专利名称：一种具有低抗血凝性肝素－紫杉醇抗癌药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有低抗血凝性能和强抗癌性能的化学键合型抗癌药物。
背景技术：
紫杉醇是六十年代美国化学家从红豆杉中提取出来的具有独特抗癌活性的 药物，治疗乳腺癌，卵巢癌等非常有效，近年来十分广泛地应用于临床研究，但 是由于其溶解性极差等原因，限制了它的应用范围。我国的云南、陕西、黑龙江 等地培植了大片的红豆杉林，具有丰富的天然资源，研究以紫杉醇为活性成分的 纳米抗癌靶向药物，有利于我国天然资源的利用，为我国深度开发紫杉醇提供了 新的途径。化学键合型纳米靶向抗癌药物系统，就是通过化学键合的方式将药物 包裹在可降解载体中，制备成纳米量级，利用受体介导系统直接将药物载入肿瘤 区域，提高靶向性，同时又可大大提高药物在患部的相对浓度。由于载药纳米微 粒较小，比表面积大，对受体组织的黏附性大，给药后滞留性及与组织的接触时 间，接触面积大为增加，从而提高药物的生物利用度，降低毒性，减少药剂量， 对纳米抗癌靶向药物系统的研究具有深远意义。虽然肝素的应用对癌症病人的治 疗有一定好处，但是由于肝素本身高抗凝性质会限制其在临床中的应用，因此在 肝素应用于临床抗凝剂的应用是需要进行化学修饰的，通过对药物输送系统的抗 凝性质进行评价，说明制备的药物输送系统具有较好的安全性，能够避免在注射 过程中载体引起的流血不止的情况。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以肝素衍生物为载体制备出肝素一紫杉醇抗癌
药物，该肝素一紫杉醇抗癌药物输送系统不但提高紫杉醇药物的溶解性，同时相
比肝素而言，该系统的抗血凝性能大为降低，并且相比单一紫杉醇药物，其抗癌
性能也有较大提高。
本发明的目的是通过下述方式实现的。
本发明采用肝素衍生物负载紫杉醇或紫杉醇衍生物，所述的肝素衍生物为 氧乙酰化肝素，结构如式I所示，其中-
X为H或S(V基团, Y为H、 S(V或COCH3基团， n为1-17，
其中氧乙酰化羧基占全部羧基40-85%。 紫杉醇衍生物为氨基酸改性紫杉醇，其结构如式II所示
a AcCX,9 OH C6H5OCHN, q> *〃 画
C6H5 T O'
H2N—HC—C—(5 Hc(1 I II R O
式n
其中
R为CH(CH3)2、 CH2CH(CH3)2或CH2C6H5基团。
所述的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。 紫杉醇或紫杉醇衍生物的重量为药物总重量的15-30%。
肝素衍生物通过化学键合方式与紫杉醇形成酯键或与紫杉醇衍生物形成酰胺键。 本发明以肝素衍生物负载紫杉醇抗癌药物并研究其抗血凝性能。肝素衍生物 通过肝素钠的酯化反应制备得来；紫杉醇抗癌药物可以是紫杉醇或紫杉醇衍生 物，紫杉醇衍生物通过氨基酸与紫杉醇反应制备得来，其中适宜优选的的氨基酸 为缬氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。肝素一紫杉醇抗癌药物通过肝素衍生物与紫杉醇 或紫杉醇衍生物通过化学键合方式形成酯键或酰胺键制备得来，本发明的药物用
于对正常人的血的抗凝性能和对MCF-7乳腺癌细胞抑制性能评价，结果表明， 本发明的抗癌药物具有比肝素更低的抗血凝特性，并且相比单一紫杉醇药物，其 抗癌性能有较大提高。
具体实施例方式
以下制备过程以及效果的实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步 限定。
(一)氧乙酰化肝素的制备
称量肝素钠(250mg， O.lmmol-OH)，溶于20mL去离子水中，低温下通过 732 (H+)阳离子交换树脂，并用去离子水淋洗至pH值不变，淋出液用三丁胺调 至pH值至6.0,将液体浓縮冷冻干燥得三丁铵肝素衍生物(500 mg， 0.1 mmol -OH)。在N2保护下将其溶于10mlDMF中，搅拌下加入DMAP(36 mg， 0.3 mmol)， 乙酸酐(1330mg， 13mmo1)后，再加入三乙胺(1300mg， 13mmoD，冰浴反应30h后，反应转移至室温反应24h，反应毕，反应液中加入200mL冰乙醇，磁 力搅拌l h使其充分沉淀。溶液离心后，弃上层清液，沉淀用少量蒸馏水溶解， 液体低温下通过732 (H+)阳离子交换树脂，去离子水淋洗至pH值不变，淋出液 浓缩后过Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱，去离子水冲洗，淋出液浓縮冷冻干燥得 到氧乙酰化肝素白色固体(140mg)，收率56%。
(二) 紫杉醇及紫杉醇衍生物药物的制备
(1) 未改性紫杉醇原药简称为Drugl。
(2) 在芴甲氧羰基氨酸(27mg,0.08mmo1)与紫杉醇(60 mg, 0.072 mmol)的 20 mL无水二氯甲烷中加入DMAP (38.7 mg， 0.32 mmol)， 0 'C搅拌反应30 min。 再向反应液中加入EDC (30.4mg, 0.16mmo1)在0 。C反应30 min后，升温至 室温反应8h，反应毕，分别用0.1NHC1 (20mL)和水(20mL)洗，用分出 有机相，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，蒸除有机 相得浓縮液。在浓縮液中加入含有10%四氢吡啶20 mL 二氯甲烷室温反应2 h。 反应毕，浓縮反应液，浓縮物用50 mL正己垸沉淀2次，离心后去上清液，粗 产物用柱色谱(氯仿甲醇，25: 1)分离得缬氨酸改性紫杉醇药物(简称Drug2)。
(3) 采用上述方法可以制备得到亮氨酸改性紫杉醇药物(简称Drug3)。
(4) 采用上述方法可以制备得到苯丙氨酸改性紫杉醇药物(简称Drug4)。
(三) 化学键合型肝素一紫杉醇药物的制备
0.14g氧乙酰化肝素溶于20 mL的DMF中，搅拌下加入0.06g紫杉醇或紫杉 醇衍生物以及催化量的HC104， N2保护下室温反应24 h，反应毕蒸出过量的 DMF，产物溶于5 mL去离子水装入透析袋(MWCO3500)透析2天，透析液浓 縮冻干得白色固体产物，并由紫外光谱法测定载药量。
(四) 抗血凝性能评价
采管用一次性真空采血管取正常人静脉血2.7ml，采血管中抗凝剂为0.109
M的枸椽酸钠0.3 ml。
正常人混合血浆的制备将上述采血轻轻摇匀，然后进行转速3000 rpm离 心10min，收集上层液(血浆，黄色)。
活化部分凝血活酶时间(APTT)的测定肝素标品用蒸馏水配成0.15 u/ml、 0.3 u/ml、 0.45 u/ml、 0.6 u/ml、 0.75 u/ml的溶液。待测样用蒸馏水配成3 ng/ml的 溶液。在0.1ml血桨中加入肝素标品溶液或待测样溶液25微升，混匀后，加入 0.1 ml APTT试剂。混合液置于37'C孵育箱中，2分钟后，加入37'C预热的CaCl2溶液0.1ml 。 PRECILC2000型凝血仪自动记录凝固时间。通过测定活化部分凝
血活酶时间(APTT)评价药物输送系统的抗凝性能，即效价。
(五)抗癌性能评价
将冻存的MCF-7乳腺癌细胞复苏后，加入完全培养液(RPMI 1640 + 10 %小
牛血清+0.1%抗生素)，放入37 °C、 5%C02培养箱中培养。细胞培养至指
数生长期，用0.25 %胰蛋白酶消化，加入10mL完全培养液调整细胞浓度，取
96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液100 nL，平板置于37 °C、 5%C02培养
箱中培养24 h。
对照品紫杉醇配制成0.01， 0.1， 1， 10, 100 pg/mL 5个浓度；取待测药物HD1、 HD2用完全培养液分别配制相当于紫杉醇浓度的5个浓度。将96孔细胞板中的 培养液吸出，同时用PBS清洗后，在孔板中加入100 iaL含有药物的完全培养液， 置于放入37 °C、 5%C02培养箱中培养48h后，应用MTT法进行测定，用酶 标仪测定每孔在570nm的OD值，计算细胞抑制率
细胞抑制率(％)=(正常细胞孔OD值一加药细胞孔OD值)/正常细胞孔OD 值X100X
样品浓度对数值与细胞抑制率线性回归，计算出待测药物对MCF-7细胞的 半数抑制浓度IC50值。
具体的药物输送系统的抗凝性能和抗癌性能评价如下
实施例l
氧乙酰化肝素!1 = 5，其中氧乙酰化羧基占全部羧基53%，药物为Drugl， 载药量为25.4%，抗凝性能，即效价为25U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.65pg/mL， 而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2)ag/mL。 实施例2
氧乙酰化肝素n:5，其中氧乙酰化羧基占全部羧基53%，药物为Drug2， 载药量为16.3%，抗凝性能，即效价为17U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.42pg/mL， 而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2pg/mL。 实施例3
氧乙酰化肝素11 = 5，其中氧乙酰化羧基占全部羧基53%，药物为Drug3， 载药量为18.4%，抗凝性能，即效价为28U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.046ng/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50
值为4.2pg/mL。
实施例4
氧乙酰化肝素!1 = 5，其中氧乙酰化羧基占全部羧基53%，药物为Drug4， 载药量为16.1%，抗凝性能，即效价为12U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为 0.037pg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50 值为4.2^ig/mL。 实施例5
氧乙酰化肝素11=10，其中氧乙酰化羧基占全部羧基72%，药物为Drugl， 载药量为22.8%，抗凝性能，即效价为29U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.57|iig/mL， 而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2pg/mL。 实施例6
氧乙酰化肝素11=10，其中氧乙酰化羧基占全部羧基72%，药物为Drug2， 载药量为19.2%，抗凝性能，即效价为20U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.35pg/mL， 而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2pg/mL。 实施例7
氧乙酰化肝素11=10，其中氧乙酰化羧基占全部羧基72%，药物为Drug3， 载药量为17.9%，抗凝性能，即效价为24U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为 0.078ng/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50 值为4.2ng/mL。 实施例8
氧乙酰化肝素11=10，其中氧乙酰化羧基占全部羧基72%，药物为Drug4， 载药量为17.2%，抗凝性能，即效价为15U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为 0.081pg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50 值为4.2(ag/mL。 实施例9
氧乙酰化肝素11=15，其中氧乙酰化羧基占全部羧基81%，药物为Drugl， 载药量为19.2%，抗凝性能，即效价为27U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.62pg/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2pg/mL。 实施例10
氧乙酰化肝素11=15，其中氧乙酰化羧基占全部羧基81%，药物为Drug2， 载药量为20.3%，抗凝性能，即效价为25U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为0.25pg/mL， 而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为4.2pg/mL。 实施例11
氧乙酰化肝素11=15，其中氧乙酰化羧基占全部羧基81%，药物为Drug3， 载药量为18.8%，抗凝性能，即效价为29U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为 0.046ng/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50 值为4.2pg/mL。 实施例12
氧乙酰化肝素n:15，其中氧乙酰化羧基占全部羧基81%，药物为Drug4， 载药量为21.6%，抗凝性能，即效价为17U/mg。作为对比，单独的氧乙酰化肝 素的抗凝性能为127 U/mg;对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50值为 0.052|ag/mL，而作为对比，单一紫杉醇药物对MCF-7细胞的半数抑制浓度IC50 值为4.2)ag/mL。
权利要求
1、一种具有低抗血凝性肝素—紫杉醇抗癌药物，其特征在于，采用肝素衍生物负载紫杉醇或紫杉醇衍生物，所述的肝素衍生物为氧乙酰化肝素，结构如式I所示，式I其中X为H或SO3-基团，Y为H、SO3-或COCH3基团，n为1-17，其中氧乙酰化羧基占全部羧基40-85％。
2、 根据权利要求书1所述的一种具有低抗血凝性肝素一紫杉醇抗癌药物，其特 征在于，紫杉醇衍生物为氨基酸改性紫杉醇，其结构如式n所示<formula>formula see original document page 2</formula>式n其中R为CH(CH3)2、 CH2CH(CH3)2或CH2C6H5基团。
3、 根据权利要求书2所述的一种具有低抗血凝性抗癌药物，其特征在于，所述 的氨基酸为缬氦酸、亮氨酸或苯丙氨酸。
4、 根据权利要求书1-3任一项所述的一种具有低抗血凝性抗癌药物，其特征在 于，紫杉醇或紫杉醇衍生物的重量为药物总重量的15-30%。
5、 根据权利要求书1-3任一项所述的一种具有低抗血凝性抗癌药物，其特征在 于，肝素衍生物通过化学键合方式与紫杉醇形成酯键或与紫杉醇衍生物形成酰胺 键。
全文摘要
一种具有低抗血凝性肝素-紫杉醇抗癌药物，本发明涉及一种化学键合型抗癌药物。肝素衍生物和紫杉醇或紫杉醇衍生物通过化学键合的方式制备出肝素-紫杉醇药物，该抗癌药物不但具有比肝素更低的抗血凝特性，而且具有比单纯紫杉醇药物更强的抗癌性能。
文档编号A61K47/48GK101422613SQ200810143918
公开日2009年5月6日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者刘承斌, 向建南, 莺 王 申请人:湖南大学