SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物及其制备方法

专利名称：SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种Si02/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物及其 制备方法，属于生物纳米技术领域。
背景技术：
近年来，纳米技术在生物医药学方面的应用有着十分重要的地位及美好
前景，纳米技术在生物医药学领域的应用主要包括如下几个领域药物释放 与靶向定位；细胞与蛋白质检测；疾病诊断与治疗；医用纳米机器人等。
核壳结构贵金属纳米材料近红外吸收特性的发现，引起了物理、化学、 生物学等相关领域的广泛重视，使人们看到了金属纳米材料在生物医学领域 里的广阔的应用前景。近红外区(800-1200 nm)是肌体组织的透射窗口，近 红外激光对人体的伤害与其它波段的激光相比要小得多。应用纳米技术制成 的核壳结构纳米材料可吸收近红外光并把光转化为热。基于这个思路，世界 上研究较多的是将核壳结构纳米金属组装为纳米给药系统并被肿瘤组织吸 收并滞留，给药后在肿瘤部位进行近红外光照射。经近红外激光照射后，金 属纳米材料将吸收的光能转化成热能，使局域范围内的温度升高，以杀死肿 瘤细胞(肿瘤细胞在42。C左右可被杀死)。另外，将哮壳结构纳米金属与抗 体结合，赋予这种光热治疗肿瘤的纳米材料一定的靶向性，以提高抗癌效果。
一直以来，临床上癌症的治疗方案都是以手术、放疗、化疗为主。上个 世纪70年代美国科学家提出了癌症的"饿死学说"，即通过阻断肿瘤新生血 管的生成，切断肿瘤的营养供给，达到遏制肿瘤侵袭、复制和转移的目的。 美国科学家Judah Folkman教授课题组首次发现一种叫做Endostatin (血管 内皮抑制素)的蛋白质，具有强烈抑制新生血管生成的作用以及一定的靶向 识别作用，然而在小鼠体内试验成功后却无法攻克蛋白质复性的难关，无法 实现Endostatin的大规模生产。1999年末罗永章博士在新成立的烟台麦得 津生物工程股份有限公司首次将Endostatin大规模成功复制，并通过改变 氨基酸序列显著提高该蛋白的药用性和疗效，之后将某命名为Endostar即恩度。经过一系列技术攻关，于2005年9月12日被国家食品药品监督管理 局批准为生物制品一类抗肿瘤新药，成为世界上首例血管内皮抑制素抗癌新 药。"恩度"这一国家一类新药，在世界抗肿瘤领域占据绝对的领先地位。 然而目前恩度的使用都是配用其它常规药物以期增强药效，还未见有将恩度 药物与无机纳米材料复合使用的报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种Si02/Au 核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物。
本发明的另一目的在于提供一种上述复合物的制备方法。 本发明的目的通过下述技术方案实现本发明提供的一种Si02/Au核壳 结构纳米材料-生物蛋白药物复合物是将Si02/Au核壳结构纳米材料通过 Au-S键嫁接生物蛋白药物，并通过硫垸聚乙二醇封闭Si02/Au核壳结构纳米 材料的剩余的非活性位点，以增加体系的生物相容性，延长药物在体内的循 环时间。
上述复合物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤
(1) 将氨基聚乙二醇(PEG-NH2)与2-亚氨基硫垸按摩尔比l: l在碳酸 钾溶液中反应1 2 h，将反应物用水透析提纯，得到硫烷聚乙二醇(PEG-SH);
(2) 取Si(VAu核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和偶联剂在碳酸钾溶 液中混合，静置过夜，加入步骤(1)所得的硫垸聚乙二醇，在弱碱性的缓 冲溶液条件下反应1 2 h，得到Si02/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物 复合物。
步骤(1)所述氨基聚乙二醇(PEG-NH2)的制备方法包括以下操作步骤 将100 mL环氧乙垸溶于50mL的四氢呋喃(THF)溶液中，加入76 mL浓度 为0.5mol/L的双(三甲基硅烷基)氨基钾甲苯溶液中，在氮气保护条件下， 于18 25°C搅拌72 96 h，加入lmL浓度为lmol/L的盐酸，将上述混合液 倒入500 800 mL二乙醚中，将沉淀物用二乙醚洗涤后真空干燥，得到分子 量为4800 5200的氨基聚乙二醇。
步骤(2)所述生物蛋白药物是血管内皮抑制素；所述偶联剂的一端能 够和蛋白质偶合，另一端含有巯基-SH或者S-S键能够与金属偶合，优选2-亚氨基硫烷、正吡啶基二硫化物-聚乙二醇-N-羟基琥珀亚酰胺；所述缓冲溶 液是磷酸盐(PBS)缓冲液；所述Si02/Au核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和偶联剂的摩尔比为l: 100 200: 100 200。
步骤(2)所述Si(VAu核壳结构纳米材料的制备方法包括以下步骤
a、 单分散的二氧化硅纳米粒子的制备在磁力搅拌作用下，将体积比 为20: 50: 3: 10的水、无水乙醇、正硅酸乙酯和氨水混合反应，得到粒径 为110 120nm的单分散的二氧化硅纳米粒子；
b、 氨基化的二氧化硅纳米粒子的制备将步骤a所得二氧化硅纳米粒 子分散于17 19 mL无水乙醇中，加入70 90pL氨丙基三甲氧基硅烷
(APTMS)，搅拌，静置8 h，水浴煮沸，离心洗涤，得到氨基化的二氧化硅 纳米粒子；
c、 二氧化硅金种溶液的制备将粒径为1 2 mn金胶体与步骤b所得 氨基化的二氧化硅纳米粒子混合，触点超声30 s，于2 8°C沉化8 h，离 心洗涤，分散于18mL水中，得到二氧化硅金种溶液；
d、 Si(VAu核壳结构纳米材料的制备将40 60 mg无水碳酸钾溶于200 ml高纯水中，加入3 mL浓度为25 mmol/L的氯金酸溶液，沉化8 h，得到 氯金酸/碳酸钾沉化液；取体积比为l: 1000的二氧化硅金种溶液和氯金酸 /碳酸钾沉化液混合，加入还原剂，得到粒径为130 150nm的Si02/Au核壳 结构纳米材料。
步骤d所述还原剂是甲醛、硼氢化钠、盐酸羟胺、四羟甲基氯化磷或抗 坏血酸。
步骤d所述氯金酸和还原剂的摩尔比为1: 100 300。控制氯金酸与还 原剂的用量比，可以实现光学性质在近红外光区的调节。
上述方法制备的Si02/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物可用 于制备抗癌药物。
本发明的原理是首先使用St5ber法制备了单分散的纳米二氧化硅球， 然后将氨丙基三甲氧基硅垸(APTMS)嫁接到二氧化硅球表面，在二氧化硅 表面覆盖约为5-10层，其向外伸出的胺基作为氧化硅表面新的功能基团。 洗涤后，加入细小的金胶体溶液(1-2 nm)，Si02核球表面来自于APTMS中的 -NH2基通过静电作用吸附金胶体并作为金种，形成金的成核与还原部位。随 后，通过加入还原剂引发HAuCl4还原反应，生成的Au在金种部位不断生长、 相连，最终在二氧化硅球表面形成完整的包覆金壳层，'形成的纳米壳层连续 性好、致密度高。然后将生物蛋白药物使用简单的偶联剂2-亚氨基硫垸嫁接 到Si02/Au纳米核壳结构表面，2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane)是常用的多肽药物偶联剂，蛋白质或者多肽上的NH2首先进攻2-亚氨基硫烷中的C+，使 之开环放出巯基，而多肽则连接在C+—端。释放出的巯基可以很容易偶联到 金纳米壳层表面，最后用PEG-SH封闭Si(VAu上的残余非活性位点，增加体 系的生物相容性，。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果(1)本发明提供 了一种Si(VAu核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物，复合了无机纳米粒 子的物理治疗与蛋白药物的生物治疗作用，显著提高了对肿瘤的治疗效果， 可以作为一种新的抗癌药物；(2)本发明使用简单的方法制成了包裹紧密、 分布均匀的Si(VAu纳米核壳结构，通过简单可行的方法调谐其表面等离子 共振吸收峰位在近红外光区移动；(3)充分利用我国恩度等生物蛋白药物在 世界占据领先地位这一优势，将恩度药物的饿杀癌细胞作用与Si02/Au核壳 结构的光热治疗肿瘤的作用复合到一起，填补了恩度药物在使用上与无机纳 米材料复合这一项空白；(4)使用最简单的蛋白偶联剂(2-亚氨基硫烷)将 蛋白药物嫁接到Si(VAu纳米核壳结构上，为实现以后更多的生物药物与无 机纳米材料复合提供了简单、可行的方案。


图1是粒径为120nm的氨基化的二氧化硅纳米粒子的透视电镜(TEM)形 貌图。
图2是二氧化硅金种的透视电镜(TEM)形貌图； 图3是Si(VAu纳米核壳结构的透视电镜(TEM)形貌图； 图4是氯金酸与甲醛的摩尔比为1:100时制备的Si02/Au纳米核壳结构 纳米材料的表面等离子共振吸收光谱图。
图5是氯金酸与甲醛的摩尔比不同时制备的Si02/Au纳米核壳结构纳米
材料-恩度复合物的表面等离子共振吸收光谱图。
图6是Si(VAu核壳结构纳米粒子与Si02/Au-血管内皮抑制素复合粒子 对A549肺腺癌细胞增殖的抑制率曲线图。
图7是Si02/Au-血管内皮抑制素复合粒子作用体外细胞48小时后经 808nm红外光照射7分钟后的原子力显微镜图，其中左图为正常细胞，中 图为经浓度为lmg/L的Si02/Aii-血管内皮抑制素复合粒子作用的细胞，右图 为经浓度为3mg/L的Si02/Au-血管内皮抑制素复合粒子作用的细胞。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限 于此。
实施例1
Si02/Au核壳结构纳米材料的制备
a、 单分散的纳米二氧化硅球的制备取10 ml高纯水加入到三角烧瓶 中，加入25ml无水乙醇，5ml氨水，磁力搅拌均匀后加入1. 5ml正硅酸乙 酯，室温下搅拌12 h，得到粒径为120 nm的Si02纳米粒子；
b、 氨基化的二氧化硅纳米粒子的制备..加入80 ul氨丙基三甲氧基硅 垸，搅拌10min，静置8h，水浴煮沸2h，以6000 r/min的转速离心洗涤， 得到氨基化的二氧化硅纳米粒子，TEM形貌图如图1所示，分布较均匀；
c、 二氧化硅金种溶液的制备将粒径为1-2nm金胶体与步骤b所得氨 基化的二氧化硅纳米粒子混合，触点超声30s，于4t:下沉化8h，以3000 r/min的转速离心洗涤，得到浓度为3. 89x1012 m1—1的二氧化硅金种溶液，TEM 形貌图如图2所示，可以清楚的看到细小的金纳米胶体均匀吸附在Si02表面，
提供进一步包金所需的成核位点；
d、 Si(VAu核壳结构纳米材料的制备将200ml高纯水中加入50mg无 水碳酸钾，然后加入3ml 25mmol/L的HAuCl4溶液沉化8 h，得到氯金酸/碳 酸钾沉化液；取25 uL步骤c所得二氧化硅金种溶液与24 mL氯金酸/碳酸 钾沉化液混合后，加入甲醛，所述氯金酸和甲醛的摩尔比为1: 100，片刻即 可观察到颜色变化，得到Si02/Au核壳结构纳米材料，TEM形貌图如图3所 示；测定其表面等离子共振吸收光谱如图4所示，可以看到在近红外区出现 较宽吸收峰，最高峰位在824 nm处。 '
Si02/Au核壳结构纳米材料-血管内皮抑制素复合物的制备. (l) 将IOO mL环氧乙烷溶于50 mL THF中，加入0. 5 M溶在甲苯溶液 中的双(三甲基硅烷基)氮基钾76 mL，混合液在氮气保护下，于20 。C搅 拌96 h后，用1N的盐酸处理，将混合液倒入500 mL 二乙醚中，将沉淀物 用二乙醚洗涤并真空干燥，得到分子量为4800-5200的氨基聚乙二醇；
(2) 将氨基聚乙二醇与2-亚氨基硫烷按摩尔比1: 1在碳酸钾水溶液中 反应lh，将反应物用二次蒸馏水透析提纯，得到硫垸聚乙二醇；
(3) 取Si02/Au核壳结构纳米材料、血管内皮抑制素和2-亚氨基硫垸 在碳酸钾溶液中混合，其中Si02/Au、血管内皮抑制素与2-亚氨基硫垸反应的摩尔比为l: 100: 100，静置过夜，加入步骤(2)所得的硫烷聚乙二醇，
在弱碱性的PBS缓冲溶液种反应，得到Si02/Au核壳结构纳米材料-血管内皮 抑制素复合物。
将上述表面修饰好的样品真空干燥后，进行红外吸收光谱测定，可以确 认恩度药物血管内皮抑制素己被成功嫁接到Si02/Au纳米核壳结构上。 将产物用PBS缓冲液洗涤，最后分散于PBS缓冲液中，4'C保存。
实施例2
步骤d采用氯金酸与甲醛的摩尔比分别为1:100、 1:150、1:200、 1:250; 或1:300，其余步骤同实施例l，所得产物Si(VAu核壳结构纳米材料-恩度 复合物测得表面等离子共振吸收光谱如图5所示，发现产物的吸收峰随着还 原剂甲醛用量的提高而向长波方向移动，吸收峰红移了 130mn。曲线a、 b 、 c、 d和e分别代表氯金酸与甲醛的摩尔比分别为1:100、 1:150、 1:200、 1:250和1:300时的吸收曲线，说明此反应可进一步通过调节还原速率控制 吸收峰位置，该现象未见文献报道。
实施例3
将实施例1所得Si02/Au-血管内皮抑制素复合物用于进行体外肺癌细胞 杀灭试验使用波长为808 nm红外激光器，照射时间为7分钟，肺癌细胞 抑制率采用MTT法测得，结果如图6所示当用单纯Si02/Au核壳结构纳米 材料进行体外肺癌细胞杀灭试验时，其对肺癌细胞的抑制率为30%;而 Si02/Au核壳结构纳米材料-血管内皮抑制素复合物进行体外肺癌细胞杀灭 试验时，其在相同条件下对肺癌细胞的抑制率提高到88%。可见，Si02/Au_ 血管内皮抑制素复合物对体外癌细胞的抑制率确实有非常显著的效果。
实施例4
将实施例1所得Si02/Au-血管内皮抑制素复合物作用体外细胞48小时 后，经808nm红外光照射7分钟后，将体外细胞用原子力显微镜观察，如图 7所示，左图为正常细胞，中图为经浓度为lmg/L的Si02/Au-血管内皮抑制 素复合粒子作用的细胞，右图为经浓度为3mg/L的Si02/Au-血管内皮抑制素 复合粒子作用的细胞，可以看出在灭杀试验前细胞表面光滑、平整；而在用 Si02/Au-血管内皮抑制素复合纳米药物试验后，细胞变得坑洼，皱縮，细胞边缘绒毛掉落，当提高药物浓度时，细胞甚至出现孔洞，呈现死亡状态。所以
Si02/Au-血管内皮抑制素复合粒子对癌细胞的抑制除具有一定的时间依赖性， 还具有一定的浓度依赖性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述 实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护 范围之内。
权利要求
1、一种SiO2/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物，其特征在于所述复合物是将SiO2/Au核壳结构纳米材料通过Au-S键嫁接生物蛋白药物，并通过硫烷聚乙二醇封闭SiO2/Au核壳结构纳米材料的剩余的非活性位点。
2、 根据权利要求1所述的复合物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤(1) 将氨基聚乙二醇与2-亚氨基硫垸按摩尔比1: 1在碳酸钾溶液中反应 1 2 h，将反应物用水透析提纯，得到硫垸聚乙二醇；(2) 取Si02/Au核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和偶联剂在碳酸钾溶液中混合，静置过夜，加入步骤(1)所得的硫垸聚乙二醇，在弱碱性的缓冲溶液条件下反应1 2 h，得到Si02/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物。
3、 根据权利要求2所述的复合物的制备方法，其特征在于步骤(1)所 述氨基聚乙二醇的制备方法包括以下操作步骤将IOO mL环氧乙垸溶于50mL 的四氢呋喃溶液中，加入76mL浓度为0.5mol/L的双(三甲基硅烷基)氨基 钾甲苯溶液中，在氮气保护条件下，于18 25°C搅拌72 96 h，加入l.mL浓 度为lmol/L的盐酸，将上述混合液倒入500 800 mL 二乙醚中，将沉淀物用 二乙醚洗涤后真空干燥，得到分子量为4800 5200的氨基聚乙二醇。
4、 根据权利要求2所述的复合物的制备方法，其特征在于步骤(2)所 述生物蛋白药物是血管内皮抑制素；所述偶联剂是2-亚氨基硫烷或正吡啶基二 硫化物-聚乙二醇-N-羟基琥珀亚酰胺；所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲液。
5、 根据权利要求2所述的复合物的制备方法，其特征在于步骤(2)所 述Si02/Au核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和偶联剂的摩尔比为1:100 200: 100 200。
6、 根据权利要求2所述的复合物的制备方法，其特征在于步骤(2)所 述Si02/Au核壳结构纳米材料的制备方法包括以下步骤a、 单分散的二氧化硅纳米粒子的制备在磁力搅拌作用下，将体积比为20: 50: 3: 10的水、无水乙醇、正硅酸乙酯和氨水混合反应，得到单分散的 二氧化硅纳米粒子；b、 氨基化的二氧化硅纳米粒子的制备将步骤a所得二氧化硅纳米粒子分散于17 19mL无水乙醇中，加入70 9(^L氨丙基三甲氧基硅垸，搅拌，静 置8 h，水浴煮沸，离心洗涤，得到氨基化的二氧化硅纳米粒子；c、 二氧化硅金种溶液的制备将粒径为1 2 nm的金胶体与步骤b所得 氨基化的二氧化硅纳米粒子混合，触点超声30 s，于2 8 。C沉化8 h，离心 洗涤，得到二氧化硅金种溶液；d、 Si02/Au核壳结构纳米材料的制备将40 60 mg无水碳酸钾溶于200 ml 高纯水中，加入3 mL浓度为25 mraol/L的氯金酸溶液，沉化8 h，得到氯金酸 /碳酸钾沉化液；取体积比为l: 1000的二氧化硅金种溶液和氯金酸/碳酸钾沉 化液混合，加入还原剂，得到Si02/Au核壳结构纳米材料。
7、 根据权利要求6所述的复合物的制备方法，其特征在于步骤a所得 二氧化硅纳米粒子的粒径为110 120nm;步骤d所得Si02/An核壳结构纳米材 料粒径为130 150 nm。
8、 根据权利要求6所述的复合物的制备方法，其特征在于步骤d所述 还原剂是甲醛、硼氢化钠、盐酸羟胺、四羟甲基氯化磷或抗坏血酸。
9、 根据权利要求6或8所述的复合物的制备方法，其特征在于步骤d 所述氯金酸和还原剂的摩尔比为1: 100 300。
10、 根据权利要求1所述的复合物作为制备抗癌药物的用途。
全文摘要
本发明涉及一种SiO₂/Au核壳结构纳米材料-生物蛋白药物复合物，所述复合物是将SiO₂/Au核壳结构纳米材料通过Au-S键嫁接生物蛋白药物，并通过硫烷聚乙二醇封闭SiO₂/Au核壳结构纳米材料的剩余的非活性位点。其制备方法包括(1)将氨基聚乙二醇与2-亚氨基硫烷按摩尔比1∶1在碳酸钾溶液中反应1h，将反应物用二次蒸馏水透析提纯，得到硫烷聚乙二醇；(2)取SiO₂/Au核壳结构纳米材料、生物蛋白药物和2-亚氨基硫烷在碳酸钾溶液中混合，静置过夜，加入步骤(1)所得的硫烷聚乙二醇，在弱碱性的缓冲溶液条件下反应，得到复合物。本发明复合了无机纳米粒子的物理治疗与蛋白药物的生物治疗作用，显著提高了对肿瘤的治疗效果，可以作为一种新的抗癌药物。
文档编号A61K47/02GK101411879SQ200810219518
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者张浩然, 萌 徐, 满石清 申请人:暨南大学