专利名称：竹荪三螺旋多糖的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物高分子学和药物化学领域，特别是涉及一种竹荪二螺旋多糖在抗肿瘤 的药物或者保健品中的应用。
背景技术：
近年来的研究发现，竹荪含有多种氨基酸、维生素、多糖和多种无机盐等。除其营养 价值外，同时还具有一定的防病保健作用。多糖是竹荪子实体中重要组成成分之一，多糖 生理活性和功能已有许多报道，竹荪所具有的多种生物活性是否与其所含有多糖有关尚未 见报道。曾有人报道采用热水萃取、有机溶剂沉淀和凝胶层析等方法，从竹荪子实体中分 离得到竹荪多糖，并利用薄板层析方法，确定了该多糖的单糖组成，为进一步研究竹荪多 糖的化学结构和生物活性提供依据。
自从60年代Chihara从香蔬实体中提取香燕多糖并发现其有抗肿瘤活性，多糖的研 究就受到了极大的关注和重视。80年代研究表明，真菌多糖是一种免疫调节剂，它能够 增强巨噬细胞和白细胞的吞噬功能，诱导产生肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞素，从而提 高人体的免疫机能，对多种危害人类健康的疾病如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝 炎、肺炎等都具有一定的疗效，而且对细胞没有毒副作用。
竹荪属于真菌，是我国的天然特产资源，长期用于食用，现在公开发表和研究的大多 集中在如何进行食用方面的开发，这种做法是造成对竹荪资源极大的浪费，在药用方面的 应用更少见T报道。
发明内容
木发明所要解决的技术问题是提供一种竹荪三螺旋多糖在抗肿瘤、提高免疫机能药 用方面的应用，以便更好地利用竹荪这种天然资源。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案竹荪三螺旋多糖在抗肿瘤或提高免疫机 能药用方面的应用，所述竹荪三螺旋多糖从天然竹荪中提取而获得，分子量为30 100万， 具有三股螺旋有序结构，竹荪三螺旋多糖的单糖组成为葡萄糖，竹荪三螺旋多糖的主链为
0- (1—3)连接，支链为0- (1 — 6)连接结构，支化度为10 20% 。
木发明与现有技术相比主要有以下的优点从竹荪中提取分离得到的竹称三螺旋多 糖，经实验分析，结果表明具有特殊的分子结构在水溶液中呈现三股螺旋构象，此独特 的分子结构表现出的强的生物活性，主要在于抗肿瘤或者是提高免疫机能方面，竹荪三螺
旋多糖对肿瘤细胞有明显的抑制作用，体外测试抑制S-180肿瘤细胞的抑制率最高达38%， 与化学药物5-FU的活性相比较，处在同一个数量级，与现在常用药物香菇多糖进行比较， 其治疗效果相当，具有相当广泛的应用前景。所用方法简单，成本低廉，制备的竹荪三螺 旋多糖可用于提高免疫机能和抗肿瘤的药物或保健品的开发。
图1为ZS-3、 ZS-4降解后单糖组成分析气相图谱。 图2为ZS-3、 ZS-4进行FT工R测试图谱。 图3为三螺旋竹荪多糖的结构模型示意图。 图4为ZS-3、 ZS-4的13CNMR图谱。 图5为ZS-3、 ZS-4原子力显微镜的结果图。
具体实施例方式
本发明提供的竹荪二螺旋多糖，其用于抗肿瘤或提高免疫机能。所述竹荪三螺旋多糖 从天然竹荪中提取而获得，分子量为30 100万，具有三股螺旋有序结构，竹荪二螺旋多
糖的单糖组成为葡萄糖，竹荪三螺旋多糖的主链为e- (1—3)连接，支链为e- (1—6)
连接结构，支化度为10 20% 。
所述的三螺旋竹荪多糖，其衍生物及具有支链的多糖用于抗肿瘤或提高免疫机能。 所述的三螺旋竹荪多糖及其衍生物和支链的多糖，其采用以下方法从天然竹荪中提 取先将粉碎后过60目筛的天然竹荪用乙醇乙酸乙酯在索氏提取器中脱脂，然后在20 S(TC下水提2-6小时，过滤得滤液，重复进行三次，离心得提取液；该提取液经Sevage 法脱蛋白和用51202氧化法脱色后，分别用清水和二次蒸馏水透析，并经DEAE柱除去酸 性多糖后，再经浓縮和冷冻干燥即可。
所述的三螺旋竹荪多糖，其结构如图3所示具有三股螺旋有序结构，其单糖组成 为葡萄糖，其主链为0-(l — 3)连接，支链为(1 —6)连接结构，支化度为10 20% 。 该多糖的分子量为30 100万，其在水溶液中粘度为540 1550cm3/g,流体力学半径为 70 150nm。图3中，n为多糖的结构重复单元8000-12000。
所述的有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯和丙酮，它们浓度规格均是分析纯。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例l:三螺旋竹荪多糖在抗肿瘤药用方面的应用 体内抗肿瘤实验
实验小鼠为BALB/C清洁级(SPF)， 6周龄，体重18-22克，雌雄兼用，由华中科技大 学同济医学院动物中心提供。肿瘤瘤株为S-180腹水瘤细胞。选取正常BALB/C清洁级小 鼠50只，体重18-22克，雌雄兼用。无菌条件下抽取S180腹腔荷瘤小鼠的腹水，用无菌 的生理盐水稀释至l: 20浓度的肿瘤细胞液(106 cell/tnL )，无菌条件下在小鼠右前肢腋 皮下接种制备移植瘤模型(每只0. 1 mL ) 。 24 h后小鼠随机分为5组，每组10只。瘤块 形成后，水溶性试样溶于生理盐水，每种试样的剂量为每kg小鼠体重注射60 mg试样， 阳性实验用5-氟脲嘧啶(5-Fu ) 60 nig'kg—、阴性对照组注射等容积的生理盐水。小鼠 每天注射给药l次，连续10天，停药24h后将小鼠称重，脱颈处死，解剖剥离瘤块，并 用电子分析天平称瘤重。将试验组瘤块的体积和重量与对照组比较，观察多糖试样对肿瘤 生长的抑制作用。由式-1和式-2计算肿瘤抑制率l (%)和体重变化率f (%)。*100% (式-1)
/ =[(Wb-Wa)/ Wa] * 100% (式-2)
式中Wt和Wc分别为注射和未注射多糖溶液的小鼠组肿瘤的平均重量，Wa和Wb分别 为注射多糖溶液前后的小鼠组平均体重。
抗肿瘤活性体内、体外实验结果采用t-test ( Student's t-test )方法统计分析。 P值小于0. 05时认为试样组与对照组存在显著差异。
下面提供从天然竹荪中提取而获得竹荪三螺旋多糖及其衍生物和支链的多糖的两个 实施例(实施例2和实施例3)。
实施例2:将竹荪实体在组织粉碎机中粉碎，依次用乙醇、乙酸乙酯和丙酮在索氏提
取器中脱脂，然后分别在2crc、 4crc、 so'c、 so'c下水提三小时，得四种多糖溶液，分
别加以处理如下，离心得提取液。用Sevage法脱蛋白后，HA氧化法脱色，分别用清水和 二次蒸馏水透析，浓缩，用乙醇分级沉淀，冷冻干燥得到三螺旋竹荪多糖ZS-1、 ZS-2、 ZS-3和ZS-4。冻干得到多糖纯品。
实施例3:将竹荪实体在组织粉碎机中粉碎，依次用乙醇、乙酸乙酯和丙酮在索氏提 取器中脱脂，然后分别在20'C、 40°C、 60。C、 8(TC下水提三小时，得四种多糖溶液，分 别加以处理如下，离心得提取液。用Sevage法脱蛋白后，&02氧化法脱色，分别用清水和 二次蒸馏水透析，浓缩，经超滤后，冷冻干燥得到三螺旋竹荪多糖ZS-1、 ZS-2、 ZS-3和 ZS-4。冻干得到多糖纯品。
上述实施例2和实施例3所得到的ZS-1、 ZS-2、 ZS-3和ZS-4四种多糖，其产率分别 为0.444%、 0.364%、 0.243%、 0.388%。
本发明对得到的四种产物分别用GC测得其单糖组成，发现ZS-1、 ZS-2为杂多糖，而 ZS-3、 ZS-4为单一葡萄糖组成。重点对ZS-3， ZS-4多糖进行分析，用FTIR及丽R的方
法确定了 zs-3、 zs-4多糖的结构为主链为e- (1—3)，支链为e- (l—6)连接的葡聚
糖。用光散射的方法测得ZS-3和ZS-4多糖重均分子量分别为60万，80万，ZS-3和ZS-4 两种多糖在化学组成上是一样的，只是在分子量大小不同。流体力学半径为70-150 nm。 测得ZS-1、 ZS-2、 ZS-3和ZS-4四种糖的黏度为540 1550cm3g—1 (见表1)，并且ZS-3 和ZS-4多糖有粘度高达1500 cm3g—'以上，是具有很强的刚性多糖。并且用刚果红实验、 AFM实验的结果证实，该多糖为三螺旋多糖。
下面是对得到的四种产物进行检测的实施例。
实施例3:测各糖的单糖组成
用2M的硫酸对多糖进行水解封，封管IOO'C下反应六小吋，水解液用碳酸钡中和多 余的酸，离心得到上清液，冷冻干燥，用糖腈乙酸酯衍生物方法对样品进行处理后用气相 测定单糖组成。
5衍生化方法取10mg固体糖样、10mg盐酸羟胺和7nig内标，加入0. 5ml吡啶放入90 'C水浴中加热反反应30分钟，取出后冷室温，加入醋酸酐O. 5ml，在90。C下继续反应30 分钟进行乙酰化，反应产生直接进行气相色谱分析。气相色谤仪的型号为Agilent (安杰 伦)GC6890N。操作条件如下
气流速度N2为20ml/min， ^为30ml/min' 02为50ml/min。
温度进样口 25(TC，检测器28(TC， HP-5柱温度采用程序升温，起始温度14(TC， 停留3分钟，7'C每分钟升至240'C，保留10分钟。
经检测，ZS-3和ZS-4均为单一葡萄糖组成，并纯度较高。参见图l。 实施例4:测各种多糖的粘度
利用乌氏黏度计在25'C下进行粘度测定。用做图法得到多糖的特性粘度。在水溶液 中得到的结果，请见表l。 实施例5:光散射测试
对ZS-3和ZS-4多糖样品在溶液中的散射光强用多角度激光散射仪测量。激光光源为 He-Ne激光，波长633nm,通过计算得到ZS-3和ZS-4分子量分别为80万和60万，流体力 学半径分别为150 nm和70 nm 。
实施例6: FTIR分析
对ZS-3和ZS-4进行FTIR分析，用KBr压片法在5000-500cm—1范围内用红外测定其 多糖的构型，确定该糖是a型还是e型。通过实验数据，红外光谱有3500-3300cm—1 (糖 环上OH的O-H伸縮振动)；2920-2800"(糖环上C-H变角振动)；1100-100(T1 (糖环上
c-o伸縮振动)；890" (e构型的异头碳特征吸收)，等四个特征吸收峰，确定样品为为e
构型糖链(图2)。
实施例7: NMR测试分析
用D20作溶剂，探针温度为60°C,样品浓度为10tng/ml，13C核磁共振光谱具 103.836ppm(e - (1 — 3)葡聚糖的C-l信号)；87.054ppm(C-3信号)；76.836ppm(C-5信 号);75.359ppm(C-2信号)；68,738ppm(C-4信号)；61.300(C-6信号)，可推出ZS-3， ZS-4 糖的主链结构为P- (1 — 3)葡聚糖连接，具有支链为P- (1 — 6)连接结构。"C醒R图谱 见图4。
通过以上实施例3、实施例6和实施例7，得到竹荪多糖的结构式见图3，其中支化 度大约在10%-20°/。。
实施例8:刚果红实验
刚果红与具有螺旋构象的多糖可形成络合物，此络合物的最大吸收波长较多糖红移向 长波，由此可基本推测多糖分子内有螺旋结构。产品经刚果红反应，然后紫外测定，发现 在480-495nm处呈最大吸收峰。中和后再测紫外，其最大吸收收位移移至505-520nm，该 反应紫外吸收的两个范围为e- (1 — 3)葡聚糖所特有，最大吸收波长明显发生红移，证 明该分子内存在三螺旋结构。实施例9:原子力显微镜测试
将溶液涂在云母片上进行测试，比结果可以看到，分子呈现直链形态(图5)。表现 为较强的刚性。 附表
表l 各种多糖在水溶液中的粘度
糖样品粘度(cm3g-')
ZS-1540
ZS-2600
ZS-31550
ZS-41500
表2 抗肿瘤活性的测试结果
样品分子量 (105)齐'J量(mg/kg* 天)抑制率(％)体重增长率 (%)完全抑制 率
5-Fu60*850.512. 50/10
三螺旋香菇多糖5.060*839.331. 20/10
三螺旋竹荪多糖6.260*838.436. 40/10
解螺旋竹荪多糖2.160*811.732. 50/10
权利要求
1. 一种竹荪三螺旋多糖的应用，其特征是竹荪三螺旋多糖在抗肿瘤或提高免疫机能药用方面的应用，所述竹荪三螺旋多糖从天然竹荪中提取而获得，分子量为30～100万，具有三股螺旋有序结构，竹荪三螺旋多糖的单糖组成为葡萄糖，竹荪三螺旋多糖的主链为β-(1→3)连接，支链为β-(1→6)连接结构，支化度为10～20％。
2. 根据权利要求1所述的三螺旋竹荪多糖的应用，其特征是三螺旋竹荪多糖的衍生物及具有支链的多糖在抗肿瘤药用保健方面的应用。
3. 根据权利要求1或2所述的三螺旋竹荪多糖的应用，其特征是采用以下方法从天然竹荪中提取而获得竹荪三螺旋多糖及其衍生物和枝链的多糖先将粉碎后的天然竹荪用乙醇乙酸乙酯在索氏提取器中脱脂，然后在20 80'C下水提，过滤得滤液，重复进行三 次，离心得提取液；该提取液经Sevage法脱蛋白和用11202氧化法脱色后，分别用清水和 二次蒸馏水透析，并经DEAE柱除去酸性多糖后，再经浓縮和冷冻干燥，得到所述三螺旋 竹荪多糖及其衍生物和枝链的多糖。
4. 根据权利要求3所述的三螺旋竹荪多糖的应用，其特征是三螺旋竹荪多糖在水 溶液中粘度为540 1550cm3/g，流体力学半径为70 150nm。
5. 根据权利要求1所述的三螺旋竹荪多糖的提取方法，其特征是索氏提取器中脱 脂所用的有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯和丙酮，它们浓度规格均是分析纯。
6. 根据权利要求3所述的三螺旋竹荪多糖的应用，其特征是在20 80。C梯度温度 进行水提，该过程中所用的温度依次为2(TC、 4(TC、 60°C、 80°C 。
7. 根据权利要求3所述的三螺旋竹荪多糖的应用，其特征是水提的时间为2-6小时。
全文摘要
本发明提供的竹荪三螺旋多糖，其在抗肿瘤或提高免疫机能药用方面的应用，该竹荪三螺旋多糖从天然竹荪中提取而获得，分子量为30～100万，具有三股螺旋有序结构，竹荪三螺旋多糖的单糖组成为葡萄糖，竹荪三螺旋多糖的主链为β-(1→3)连接，支链为β-(1→6)连接结构，支化度为10～20％。本发明首次发现并验证了竹荪多糖的三螺旋结构，并且通过对抗S-180肿瘤细胞对肿瘤细胞的体外实验结果分析，竹荪三螺旋多糖对S-180肿瘤细胞有明显的抑制作用，与目前临床常用药物香菇多糖的肿瘤抑制作用相当，在医药及材料方面有广泛的应用前景。
文档编号A61P35/00GK101502532SQ200810197139
公开日2009年8月12日 申请日期2008年9月28日 优先权日2008年9月28日
发明者王家堂, 化 郑, 陈敬华 申请人:武汉理工大学