专利名称：大黄素、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药技术领域，特别涉及一种从大黄中提取大黄素和芦荟大 黄素的方法及大黄素和芦荟大黄素在抗脑缺血损伤方面的应用。
背景技术：
蓼科植物大黄或其他变种的植物根茎中含有大黄素、芦荟大黄素。大黄 素异名朱;61 莲甲素(Frangula emodin, Rheum emodin, Archin， Frangulic acid)， 化学名9，10-Anthracenedione, 1,3，8-thihydroxy-6-methyl，结构式为
大黄豕
分子式为C15H1Q05，分子量270.33;为橙色针状结晶(乙醇或12毫米以下减 压升华)，熔点256-257°C，几乎不溶于水，溶于乙醇及碱溶液。其植物来源 为廖科植物掌叶大黄根茎、齿果酸模、齿果酸模根和叶、皱叶酸模的根、 羊蹄根、杠板归根和根茎、豆科植物决明新鲜种子、望江南根。芦荟大黄素异 名戸荟泻素 (Rhabarberone )， 化学名 9,10-Anthracenedione， 1, 8誦dihydroxy國3-(hydroxymethyl)，结构式为
芦荟大黄素
分子式为C15H1()05，分子量270.23;为橙色针状结晶(甲苯)，熔点223-224 °C，易溶于热乙醇，在乙醚及苯中呈黄色、氨水及硫酸中呈绯红色。其植物 来源为廖科植物掌叶大黄根茎、药物大黄根茎、巴天酸模根、齿果酸模叶、 决明种子、望江南种子、豆科植物山扁豆根、鼠李科植物鼠李的果实。
药理研究表明，大黄素(1)体外可抑制金黄色葡萄球菌、白喉杆菌、
枯草杆菌、大肠杆菌等各种细菌、还可抑制胃幽门螺杆菌。(2)可抑制不同 有丝分裂原(Con A， LPS)刺激的小鼠脾细胞增殖反应；抑制Con A诱导脾 细胞IL2的产生，其抑制作用与大黄素的浓度成正比。(3) 30mg/kg于家兔灌 胃有利尿作用。(4)体外对艾氏腹水癌细胞的50%的抑制浓度为20mg/kg。 (5) 42mg/kg连续7天于小鼠腹腔注射，使肝微粒体细胞色素瘤的抑制率为75%[15]; 10ug/kg的浓度对肺癌A-549细胞的分裂和DNA的生物合成有抑制作用； 42mg/kg连续7天小鼠腹腔注射，使肝微粒体细胞色素P-450含量较对照组下 降41.7%;使戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间比对照组延长18.7%。 (6)对淋 巴细胞外钙内流有明显的促进作用，对淋巴细胞免疫功能有抑制作用；也可 促进细胞内钙释放。(7) 100mg/kg给大鼠腹腔注射，可使肠梗阻所致肠粘膜 降低了的组胺水平恢复到正常。(8)体外18. 5umol/L可使NE和高钾诱导的 主动脉条收縮的量效曲线左移，可能与钙激动作用有关，92. 5 umol/L可抑制 主动脉条的收縮作用是量效曲线右移，可能与大黄素络合钙离子作用有关。
(9)可抑制正常动脉硬化的动脉及球囊损伤动脉壁血管平滑肌细胞增殖，主 要机制为抑制细胞从G。期向G5期转化，并呈剂量相关性。(10)在5X10—7—5 XKT5m0l/L浓度范围内，可抑制大鼠腹腔巨嗜细胞白三烯的生物合成，量效 关系明显。(11)将大黄素纯品直接加入细胞培养液可抑制细胞增殖，25mg/L 可抑制肾小管原癌基因mRNA的表达；还可抑制平滑肌细胞增殖。芦荟大黄素
(1)体外可抑制金黄色葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌 等各种细菌、对胃幽门螺杆菌有抑制生长作用。(2) 70mg/kg连续7天腹腔注 射于小鼠，对免疫系统有不同程度的抑制作用。(3)为一种强的平滑肌细胞 抑制剂，对平滑肌细胞有抑制作用，呈剂量依赖关系。
发明内容
本发明目的在于提供一种从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法及大 黄素、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用。
为达上述目的，本发明采用如下技术方案从大黄中提取大黄素、芦荟 大黄素的方法，依次包括如下步骤(1)取大黄药材粉碎，加乙醇水溶液浸 泡、加热回流提取，提取液滤过、回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用无机酸水溶
液水解，酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用乙醇水溶 液洗脱除去杂质，继用乙醇与丙酮混合液梯度洗脱，分段收集洗脱液，回收 溶剂，浓縮至干，分别得到芦荟大黄素、大黄素；或者，去渣酸水液用三氯 甲烷提取，提取液回收三氯甲烷至近干，通过硅胶层析柱，用乙酸乙酯与丙 酮混合液梯度洗脱，分段收集洗脱液，减压回收溶剂至干，分别得到芦荟大 黄素、大黄素0
步骤(1)中粉碎后的大黄药材加药材重量6 — 16倍的重量百分比浓度40 %—80%的乙醇水溶液常温浸泡0. 5 — 4小时，加热回流提取3—6次，每次0. 5 一3小时，滤过，减压回收乙醇得浸膏。
步骤(2)中浸膏用其重量5 — 20倍的重量百分比浓度5%—20%的无机酸 水溶液水浴加热水解0. 5 — 1. 5小时，酸水液滤过去渣。
步骤(3)中去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用4 —12倍层析柱体积的重 量百分比浓度10% — 50%乙醇水溶液洗脱除去杂质，继用重量百分比浓度60% 一95%乙醇水溶液与丙酮混合液梯度洗脱，乙醇水溶液与丙酮体积比为1 : 30 30 : 1,分段收集洗脱液，减压回收溶剂，浓縮至干，分别得到芦荟大黄 素、大黄素；或者，去渣酸水液用三氯甲垸提取3—6次，减压回收三氯甲垸 至近干，通过硅胶层析柱，用乙酸乙酯与丙酮混合液梯度洗脱，乙酸乙酯与
丙酮体积比为i : 20 20 : i，分段收集洗脱液，减压回收溶剂至干，分别得
到芦荟大黄素、大黄素。
大黄素、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以大黄素或 者芦荟大黄素为有效成分。
本发明以在国内广泛种植的大黄药材为原料，原料价廉易得；以乙醇水 溶液作为提取溶剂进行提取，原料成本低，提取效果好，且生产过程中无三 废产生，环保效益好；提取并经无机酸(盐酸或者硫酸)水解后采用层析纯 化，所得提取物中大黄素、芦荟大黄素含量高，可达80—98%。
下面通过大黄素、芦荟大黄素抗脑缺血损伤的动物实验研究证明大黄素、 芦荟大黄素的抗脑缺血损伤作用
(1) 实验材料SD大鼠，3 4月龄，90只，雌雄各半，体重300土 50g，由河南省实验动物中心提供(编号2003LA—130，合格证号0001012 号)。大黄素、芦荟大黄素注射剂(均由河南中医学院药物分析学学科提 供)，川芎嗪注射液(山东潍坊制药有限公司；规格2ml， 40mg;批号 030314)。
(2) 分组与处理大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、川芎 嗪组、大黄素组，芦荟大黄素组，其中后2组又各分为低、中、高3个剂 量组。每组10只大鼠。各组大鼠均于造模前3天腹腔注射用药川芎嗪 注射液(7.2mg 'kg—1 'cf1)、大黄素(l,40mg .kg-1 'd—\ 2. 80mg kg—1 cT1、 5. 60 mg kg—1 d—"，芦荟大黄素(0. 04mg kg—1 d_1、 0. 08mg kg—1 cf1、 0. 16mg.kg—、d—1)，每日用药一次，造模前2h加用药一次。注射液体积 为lml/100g，假手术组和模型组分别腹腔注射同等体积的生理盐水。所 有实验大鼠均于术前12h禁食不禁水。造模后6h依神经症状八级评分标 准进行评分。
(3) 模型制备采用改良的Longa法制备局灶性脑缺血模型(MCAO)， 假手术组不插入栓线。实验过程中保持大鼠肛温(37.0±0.5) °C、室温
(26±1) °C。
(4) 取材与样品制备术后6小时冰盘上取出全脑，用冷生理盐水(4 'C)冲洗3遍，除去积血，用滤纸吸去表面水份，去除嗅球、小脑和脑干。 于冰盘上迅速分离大脑半球，取左侧半球，从额极向后4mm处冠状切取脑 组织3mm，待侧脑组织含水量；再向后冠状切取脑组织2mm，放入2。/。四氮 唑，进行TTC染色，待测脑梗塞面积。
(5) 观察指标①神经症状评分。造模后6h观察大鼠神经症状体征， 参照评分标准进行评分，记录分值；②脑组织含水量测定。切取的用于测 定含水量的脑组织迅速用电子天平称取湿重(精确度为0. lmg)后放入干 燥箱中干燥(100°C±2°C)， 24h后称取干重。计算公式脑组织含水量=
(脑湿重一脑干重)/脑湿重X100;③脑梗塞面积测定。切取脑组织2mm， 放入2%四氮唑，37'C水浴锅温孵30min后放入10%甲醛溶液，15min后取 出脑组织，数码相机分别对脑片额侧和枕侧进行拍照，应用计算机软件测 定脑组织梗塞面积与相应侧总面积，计算面积比值。计算公式面积比值 =梗塞面积/总面积。
(6)统计学处理数据用SPSS 11. 0统计分析软件处理。计量资料以 G)土标准差")表示，进行单因素方差分析。 [结果]
(1)神经症状评分脑缺血大鼠的神经症状评分增高(5.75土0.57); 大黄素高(4. 50±0.52)、中(3.90±0. 99)、低(2. 70±0. 48)剂量组大鼠 的神经症状评分降低；芦荟大黄素高(3. 10±0.73)、中(4.30±0.48)、低 (5.20±0.91)剂量组的神经症状评分降低；其中大黄素低剂量组 (1. 40mg kg—' d-1)和芦荟大黄素高剂量组(0. 16mg kg-1 d-1)降低尤 为显著。
(2) 脑组织含水量脑缺血大鼠脑组织含水量明显增高(83.42士1.50); 大黄素高(80.98±4. 31)、中(79. 11±1.22)、低(76. 55±1.08)剂量组大 鼠的脑组织含水量明显降低；芦荟大黄素高(76.86±1.43)、中(81.75± 1.22)、低(83.02±1.39)剂量组的脑组织含水量降低；其中大黄素低剂量 组(1. 40mg kg—1 d—1和芦荟大黄素高剂量组(0. 16mg kg-1 d—1)降低尤为 显著。
(3) 脑梗塞面积脑缺血大鼠脑梗塞面积明显增高(34.87土1.33);大黄 素高(32.90±2.92)、中(32. 75±1.24)、低(27.70±1.28)剂量组大鼠的 脑梗塞面积明显降低；芦荟大黄素高(29.00±1.59)、中(30. 95± 1. 10)、 低(33.33 ±1.67)剂量组的脑梗塞面积降低；其中大黄素低剂量组
(1.40mg kg1 cf1)和戸荟大黄素高剂量组(0. 16mg kg—1 cf1)脑梗塞面 积降低尤为显著。通过研究，我们发现从大黄中提取的大黄素、芦荟大黄素可以改 善脑缺血后的神经症状，减轻脑组织水肿，减小脑梗塞面积，对缺血性脑损 伤具有明显的保护作用，其中以大黄素低剂量(1.40mg'kg、d—"和芦荟大 黄素高剂量(0. 16mg kg" d—0对脑缺血损伤的保护作用尤为明显。
从大黄中提取的大黄素、戶荟大黄素可以改善脑缺血后的神经症状，减 轻脑组织水肿，减小脑梗塞面积，对缺血性脑损伤具有明显的保护作用，其
中以大黄素低剂量(1.40mg -kg1 *d—')和芦荟大黄素高剂量(0. 16mg 'kg—1 'd—') 对脑缺血损伤的保护作用尤为明显。结合目前脑缺血的治疗研究进展和大黄 素、芦荟大黄素的研究现状，本发明关于大黄素及芦荟大黄素的提取方法以 及所提取的大黄素及芦荟大黄素在抗缺血性脑损伤方面的研究结果，为临床 治疗脑缺血及其他缺血性脑血管疾病的防治提供了直接依据。
具体实施例方式
实施例l、从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，取大黄药材，粉碎 为粗粉，加药材重量10倍的重量百分比浓度60%的乙醇水溶液常温浸泡2小 时，加热回流提取4次，每次1小时，滤过，减压回收乙醇得浸膏；(2)浸 膏用其重量10倍的重量百分比浓度15%的盐酸水溶液水浴加热水解1小时， 酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液用等量三氯甲烷提取4次，减压回收三氯 甲烷至近干，通过硅胶层析柱，用乙酸乙酯与丙酮混合液(体积比1 : 20 1 : 1)洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干，得到芦荟大黄素；用乙酸乙酯与
丙酮混合液(体积比i : 1 20 : i)洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干，
得到大黄素、芦荟大黄素。
实施例2、从大黄中提取大黄素、戸荟大黄素的方法，取大黄药材，粉碎 为粗粉，加药材重量12倍的重量百分比浓度70%的乙醇水溶液常温浸泡4小 时，加热回流提取3次，每次40分种，滤过，减压回收乙醇得浸膏；(2)浸 膏用其重量8倍的重量百分比浓度20%的硫酸水溶液水浴加热水解40分种， 酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用30%乙醇洗脱除去杂 质，继用80%乙醇与丙酮(体积比l : 30 1 : 1)混合液洗脱，收集洗脱液，
减压回收溶剂，浓縮至干，得到芦荟大黄素，继用80%乙醇与丙酮(体积比i: 1 30: i)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓縮至干，得到大黄
素、芦荟大黄素。
实施例3、从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，取大黄药材，粉碎
为粗粉，加药材重量8倍的重量百分比浓度50%的乙醇水溶液常温浸泡3小时， 加热回流提取5次，每次30分种，滤过，减压回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用 其重量6倍的重量百分比浓度15%的硫酸水溶液水浴加热水解50分种，酸水 液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用40%乙醇洗脱除去杂质， 继用70%乙醇与丙酮(体积比1 : 30 1 : 1)混合液洗脱，收集洗脱液，减压 回收溶剂，浓縮至干，得到芦荟大黄素；继用70%乙醇与丙酮(体积比1 : l
30: i)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓縮至干，得到大黄素、
卢荟大黄素。
实施例4、从大黄中提取大黄素、戸荟大黄素的方法，取大黄药材，粉碎 为粗粉，加药材重量6倍的重量百分比浓度40%的乙醇水溶液常温浸泡3小时， 加热回流提取5次，每次30分种，滤过，减压回收乙醇得浸膏；(2)浸膏用 其重量6倍的重量百分比浓度15%的硫酸水溶液水浴加热水解50分种，酸水 液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用40%乙醇洗脱除去杂质， 继用70%乙醇与丙酮(体积比1 : 30 1 : 1)混合液洗脱，收集洗脱液，减压 回收溶剂，浓縮至干，得到芦荟大黄素；继用70%乙醇与丙酮(体积比1 : l
30 : i)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓縮至干，得到大黄素、
芦荟大黄素。
实施例5、从大黄中提取大黄素、芦荟大黄素的方法，取大黄药材，粉碎 为粗粉，加药材重量16倍的重量百分比浓度80%的乙醇水溶液常温浸泡3小 时，加热回流提取5次，每次30分种，滤过，减压回收乙醇得浸膏；(2)浸 膏用其重量6倍的重量百分比浓度15%的硫酸水溶液水浴加热水解50分种， 酸水液滤过去渣；(3)去渣酸水液通过聚酰胺层析柱，用40%乙醇洗脱除去杂 质，继用70%乙醇与丙酮(体积比1 : 30 1 : 1)混合液洗脱，收集洗脱液， 减压回收溶剂，浓縮至干，得到芦荟大黄素；继用70%乙醇与丙酮(体积比1 :
i 30:i)混合液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，浓縮至干，得到大黄
素、卢荟大黄素。
实施例6、大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以其制备大黄素
注射剂。制法提取所得大黄素用乙醇溶解，缓缓加入丙三醇液中，搅拌均 匀后，加注射用水至近总量时，用重量百分比浓度ly。的氢氧化钠水溶液调PH
值至3.5 4.5，加入注射用水至总量，混合均匀，0.45um微孔滤膜滤过， 通氮气灌封于2ml安瓿中，10(TC灭菌30min，即得。规格2ml;组成大黄 素50mg、 8%乙醇、20%丙三醇、蒸馏水；用法用量每日一次，每次1支，肌 肉注射。
实施例7、大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以其制备大黄素 片。制法提取所得大黄素粉碎成细粉，加淀粉、硬脂酸镁、滑石粉混合均 匀，制成颗粒，压片，包薄膜衣，即得。规格0.25g;组成芦荟大黄素20mg、 淀粉0.2g、硬脂酸镁0.02g、滑石粉适量；用法用量口服， 一日3次，每次l片。
实施例8、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以其制备卢
荟大黄素胶囊。制法提取所得芦荟大黄素粉碎成细粉，加淀粉、滑石粉混 合均匀，制成颗粒，干燥后装入胶囊壳，即得。规格0.15g;组成芦荟大 黄素0.5mg、淀粉0.14g、滑石粉适量；用法用量口服， 一日3次，每次l 粒。
实施例9、卢荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以其制备芦
荟大黄素注射剂。制备方法提取所得芦荟大黄素用乙醇溶解，缓缓加入丙 三醇液中，搅拌均匀后，加注射用水至近总量时，用重量百分比浓度1%的氢
氧化钠水溶液调PH值至3.5 4.5，加入注射用水至总量，混合均匀，0.45 "m微孔滤膜滤过，通氮气灌封于2ml安瓿中，10(TC灭菌30min，即得。
规格lml;组成芦荟大黄素lmg、 5%乙醇、10%丙三醇、蒸馏水；用法用量:
每日一次，每次1支，肌肉注射。
权利要求
1、大黄素、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，其特征在于，以大黄素或者芦荟大黄素为有效成分。
全文摘要
大黄素、芦荟大黄素在制备抗脑缺血损伤药物方面的应用，以大黄素或者芦荟大黄素为有效成分，可制成片剂、胶囊剂、针剂(注射液)。可以改善脑缺血后的神经症状，减轻脑组织水肿，减小脑梗塞面积，对缺血性脑损伤具有明显的保护作用。
文档编号A61P9/10GK101342161SQ20081021008
公开日2009年1月14日 申请日期2006年4月30日 优先权日2006年4月30日
发明者轲 刘, 刘敬霞, 李建生, 梁生旺, 郑晓珂 申请人:河南中医学院