一种人胱硫醚β-合成酶重组蛋白及应用的制作方法

专利名称：一种人胱硫醚β-合成酶重组蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种重组人胱硫醚e-合成酶(rhCBS)原核高效表 达技术及重组蛋白在制备用于防治心血管疾病的药物应用，通过对完整的人CBS cDNA 进行克隆，独立构建人CBS的原核表达体系，并表达出具有野生活性的重组CBS蛋白， 利用心血管细胞体外培养模型和大鼠高同型半胱氨酸血症模型确定重组CBS蛋白作为 药物的治疗作用。
技术背景同型半胱氨酸是甲硫氨酸循环过程中一个代谢中间产物。近年来的研究已确认， 高同型半胱氨酸血症与作为人类第一杀手的动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死等多种 心血管疾病的发生有密切关系，是心血管疾病的一个新的独立的和重要的危险因素.对 高同型半胱血症的有效抑制已成为心血管疾病防治的一个极为重要的医学途径。HCY在体内存在两种代谢途径重新甲基化合成甲硫氨酸，或通过转硫途径经胱硫 醚转变为半胱氨酸。其间，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、胱硫醚P-合成酶及甲硫 氨酸合成酶(MS)是HCY代谢所必需的三个关键酶；这些酶活性减小或缺失，或者其 相应辅酶如VitB6, VitB^和叶酸的缺乏，将导致HCY代谢异常，血浆浓度升高。研究 发现，CBS的转硫途径负责转化体内46%的HCY，其对HCY的转化能力是由MS和BHMT 所催化的两个甲基化代谢途径的近两倍，CBS的基因表达和功能状态对维持正常的HCY 血浆水平至关重要，CBS酶基因的部分缺失，或因营养原因导致辅酶缺失即可引起高同 型半胱氨酸血症；c&转基因小鼠实验表明，CBS的高表达则可以降低血浆HCY的水平。 然而，以目前人类遗传性缺陷的发生率及基本营养状况却难以诠释高同型半胱氨酸血 症的高发病率，高同型半胱氨酸血症患者的个体研究也表明，有相当比例的患者不存 在遗传性缺陷和营养素缺乏的原因。高同型半胱氨酸血症的病因学机制至今尚不清楚， 还难以从阻断病因的途径达到高同型半胱氨酸血症致心血管功能的损伤作用及其发病 机制，有关高同型半胱氨酸血症动物模型等未能有系统体系，而对高同型半胱氨酸血 症的治疗措施只是普遍采用外源性给予辅酶VitB6、 VitB,2和叶酸的方法以强化上述代 谢酶，但临床效果多不理想。CBS定位于胞浆，是由63kDa亚基(551个氨基酸)构成的同源四聚体。CBS是一个血红 素蛋白，属于吡哆醛磷酸(PLP)依赖酶中的B族。每个亚基与血红素及PLP这两个辅助因 子结合。人CBS包括一个血红素结合区、 一个高度保守的催化结构域和一个调节结构域。 血红素结合于N-端前70个氨基酸残基,该区域Cys52和His65为血红素铁离子的结合残 基。研究表明，血红素并不参与催化步骤，但其铁离子的氧化还原状态可影响全酶的催化速率。高度保守的催化结构域位于第40 413氨基酸残基，可形成45kDa的活性中心。 该区域Lysll9残基为PLP结合残基，PLP是CBS催化反应所必需的依赖因子。C-端140个氨 基酸残基构成的调节结构域对于人CBS四聚体的形成和酶的活化起重要的作用，它包含 所谓"CBS结构域"，该疏水性系列包含第415 468氨基酸残基，它的功能尚不清楚。C-端调节结构域包含一个S2腺苷蛋氨酸(adenosylmethionine， AdoMet)结合位点的自我 抑制区，其结合位点在氨基酸残基第421 468处。AdoMet是蛋氨酸代谢过程中的重要调 节枢纽，它是CBS的变构激活剂，也是5， 10-亚甲基四氢叶酸还原酶 (5， 10-methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR)和甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转 移醇(betaine—homocys—teinemethyltransferase， BHMT)催化反应白勺变构抑制剂。目前，许多研究已表明，CBS在同型半胱氨酸血症发生过程中发挥至关重要的作用, 其活性缺失或点突变均可导致人CBS酶活性降低，这种活性的降低与高同型半胱氨酸 血症的发生具有密切的相关性，而有关CBS在同型半胱氨酸血症中的药用研究尚未见报 道，但对其分子结构及生物学特性已获得了相当深刻的认识；人CBS基因已被克隆， 但是国内未见CBS酶克隆表达及药用应用性研究。我们在己有研究的基础上加以改进， 建立了制备CBS重组蛋白的基因工程技术平台，表达纯化出具有生物活性的重组CBS 蛋白；并且建立高同型半胱氨酸血症的动物模型，高同型半胱氨酸血症治疗效果的检 测和评价体系，在此模型基础上，观察到重组CBS蛋白可以显著促进高浓度HCY水平下 人内皮细胞的存活，显著降低血中HCY水平，保护心血管系统，显著降低高HCY导致 的心血管系统的损伤。对CBS作为治疗高同型半胱氨酸血症的生物药物的研制技术路 线进行了设计并且进行了其应用性实验。 发明内容本发明的目的在于提供一种可以治疗高同型半胱氨酸血症的生物制剂(rhCBS蛋 白)，及大量制备有活性的rhCBS的生物工程制备方法，其特征是对人CBS基因进行克 隆，单独构建CBS原核表达体系，获得具有生物学活性的rhCBS蛋白，并确定rhCBS 蛋白在高同型半胱氨酸血症中的治疗作用。本发明采用下述技术方案(1) 人CBS基因的获取及pET-32a-CBS重组质粒的构建(2) BL21-CBS工程菌的构建及rhCBS蛋白的表达和纯化(3) rhCBS蛋白活性测定(4) rhCBS蛋白治疗高同型半胱氨酸血症的应用(5) rhCBS蛋白与叶酸、VitB6、 VitB12治疗高同型半胱氨酸血症效果评价及在治 疗相关心血管疾病的应用所建立的工艺稳定、纯度高、活性好。本发明的主要特点为 1.利用原核表达系统成功表达了具有野生活性的rhCBS，并且根据已知的CBS的 生物学活性，基于我们对有关rhCBS对组织细胞内和细胞培养液中HCY水平的影响，且发现rhCBS蛋白对高水平HCY作用下的内皮细胞和心肌细胞具有保护功能，可以显 著降低大鼠高同型半胱氨酸血症模型中血中HCY水平，显著减轻高同型半胱氨酸导致 的心血管损伤，提出以rhCBS作为治疗高同型半胱氨酸血症及其相关心血管疾病的生物 制剂。2. 建立了评价外源性rhCBS治疗高同型半胱氨酸血症效果的评价体系。包括整 体动物血浆，心血管功能损伤及恢复的监测，离体细胞HCY水平的检测方法，心血管 细胞损伤的检测方法等。3. 建立了 rhCBS高效表达的技术路线。包括重组DNA技术的运用，正交实验设 计确定最佳诱导表达时间、温度及IPTG浓度的方法，从而使产物以可溶形式表达并且 具有野生型活性，并且提高了产物的表达量，增加了 rhCBS蛋白与HCY的特异性结合 能力及其转硫催化能力。说明书附l CBS PCR扩增测序。PCR扩增，对DNA进行序列测定。图2 CBS基因克隆。1 DNA marker;泳道2-5 PCR扩增产物；在1200-2000bp之 间约1600bp位置特异性DNA条带，箭头所示即为PCR扩增的CBS DNA条带。图3 rhCBS蛋白表达。泳道1,蛋白Marker; 2, BL21正常菌；3， BL21 (转化 pET-32a-CBS质粒)诱导菌；在泳道3分子量70kD左右出现特异性蛋白条带，箭头所示 即为rhCBS蛋白。图4 rhCBS蛋白Wtstern Blotting鉴定。1,正常兔血清；2， CBS多克隆抗体。 抗原均是rhCBS蛋白，上样量30ug;血清与抗体1: 500稀释，羊抗兔二抗1: 5000 稀释。图5 rhCBS蛋白活性测定。按实施例6的方法进行测定，*P<0. 05与肝组织蛋白 比较。图6 rhCBS蛋白对细胞培养液中HCY水平的影响。按实施例7的方法进行，培养 的细胞为人脐静脉内皮细胞^P〈0. 05与对照组比较，对照组为添加等浓度的BSA蛋白。图7 rhCBS蛋白对培养大鼠心肌细胞和人脐静脉内皮细胞死亡率的影响，采用 lOmmol/L HCY干预培养细胞24h，其中对照为肝组织蛋白。*P<0. 05与对照组比较。图8 rhCBS蛋白与叶酸、VitB6、 VitB12分别对大鼠血浆高同型半胱氨酸水平的影响。*P<0.05与高蛋氨酸组比较；弁PO.05与叶酸、VitB6、 VitB12组比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 实施例1一种重组人胱硫醚e-合成酶(rhCBS)的制备方法，其特征是对人CBS基因进行克隆，单独构建rhCBS原核表达体系，获得具有生物学酶活性的rhCBS蛋白，具体步 骤包括构建pET-32a-CBS表达质粒；转化BL21宿主菌；表达、分离纯化具有酶活 性的rhCBS蛋白。 实施例2CBS基因克隆的获取鉴于大肠杆菌对氨基酸密码子的偏爱与人体细胞的差异，本发明设计合成了人基因5'端含大肠杆菌偏爱密码子的DNA片段，它可以在不改变产物人CBS的氨基酸组成与 排列顺序的基础上，提高CBS在大肠杆菌中的表达水平；以Genbank报道的人CBS全 cDNA序列为基础，在CBS基因的上下游的非编码区和编码区设计了两对引物，非编码 区引物1 Pl(上游引物)P2(下游引物)；在编码区设计并合成引物2 P3(上游引物) P4(下游引物)，用此对引物扩增含起始密码子ATG的CBS目的基因。其中引物P3(上游 引物)引入酶切位点EcoR I ，引物P4(下游引物)引入酶切位点BamH I及相应的保护碱 基。引物由上海英骏生物公司合成。参见表l，采用巢式PCR扩增全长CBS。引物序列扩增片断长度Pl5' CACCAGGATCCCATGACAGATTCTGTTG3，P25' GTCACGTTCTGGAACATTCTGTCATCAC3，2021 bpP35' CGGAATTCCAGCACATCTGTCCGGTCCA3，P45' CCGAAGCTTCCAGGCCAGGCAGTTACCAAT3，1700 bp采用微量异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法自人肝癌细胞系H印G2纯化总RNA，使 A260/A280比值〉1. 8，取10 yl (约5 u g)总RNA，加50 pmol 3'端引物，70。C热 变性5min，室温冷却使其自然降温，待降至室温后，42'C水浴中依次加入下列样品 反转录反应体系5 x反转录缓冲液 5 ul RNA酶抑制剂 20U 40nM焦磷酸钠 3 P 1AMV逆转录酶 15U (1 y 1)dNTP (各2. 5mM) 2 y 1加无RNA酶水至 25 ii 1上述混合物42"C水浴60min，加H20 75 ul 7(TC作用5min灭活反转录酶，该反应 物可作为PCR扩增的起始模板，取反转录产物20ul，加入下列成分2 x Pfu 10u 1Pl引物 20pmo1 P2引物 20pmo1 力口 H20至 20 u 1上述混合物反应条件95°C、 4min; 95°C lmin、 56°C 60s、 72°C 3min，进行30个循环的扩增反应后延伸10min，取反应物进行电泳鉴定，观察到2kb左右处的条带； 用凝胶回收试剂盒回收此区域条带，再以此回收产物为模板，用引物2进行PCR扩增， 反应条件95°C、 5min;95°C lmin、 55°C 60s、 72°C 4min，进行35个循环的扩增 反应后延伸10min结果在1700bp左右见单一条带，与CBS序列长度一致。图2所示 实施例3人CBS基因在大肠杆菌中的表达及序列分析表达载体的构建可通过以cDNA为模板扩增CBS基因全长，经限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切目的基因产物和表达载体质粒pET-32a,经琼脂糖凝胶电泳分离和 回收得到两DNA片段等摩尔混合，T4 DNA连接酶12-16。C连接反应过夜，连接物 pET-32a-CBS重组质粒转化入CaCl2处理的E.Coli BL21中，经氨节青霉素筛选培养。 挑选单个菌落，制备质粒，用限制性内切酶酶切鉴定，含有人CBS基因片段并且插入 方向正确者为目的工程菌；测定CBS基因序列，经Blast比对，与Genbank报导的100% 匹配，见图l。它能在大肠杆菌BL21中高效表达，使CBS占菌体总蛋白的20%左右，表 达率经100次以上传代不降低。图3工程菌在37匸条件下用液体LB培养基扩增培养、通过对温度、IPTG和诱导时间三 个变量的正交实验设计，最后确定工程菌的最佳诱导表达条件为30°C、 0.5mmol/L IPTG、诱导4h，此时rhCBS蛋白以可溶性形式存在，在70kd左右多出一条特异性蛋白 条带，该蛋白能与人CBS多克隆抗体呈现特异反应。见图4 实施例4rhCBS蛋白的分离纯化根据实施例2的方法，在1L LB液体培养基大量表达rhCBS蛋白，以10: 1浓縮 菌液，加入lmg/mL溶菌酶，-7(TC反复冻融3次，在30%能量，6s/6s时间间隔超声破 碎。经12000rpm离心10min，收集上清，按利用法玛西亚公司的HisTr即纯化试剂盒 进行纯化。lml HisTrap预装柱经平衡液平衡8ml——上样(lml上清液，流速0. 2ml/min)— 一柱洗涤液洗涤8ml——20隱ol/L咪磋洗脱液预洗脱8ml——300ramol/L咪磋洗脱液洗 脱——收集2-8ml洗脱液，收集70kd的rhCBS洗脱液，再经透析袋(截流分子量约10kd) 透析过夜，其间换液4次，将透析后的样品冷冻千燥，-7(TC保存。 实施例5rhCBS蛋白的鉴定按实施例3制备的rhCBS蛋白用SDS-PAGE法检定纯度，所用积层胶为5%，分离胶 为10%;检测结果显示，纯度均在98%以上。经Western Bloting鉴定，选用人CBS 多克隆抗体为一抗，4t孵育过夜，洗膜三次，山羊抗兔二抗孵育lh，洗膜三次，ECL 显影，在70kd处可见清晰的特异性条带，表明rhCBS蛋白可以被多克隆抗体识别，具 有抗原性，适合进一歩实验。见图4。实施例6rhCBS蛋白活性测定rhCBS体外酶活测定，参照相关文献[Kraus, 1987]的测定方法。整个反应体系 为100niMTris-HCl(pH8. 6)， 10mM ['t]丝氨酸(1000cpm/nmol) (Bio-Rad) ， 1,5mM丝 氨酸，0.5 mg/ml BSA， 4 mM L-胱硫醚，0. 5 mM PLP, 0.5 mM AdoMet，体系中加入 150ug重组CBS纯品蛋白。添加15禮L-同型半胱氨酸启动整个反应，在37。C孵育 4小时。反应体系离心，10ul上清液点在薄色谱板上，TLC在异丙醇甲酸水(80:6:20 v/v)液体中层析分离。以L-胱硫醚标准品指示反应产物位置，切下相应色谱区，浸入 闪烁液(含0. 5% PP0和0. 04% P0P0P的甲苯)中，用Phosphoi隨ger (Tri-Carb 2證R' Packard-Perkin Elmer, Boston, MA)测定[MC]胱硫醚放射性活性，用nmol/h'mg protein表示CBS活性，同时设立对照组为新鲜肝组织蛋白(肝中CBS酶活性最高)； 不同三人重复测量3次，取平均值。结果原核表达纯化的rhCBS蛋白活性可达到 117.8,1/h'mg'显著高于肝组织中的酶活性，见图5。同时rhCBS可以明显降低培养 细胞液中的HCY的水平，见图6。表明rhCBS蛋白可以应用于体外的应用。 实施例7rhCBS蛋白对心血管细胞的保护作用体外常规培养大鼠心肌细胞，在细胞培养液加入10—2M HCY，同时给予0.8 mM PLP， 0.8mM AdoMet， 12mM丝氨酸，加入rhCBS蛋白0.2mg/ml，作用4h，检测心肌细胞培 养液中HCY浓度变化，并检测心肌细胞的死亡率。结果显示:rhCBS蛋白使心肌细胞培养 液中HCY含量降低32。/。，心肌细胞死亡率降低3. l倍。表明外源性rhCBS蛋白对高水平HCY 作用下的心肌细胞具有保护功能。见图7A体外常规培养人脐静脉内皮细胞，在细胞培养液加入10—2MHCY，同时给予0.8mMPLP, 0.8mM AdoMet， 12mM丝氨酸，加入rhCBS蛋白0.2rag/tnl，作用4h，检测内皮细胞培 养液中HCY浓度变化，并检测内皮细胞的功能及死亡率。结果显示，rhCBS蛋白使内皮 细胞培养液中HCY含量降低39。/。，内皮细胞死亡率降低4.2倍。表明外源性rhCBS蛋白对 高水平HCY作用下的内皮细胞具有保护功能。见图7B以上的结果显示,rhCBS可以显著降低高HCY对心血管细胞的损伤作用， 实施例8rhCBS蛋白对大鼠高同型半胱氨酸血症的保护作用成年Wistar大鼠，雌雄各半，体重180-200g，随机分为对照组，高蛋氨酸组，高 蛋氨酸+叶酸组，高蛋氨酸+维生素B12 、高蛋氨酸+维生素B6组，高蛋氨酸+ rhCBS 组，每组12只，正常组给予正常饲料，高蛋氨酸给予高蛋饲料喂养，建立大鼠高同型 半胱氨酸血症模型。结果显示，叶酸组、维生素B12、维生素B6组、rhCBS组均可以使 高同型半胱氨酸血症大鼠血浆HCY水平降低，rhCBS组降低最显著，与高蛋氨酸组比较， 降低约4.4倍，通过rhCBS治疗后，大鼠血浆HCY水平基本恢复到正常水平，见图8。大鼠主动脉和心肌病理切片显示叶酸组、维生素B12组、维生素B6组、rhCBS组与高蛋氨 酸组比较，均可以减轻心血管损伤，其中rhCBS组的保护作用最明显。表明外源性rhCBS 蛋白可以显著降低高同型半胱氨酸血症大鼠血中HCY水平，抑制高同型半胱氨酸对心血 管系统的损伤作用，rhCBS蛋白可以作为治疗高同型半胱氨酸血症引起的心血管疾病。 治疗效果优于传统的治疗高同型半胱氨酸血症的叶酸、维生素B12、维生素B6，效果更 为显著。
权利要求
1.重组人胱硫醚β-合成酶(rhCBS)在制备用于治疗或预防高同型半胱氨酸血症及其相关的糖尿病和心血管疾病的药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的rhCBS，其特征是与Genbank中收录的人CBS蛋白有90%以上 的同源性的重组蛋白。
3. 根据权利要求1和2所述的rhCBS，其制备方法是可以是但不仅限于以下重组方法， 主要歩骤包括① 构建pET-32a-CBS表达质粒，转化大肠杆菌，如BL21。② 在BL21宿主菌中表达、分离纯化具有酶活性的rhCBS蛋白；(D在纯化的rhCBS蛋白中加入可接受的药用辅料，制备成药学和临床可接受制剂。
全文摘要
本发明公开了一种重组人胱硫醚β-合成酶(rhCBS)在制备用于治疗或预防高同型半胱氨酸血症及其相关的糖尿病和心血管疾病的药物中的应用及其制备方法。制备方法主要采用大肠杆菌原核表达系统，经过表达条件的优化，获得活性很高的rhCBS；rhCBS能够显著降低细胞培养液中HCY浓度，显著提高心肌细胞、内皮细胞在高HCY水平下的存活率；在高同型半胱氨酸血症整体动物模型中，与传统的治疗高同型半胱氨酸血症的叶酸、VitB₆、VitB₁₂比较，rhCBS能够显著降低高蛋氨酸喂养的大鼠血浆中的HCY水平，减轻心肌和血管的损伤，具有非常明显的治疗高同型半胱氨酸血症的作用。rhCBS可以应用于制备治疗或预防高同型半胱氨酸血症及其心血管疾病的药物，具有广阔的市场前景。
文档编号A61P9/00GK101322840SQ20081005328
公开日2008年12月17日 申请日期2008年5月28日 优先权日2008年5月28日
发明者雪 冷, 杲修杰, 云 赵, 钱令嘉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所