、微晶纤维素120克，混合，以2WPVPK30制粒，
以乙基纤维素和邻苯二甲酸二乙酯为缓释包衣材料进行包衣；
混合上述两种包衣小丸制成制剂，制剂中黄连总生物碱黄芩总黄酮大黄多糖的质量比为1:2:2。
(2) 制剂2:称取黄芩总黄酮60g、大黄多糖30g，混合；称取淀粉45g，加
入黄芩总黄酮和大黄多糖的、浪合物中,按照常规方法制成小丸包普通薄膜衣；
称取黄连总生物碱30克、微晶纤维素120克，混合，以2MPVPK30制粒， 以乙基纤维素和邻苯二甲酸二乙酯为缓释包衣材料进行包衣；
混合上述两种包衣小丸制成制剂，制剂中黄连总生物碱黄芩总黄酮大
黄多糖的质量比为1:2:1。
(3) 制剂3:称取黄芩总黄酮60g、大黄多糖15g，混合；称取淀粉37. 5g， 加入黄芩总黄酮和大黄多糖的混合物中，按照常规方法制成小丸包普通薄膜 衣；
称取黄连总生物碱30克、微晶纤维素120克，混合，以2WPVPK30制粒， 以乙基纤维素和邻苯二甲酸二乙酯为缓释包衣材料进行包衣；
混合上述两种包衣小丸制成制剂，制剂中黄连总生物碱:黄芩总黄酮大 黄多糖的质量比为1:2:0.5。
2. 5中药制剂中黄芩总黄酮和黄连总生物碱含量的测定
取本实施例制得的中药制剂10 mg，精密称定，加50%甲醇10 mL超声处 理60min后，称重补足所失重量，9600 r/min离心10 min后取上清稀释十倍 进样分析。
采用分光光度法波长277rim测吸光度，以黄苓苷标准曲线计算黄芩总黄酮 含量；波长346nm测吸光度，以小檗碱标准曲线计算黄连总生物碱含量。
HPLC色谱条件SUPELCO discover C18柱(4. 6X250mm， 5拜)；流动相 甲醇-2%甲酸水溶液(0. 1%三乙胺)；梯度洗脱0， 20， 30， 40， 55 min甲 醇分别为20%， 30%， 30%， 55%， 80%;流速l.OmL'min-1;柱温40。C; 进样体积30nL;紫外检测波长346nm。
试验例l(对小鼠血糖的影响)正常雄性昆明种小鼠(体重20±2g，合格证号SCXK (沪)2007-0005， 上海市斯莱克实验动物饲养有限公司提供)，按照体重随机分为5组，即阴性 对照组、制剂3组(实施例l制得)、格列喹酮组(30mg/kg)，连续灌胄给药 5天，未次给药后，2小时后测各组小鼠空腹血糖和灌服淀粉(4g/kg)后0. 5h， lh， 2h血糖值，并计算血糖曲线下面积，试验结果如图2所示。
图2的试验结果表明，本发明中药制剂能降低正常小鼠的血糖，减小灌服 淀粉后血糖曲线下面积，提高小鼠的糖耐量(p〈0. 01)。
试验例2 (对糖尿病模型大鼠肾病的对抗作用试验)
雄性SD大鼠，体重(90士10 g，合格证号SCXK (沪)2007-0005，上海市 斯莱克实验动物饲养有限公司提供)，禁食不禁水12h后，随机分成模型组和 正常组。模型组采用高糖高脂5周后，给予腹腔注射196STZ(40 mg/kg)造模， 正常对照组给予等容量溶媒，72小时后，空腹血糖>16.711111101/1^，尿糖在+++ 以上作为糖尿病造模成功大鼠，模型成功后再随机分成制剂3组(实施例2制 得)、生理盐水组(模型组)和阳性对照组(二甲双胍100mg/kg)，用药过程 中持续监控大鼠体重、饮水、饮食、尿量，血糖、尿糖，尿总蛋白和尿白蛋白、 用药13周后测定血糖、糖化血红蛋白、血脂、肾脏指数和肾功能及组织学变 化。试验结果如图3-7所示。
试验结果表明本发明中药制剂可改善大鼠多食、多饮、多尿症状，减少 尿蛋白及尿白蛋白，降低糖化血红蛋白、血胆固醇和血甘油三酯，使过高的肌 酐清除率降低，本发明中药制剂还可降低肾脏指数(图3-6);
组织学检査见模型组大鼠肾脏出现远曲小管细胞肿胀、水样变性、空泡变 性和部分萎縮，制剂组及阳性组的大鼠肾脏病变减轻(如图7)。 图3-7结果表明本发明中药制剂对早期糖尿病肾病有对抗作用。
权利要求
1、一种防治糖尿病肾病的中药制剂，其特征在于，由大黄多糖、黄芩总黄酮、黄连总生物碱和药学上可接受的辅料制备而成，其中，黄连总生物碱、黄芩总黄酮和大黄多糖的质量比为黄连总生物碱∶黄芩总黄酮∶大黄多糖＝1∶(2-4)∶(0.5-2)。
2、 根据权利要求l所述的防治糖尿病肾病的中药制剂，其特征在于，大黄多糖采用如下方法制备而成大黄用乙醇进行脱脂，药渣加水提取3 次，合并滤液，浓縮，浓縮液经乙醇沉淀，沉淀物经水溶解后反复冻融、进 行超滤，留取分子量在10000以上的滤液，浓縮，干燥，得大黄多糖；黄芩总黄酮采用如下方法制备而成将黄芩煎煮3次，滤过，滤液离心后取上清液浓縮，调药液至pH2，保温，静置，滤过，沉淀用水洗至pH5-7.0， 7(TC减压干燥沉淀，得黄芩总黄酮；黄连总生物碱采用如下方法制备而成黄连用乙醇加热回流提取2次，合并滤液，减压浓縮，加入硫酸溶解，滤过，滤液用石灰乳调pH 9，滤过， 用硫酸调pH1-2，加入氯化钠使含盐达10%，摇匀，静置24h，滤过，沉淀水 洗至pH 5， 6CTC下减压干燥，得到黄连总生物碱。
3、 制备权利要求1或2所述的防治糖尿病肾病的中药制剂的方法，其特 征在于，包括如下步骤黄芩总黄酮和大黄多糖按黄芩总黄酮:大黄多糖=4: 1 1: 1质量比混合; 混合物和淀粉按混合物淀粉二2: 1的质量比混合，并按常规方法制成小丸 包普通薄膜衣；黄连总生物碱和微晶纤维素按黄连总生物碱微晶纤维素=1: 4质量比混合，以2Q/。PVPK30制粒，并以乙基纤维素和邻苯二甲酸二乙酯为缓释包衣材 料进行包衣；混合上述两种包衣小丸制成制剂，使黄连总生物碱黄芩总黄酮大黄多糖的质量比为l: (2-4): (0.5-2)。
4、权利要求1或2的中药制剂在制备防治糖尿病肾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种防治糖尿病肾病的中药制剂，由大黄多糖、黄芩总黄酮、黄连总生物碱和药学上可接受的辅料制备而成。药效学试验证明，本发明中药制剂有降低正常小鼠血糖，减小灌服淀粉后血糖曲线下面积，提高小鼠糖耐量作用；可改善糖尿病肾病模型大鼠多食、多饮、多尿症状，减少尿蛋白及尿白蛋白，降低糖化血红蛋白、血胆固醇和血甘油三酯，使过高的肌酐清除率有所降低，降低肾脏指数，减轻肾脏病变，具有对抗早期糖尿病肾病的作用。另外，本发明还公开了该中药制剂的制备方法及其在制备防治糖尿病肾病的药物中的应用。
文档编号A61P3/10GK101675950SQ20081004378
公开日2010年3月24日 申请日期2008年9月18日 优先权日2008年9月18日
发明者吴家胜, 宁 张, 程能能, 马越鸣 申请人:上海中医药大学;复旦大学