创伤修复组合物及方法

专利名称：创伤修复组合物及方法
技术领域：
本发明涉及创伤愈合。更具体而言，本发明涉及共价结合的匪P抑制剂用以促进
慢性创伤愈合的用途。
背景技术：
慢性创伤的治疗在医疗保健系统中是个很大的负担。目前，在澳大利亚1_3%的人 口因慢性创伤而蒙受损害，医疗保健费用每年超过5亿美元。 慢性创伤使患者感到虚弱，并负面影响他们的生活质量。对创伤疼痛的治疗经常 被确定为慢性创伤处理中的主要优先考虑之一。在极端的情况下，必须进行患肢的截肢。
目前，对于慢性创伤没有单一的可接受的疗法。使用生长因子的局部疗法已显示 出仅部分有效。已经提议的是，这种疗法仅有有限的成功，这是由于在慢性创伤液中发现高 水平的蛋白酶，导致生长因子降解。特别是在慢性创伤液中发现高水平的基质金属蛋白酶 (匪P)，它们可以解释细胞外基质以及对于创伤愈合关键的关键因子(包括生长因子)的降 解。为解决该问题，一些疗法集中在抑制一种或多种匪P以减少蛋白水解环境。
美国专利5， 652， 227公开了作为匪P抑制剂的二膦酸盐(bisphosphonate)用以 减少哺乳动物的结缔组织基质蛋白组分的过度降解的用途。使用氯膦酸盐(clodronate) 抑制匪P-1和匪P-8被描述为特别合意的。二膦酸盐通过口服、静脉或局部递送，即意图使 得全身以及创伤组织和创伤液可获得二膦酸盐。 PCT公布W0 2006/126926教导了具有匪P抑制剂附着其上的缝合线可用于预防在 外科手术后缝周围组织的弱化或软化。抑制剂可通过吸附、静电作用或共价结合附着于缝 合线。因此，该发明的目的是使得匪P抑制剂与缝合的组织直接接触以抑制组织降解并由 此抑制缝的松弛。 组织与抑制剂的局部接触对于系统给药是有利的。但是，其中记载到，合意的是 匪P抑制剂应该逐渐从与缝合线相关的纤维蛋白原基质中释放出来，因此共价和静电装填 的结合是优选的附着于缝合线的方法。因此，较大比例的匪P抑制剂待释放进入创伤中和 创伤周围的组织中。 W0 2002/40058公开了一种与聚合物(例如聚(乙二醇))共价结合的二膦酸盐， 其也具有通过可降解交联剂结合的生物活性剂。在该发明中的二膦酸盐仅使用其羟基磷灰 石的目标能力。 二膦酸盐用于使聚合物定位于骨表面，且随着可降解交联剂降解，释放生物活性 剂。这使得骨表面能够用作可释放的生物制剂的贮器。二膦酸盐仅仅作为目标部分存在， 其通过很多可能的递送路径全身可得。 已经报道在慢性创伤中匪P的作用并不像最初想象的那么简单，它们在生成创伤 液的蛋白水解环境中的破坏作用仅代表了其部分作用。

发明内容
创伤组织中的一些匪P已显示在诸如伤口床中的生长因子活化和免疫系统调节 (它们是创伤愈合中的重要步骤)的过程中起很多重要的作用。现有技术的方法为，在创伤 液和创伤床中的所有匪P均暴露于匪P抑制剂，但这并不是实现正常愈合的最佳方式。
发明人已经确定了对于创伤的有效治疗所必需的方面。在一个具体形式中，本发 明使用共价结合至聚合物的匪P抑制剂作为待施用于创伤的创伤敷料组合物(dressing composition)的一部分。这将确保慢性创伤液中的匪P得以抑制，由此减少该液体的蛋白 水解含量，而在创伤床中正常愈合所需的匪P并不受影响或受到的影响程度基本上较小。
在一个形式中，所述形式未必是唯一或最宽的形式，本发明提供一种敷料组合物， 所述组合物包括与聚合物共价结合的匪P抑制剂，由此大部分的匪P抑制剂保持与敷料结 合而不能进入创伤组织中。 本发明的第一个方面为敷料组合物，所述组合物包括与聚合物共价结合的二膦酸 盐和/或其衍生物或其药学上可接受的盐，其中，当敷料与创伤接触时，基本上所有的二膦 酸盐留在敷料中而不能进入创伤组织中。
合适地，二膦酸盐为氨基_ 二膦酸盐。 优选地，所述氨基_ 二膦酸盐为阿伦膦酸盐(alendronate)。 合适地，所述聚合物为水凝胶聚合物。典型地，所述水凝胶聚合物包括聚(甲基丙烯 酸2-羟乙酯)。优选地，所述水凝胶聚合物包括聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)和聚(乙二醇)。
如果需要，二膦酸盐与引入聚合物中的单体共价结合。合适地，所述单体选自丙烯 酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯砜或聚(乙二醇)醛。优选地，所述单体为甲基丙烯酰氯。
本发明的第二个方面为制备敷料组合物的方法，该方法包括使得二膦酸盐与聚合 物共价结合从而制备所述敷料组合物的步骤。 本发明的第三个方面为匪P抑制剂_单体结合物，其包括结合至单体的匪P抑制 剂。 合适地，所述匪P抑制剂为阿伦膦酸盐。
优选地，所述单体为甲基丙烯酰氯。 本发明的第四个方面为制备匪P抑制剂_单体结合物的方法，该方法包括使匪P 抑制剂与单体结合以形成匪P抑制剂_单体结合物的步骤。 本发明的第五个方面为具有匪P抑制剂_单体结合物与之结合的敷料组合物。
本发明的第六个方面为选择性抑制需要这种疗法的患者的创伤液中的匪P而不 抑制创伤组织中的匪P的方法，该方法包括使创伤液接触敷料组合物中的与聚合物共价结 合的匪P抑制剂从而选择性抑制创伤液中的所述匪P而不抑制创伤组织中的所述匪P的步骤。 优选地，在创伤液中受抑制的匪P为匪P-9。 本发明的第七个方面为动物创伤的治疗性处理方法，该方法包括向动物给予第一 或第三方面的敷料组合物的步骤。
优选地，所述动物为哺乳动物。
更优选地，所述动物为人类。 在整个说明书中，除非上下文另有需要，词语"包括"应被理解为表示含有所述的一个整数或一组整数，但是并不排除任何其他的一个整数或一组整数。


图1显示了阿伦膦酸盐与甲基丙烯酰氯反应形成结合物及其包含至pHEMA聚合物 中。 图2显示了在用阿伦膦酸盐温育(incubation)前和温育后六个慢性创伤液样品 的骨胶原类型1酶谱法测定的结果。 图3显示了在用阿伦膦酸盐_甲基丙烯酸酯结合物温育前和温育后六个慢性创伤 液样品的骨胶原类型1酶谱法测定的结果。 图4为相比于未处理的对照样，用阿伦膦酸盐和阿伦膦酸盐_甲基丙烯酸酯结合 物进行抑制而获得的蛋白酶活性的相对减少的图。 图5显示了在用引入共价结合的阿伦膦酸盐的聚合物温育前和温育后慢性创伤 液样品的骨胶原类型1酶谱法测定的结果。 图6为相比于未处理的对照样，用引入共价结合的阿伦膦酸盐的聚合物进行抑制 而获得的蛋白酶活性的相对减少的图。
具体实施例方式
本发明的一个方面为敷料组合物，其包括与聚合物共价结合的二膦酸盐和/或其 衍生物或其药学上可接受的盐，其中，当敷料与创伤接触时，基本上所有的二膦酸盐留在敷 料中而不能进入创伤组织中。 在特定的具体实施方案中，所述创伤为慢性创伤。 本文中所用的术语"慢性创伤"通常表示皮肤的任何破裂或溃疡，所述破裂或溃疡
为长期的或频繁复发的，或者不能通过有序和及时的连续修复而有所进展。 本文中用于描述留在敷料组合物中的匪P抑制剂，例如二膦酸盐的量的术语"基
本上所有"是指80X或更多的匪P抑制剂保持结合。在特定的具体实施方案中，其包括
80% 、85% 、90% 、91 % 、92% 、93% 、94% 、95% 、96% 、97% 、98% 、99%和100%。 尽管不愿受限于任何特定理论，但已经发现的是，与急性创伤相比，在慢性创伤的
创伤液中存在升高水平的匪P，这极大地促成了创伤的蛋白水解环境，该环境极不利于正常
愈合所必需的生长因子和结缔组织蛋白质装配。本发明人已经显示匪P-9是造成慢性创伤
液中骨胶原降解的主要匪P。 已经显示的是，在创伤床的活组织检查中发现的活性匪P的降低的水平导致不愈 合创伤的慢性化。已证明从慢性创伤床中分离的成纤维细胞中的匪P水平也显著降低。因 此，认为这些匪P对于创伤组织的正常愈合发挥作用。例如，在现有的疗法中，向创伤中引 入匪P抑制剂，由此所述抑制剂自由扩散至创伤组织和全身体循环中，以及与创伤液接触， 因此并不能提供对于创伤愈合起作用的因子的最佳控制。 在此呈现的对于该问题的一个解决方案是抑制引起骨胶原基质和生长因子降解
的慢性创伤液中的匪P，同时确保所用匪P抑制剂基本上不能扩散或移动至创伤床和外围
组织中，从而使得合适水平的活性匪P可以维持在用于正常愈合的创伤床中。 这可通过提供一种或多种匪P抑制剂与之共价结合的创伤敷料组合物得以实现。所述敷料将接触慢性创伤液，这样其中的匪P将受到抑制。这样，慢性创伤液的蛋白水解环 境受到控制，从而促进骨胶原基质的形成并因此愈合。由于一种或多种匪P抑制剂被共价 结合，它们基本上不释放至创伤床中，这样在正常愈合所必需的组织中的活性匪P的水平 可得以维持。由此在创伤的表面上获得改进的愈合环境，且不破坏创伤组织中的正常愈合 机制。 因此，应该理解的是，结合的匪P抑制剂将优先抑制、禁止、钝化或以某种方式降 低创伤液中一种或多种匪P的活性，而不是抑制、禁止、钝化或以某种方式降低创伤组织中 的一种或多种匪P的活性。 本领域技术人员应将用于描述创伤渗出液的术语"创伤液"理解为从血管中渗出 并已沉积在创伤组织上的富含蛋白质和细胞元素的液体。 术语"创伤组织"和"创伤床"应被理解为包括暴露于大气的创伤的上层细胞层以 及参与组织再生和其他愈合过程的较深细胞层。 当创伤敷料与创伤液接触时，创伤液被引入敷料中。这是特别需要的，因为随着更 多的创伤液从创伤床中弓I出，其中更多的匪P通过与敷料中的匪P抑制剂接触而受到抑制。 这也表明匪P抑制剂并不必然需要与创伤床密切接触以确保创伤液中的匪P受到抑制，因 此在创伤床的上层细胞层中的匪P被不慎抑制的机会较少。在本发明的一个具体实施方案 中，有能力吸收创伤液并存储创伤液的敷料组合物是特别适合的。 水凝胶聚合物可用于此目的。水凝胶为天然或合成聚合物，其具有高度吸收能力， 且由于它们具有高的含水量，因而具有与天然组织类似的灵活度(flexibility)。聚乙烯吡 咯烷酮(PVP)，丙烯酰胺凝胶和聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(pHEMA)都是水凝胶的例子。在 本发明的一个优选的具体实施方案中，创伤敷料组合物聚合物为丙烯酸的羟烷基酯或甲基 丙烯酸的羟烷基酯。在一个特别优选的具体实施方案中，敷料组合物聚合物为包括聚(甲 基丙烯酸2-羟乙酯)的水凝胶。更优选地，创伤敷料聚合物为包括聚(甲基丙烯酸2-羟 乙酯)和聚(乙二醇)(PEG)的水凝胶。 匪P的任何抑制剂都适合与用于治疗慢性创伤的创伤敷料共价结合。这样的抑制 剂的例子包括但不限于阳离子螯合剂，例如乙二胺四醋酸(EDTA)，四环素及其衍生物，氧肟 酸和二膦酸盐。 二膦酸盐表现出低毒性和良好的耐受性，主要在钙的管理和骨代谢紊乱方面具有 数年的人类使用。在本发明的一个优选具体实施方案中，与创伤敷料结合的匪P抑制剂为 二膦酸盐。这样的二膦酸盐的非限制性的例子为依替膦酸钠、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、帕 米膦酸盐、奈立膦酸钠、奥帕膦酸盐、阿伦膦酸盐、伊班膦酸盐、利塞膦酸钠、唑来膦酸盐、 YH529、伊卡膦酸盐(YM175)和EB_1053。 由于敷料组合物易于制备(这将在下文进行描述)，特别优选固定于聚合物上的 二膦酸盐为氨基_ 二膦酸盐。非限制性例子包括阿伦膦酸盐、氨羟二磷酸二钠、奈立膦酸钠 或伊卡膦酸盐。 考虑到发明人发现匪P-9是引起慢性创伤液中骨胶原降解的主要蛋白酶，特别希 望的是选择为匪P-9的特异性抑制剂的匪P抑制剂。这对于最佳地抑制创伤液的蛋白水解 环境具有合意的作用。这样的匪P-9特异性抑制剂的一个非限制性例子为阿伦膦酸盐。在 一个优选的具体实施方案中，阿伦膦酸盐为与本发明的创伤敷料组合物结合的匪P-抑制剂。 匪P抑制剂的另一例子为抗-匪P抗体。 在这方面，抗-MMP-9单克隆的抗体是可市购得到的(例如，获自Calbiochem 的小鼠mAb 606B)，在Symowicz等人，2007， Cancer Res. 67 2030和Andrews等人，2000， Am. J. Pathol. 157303中也有所描述。 本发明还提供了一种制备匪P抑制剂_单体结合物的方法，该方法包括使匪P抑 制剂与单体结合以形成匪P抑制剂_单体结合物的步骤。如果需要，然后将匪P抑制剂_单 体结合物引入敷料组合物的聚合物中。 在一个特定的具体实施方案中，提供一种制备匪P抑制剂_甲基丙烯酸酯结合物 的方法，该方法包括使匪P抑制剂与甲基丙烯酸酯单体结合以形成匪P抑制剂_甲基丙烯 酸酯结合物的步骤。 这种类型的反应的一个例子示于图1。在下文中进一步描述了形成结合物的反应。
在另一方面，本发明为制备敷料组合物的方法，该方法包括使得二膦酸盐与聚合 物共价结合从而制备所述敷料组合物的步骤。 在一个具体实施方案中，首先使得二膦酸盐与引入聚合物中的单体共价结合。因
此，本发明包括制备敷料组合物的方法，该方法包括如下步骤 a)使匪P抑制剂与单体结合以形成匪P抑制剂_单体结合物；以及 b)将匪P抑制剂_单体结合物引入聚合物中由此制得敷料组合物。 用以形成匪P抑制剂-单体结合物的单体可以选自广泛范围内的合适的单体。非
限制性的例子为丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，乙烯砜或聚(乙二醇)(PEG)醛。丙烯酸酯和甲
基丙烯酸酯是特别有用的，在一个优选的具体实施方案中，所选单体为甲基丙烯酸酯单体。 所用的特定的单体可基于其必须具有或能够被改性为具有的两个官能团
(functionality)进行选择。第一个是与二膦酸盐反应以使两者共价结合在一起的官能团，
第二个是具有能够通过另一共价键(如果需要)使得匪P抑制剂-单体结合物引入聚合物
中的官能团。 上述用于与匪P抑制剂反应的单体的可显示的有用的官能团的一些例子为羧酸， 酰卤、醛、酮、环氧化基团(印oxide)、磺酰和琥珀酸亚胺，例如N-羟基琥珀酰亚胺和苹果酰 胺。这些官能团对于二膦酸盐具有的例如羟基或氨基基团部分的亲核攻击特别敏感。
已经发现在单体中存在的可用双键，例如乙烯基，特别适合将匪P抑制剂_单体结 合物随后引入敷料组合物的聚合物中。 应该理解的是所述的与单体相关的官能团实际上可通过二膦酸盐引入，反之亦 然。重要的一点在于两者能够反应以形成共价键并具有待引入聚合物中的必要官能团。
在一个优选的具体实施方案中，所选单体为甲基丙烯酰氯，其具有与二膦酸盐的 亲核试剂结合的高反应性酰氯官能团和与聚合物组分单体聚合的乙烯基团。
有利地，多于一种匪P抑制剂与一种创伤敷料结合。当多于一种副型(sub-type) 蛋白酶特别地用于抑制目的时，这是有用的。为实现此目的，制备抑制剂和/或抑制剂_单 体结合物的各个组合物。然后，在初始化聚合反应前使这些组合物结合以形成创伤敷料组 合物。如果抑制剂或结合物的官能团不同，则应该仔细选择聚合物或反应条件以确保没有 不良反应或副反应。
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使匪P抑制剂与单体结合以形成匪P抑制剂_单体结合物的确切机理将随着所选 的特定抑制剂和单体而变化。 在一个优选的具体实施方案中，当匪P抑制剂为阿伦膦酸盐时，则如上所述，所选 用于结合的单体为甲基丙烯酰氯。这些化合物的反应示于图1，其中阿伦膦酸盐的伯胺与甲 基丙烯酰氯的酰氯官能团反应以得到酰胺键。酰胺键是特别合意的，因为与例如酯键相比， 其不易于被天然存在的酶分开。只要所选匪P抑制剂能够与存在于单体中的官能团反应， 则所述单体可用于本发明的创伤敷料，但是优选匪P抑制剂与单体官能团的结合以反应形 成强和稳定的共价键，例如酰胺键。简而言之，在匪P抑制剂与单体结合以形成结合物和/ 或与聚合物结合时，特别优选在创伤液的生理学条件下不可能被水解或分开至任何较大的 程度的任何键的形成。 如上所述，通过甲基丙烯酰基(methacryloyl)单体与匪P抑制剂的反应得到的结 合物通常具有使其能够引入聚合物中的官能团。在如图l所示的例子中，该官能团为链烯 烃部分(在此情况下为乙烯基团)。这适合在聚合反应过程中通过辐射与甲基丙烯酸2-羟 乙酯(HEMA)单体的可利用双键进行反应。接着形成具有引入的共价结合的阿伦膦酸盐的 最终聚合物，如图l所示。 阿伦膦酸盐和甲基丙烯酰氯的这种结合以形成结合物以及将其引入pHEMA是特 别有利的方法。阿伦膦酸盐具有自由胺官能团，其通常可与甲基丙烯酰氯的酰氯反应而无 需在反应前进行任何改性或官能团转化。这提供了通过酰胺键连接的阿伦膦酸盐和甲基丙 烯酸酯的结合物，所述酰胺键在慢性创伤液的生理学条件下对于水解或酶解特别稳定。然 后，将该结合物引入HEMA(其形成特别有用的水凝胶)，具有引入的结合物的聚合物在单一 辐射步骤中形成。因此，在最少的步骤中形成稳定和超吸收能力的具有共价结合的二膦酸 盐(阿伦膦酸盐)的敷料组合物，其以引起骨胶原降解的创伤液中的主要匪P(匪P-9)为目 标。 有利的是将敷料组合物的抑制剂活性集中在引起创伤液中不需要的蛋白水解活 性的主要匪P(匪P-9，如发明人所述)上。这确保了结合的疗法均以最小化由该匪P引起的 损害为目标并由此为创伤提供最佳的愈合机会。由于使用了目标方法，这也进一步减少了 正常愈合所必需的其他匪P的活性被大幅降低的可能性。 取决于用于形成创伤敷料所选择的MMP抑制剂和所用聚合物，有可能向聚合物中 直接引入匪P抑制剂而无需首先使匪P抑制剂与甲基丙烯酰基单体反应。例如，上述适合 单体的官能团可由聚合物直接提供或由聚合前的组成单体提供。而且，如果聚合所需官能 团不是链烯烃，则可以使用具有所需官能团以及与抑制剂结合的能力的不同种类的单体。
实施例部分给出了操作方法以制得根据本发明的一个优选具体实施方案的创伤 敷料。在该例子中，在组合物中包括平均分子量为20，000的聚(乙二醇)(PEG)以形成聚 合物。PEG不是必需的组分，可以不与交联的pHEMA化学结合。其作为添加剂存在以改进所 得水凝胶的物理特性和生物相容性。 PEG在创伤敷料组合物中的存在百分比为10重量％至80重量％ 。优选地，PEG在 创伤敷料组合物中的存在百分比为20重量％至60重量％ 。更优选地，PEG在创伤敷料组 合物中的存在百分比为25重量％至40重量％。甚至更优选地，PEG占创伤敷料组合物的 30重量％。
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其它添加剂可存在于敷料组合物中以改进所得创伤敷料的各种物理性能，例如其 物理强度，密度，溶胀特性，即改进的吸收创伤液的能力，生物相容性等。这样的添加剂是聚 合物化学和其他领域中经常使用的，对于本领域技术人员是公知的。 该实施例描述了 pHEMA作为阿伦膦酸盐化学引入的聚合物。匪P抑制剂能够被引 入且能够用作或制成创伤敷料的任何聚合物都在本发明的范围内。传统的布创伤敷料是适 当的，但是如前所述，水凝胶聚合物因其具有的吸收能力而受到优选。 当聚合时具有水凝胶性质的任何单体均适合包括在本发明的创伤敷料组合物中。 优选地，用于形成聚合物的单体为甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)单体。
取决于要求水凝胶具有的性质，HEMA单体在预聚合创伤敷料组合物中的重量百分 比存在量为5重量％至80重量％。优选地，HEMA单体的存在量为10重量％至60重量％。 更优选地，HEMA单体的存在量为15重量％至40重量％ 。甚至更优选地，HEMA单体形成创 伤敷料组合物的20重量％。 构成创伤敷料组合物的溶剂的选择取决于所选用于聚合反应的单体的性质。有机 和水溶液是适合的。在一个优选的形式中，所选溶剂为水。 本发明的又一方面为匪P抑制剂-甲基丙烯酸酯结合物，其包括与甲基丙烯酸酯 单体结合的匪P抑制剂。 本发明的敷料组合物通常如上所述进行配制。但是，在一个具体实施方案中，并不 进行向聚合物中的引入。这得到了匪P抑制剂-甲基丙烯酸酯结合物。该结合物可用于通 过许多方法处理创伤，这些方法使得匪P抑制剂与创伤液中的匪P接触但是不释放至创伤 组织中。在实施例中所述的引入聚合物中以形成创伤敷料仅仅是一个例子，是给予结合的 匪P抑制剂的非限制方式。 本发明还在于一种具有匪P抑制剂_单体结合物结合其中的敷料、植入物或修补 物。优选的结合物为匪P抑制剂-甲基丙烯酸酯结合物。 如上所述，匪P抑制剂-单体结合物可被结合至除了创伤敷料的一些其他器件上， 例如植入物或修补物。这些器件，与敷料一样，能够使得匪P抑制剂与创伤液接触而不会使 得抑制剂释放至创伤组织中至任何较大的程度。 本发明的另一方面为选择性抑制需要这种疗法的患者的创伤液中的匪P而不抑 制创伤组织中的匪P的方法，该方法包括使创伤液接触敷料组合物中的与聚合物共价结合 的匪P抑制剂从而选择性抑制创伤液中的所述匪P而不抑制创伤组织中的所述匪P的步骤。 在一个具体实施方案中，所述匪P抑制剂为二膦酸盐。
优选地，所述匪P抑制剂为阿伦膦酸盐。 合适的聚合物和将匪P抑制剂直接或通过单体固定于聚合物的方法如前所述。
优选地，治疗的患者为哺乳动物，例如但不限于人类、家畜、表演动物和宠物。
更优选地，所述患者为人类。
优选地，在创伤液中受抑制的匪P为匪P-9。 如前所述，创伤的处理应该包括使用匪P抑制剂降低创伤液的蛋白水解含量，但 是不希望同时抑制创伤组织中的匪P，因为这些匪P对于正常创伤愈合起重要作用。
在一个优选的具体实施方案中，匪P抑制剂作为敷料组合物的一部分递送。应该理解的是将结合的匪P递送至创伤液且不使其进入创伤组织的任何方法均在本发明的范 围内。 可以预期的是匪P抑制剂也能够通过聚合物喷雾方式进行递送。在一个特定的具 体实施方案中，可使用聚合物喷雾从而在原位形成包括所述匪P抑制剂的聚合物层，薄膜 或海绵。包含聚合物的使得匪P抑制剂不释放至创伤组织中的软膏或乳膏也是在本发明的 范围内考虑的敷料组合物。 聚合物薄膜的特定优点在于慢性创伤经常陷入炎症阶段的事实。例如，这能够通 过束缚于聚合物薄膜的氨基_ 二膦酸盐得以控制，使得与创伤床接触的聚合物薄膜的层能 够控制炎症。这也能够最小化由于过度发炎和免疫应答的增量调节而导致的生物膜的形 成。 本发明还在于对动物创伤的治疗性处理方法，该方法包括用如前所述的创伤敷料 组合物治疗(administering)动物的步骤。 特别适合采用本发明的敷料组合物治疗的慢性创伤为通过遵循阶段的有序设置 和在最急性创伤的正常时线内不愈合的任何创伤。大量慢性创伤可归为静脉曲张性溃疡、 糖尿病性溃疡和压迫性溃疡三类。这些慢性创伤花费数年愈合或从不愈合。
实施例部分描述了阿伦膦酸盐作为匪P抑制剂的功效。在图2中，在分析时看 到蛋白酶活性作为在深色背景上的清晰带，在六个不同患者的慢性创伤液的样品的道 (lane) 1-6中都能看到该带。这清楚地显示了创伤液中的蛋白水解环境。道7_12代表用阿 伦膦酸盐温育后的相同的创伤液样品。可见的清晰带的数目和强度降低，表明蛋白酶活性 得以极大降低。因此，二膦酸盐，特别是阿伦膦酸盐是用于本发明的创伤敷料中的合适类型 的创伤液匪P抑制剂。认为这些采用阿伦膦酸盐的结果是特别引人注目的，因为其抑制了 匪P-9，所述MMP-9被发明人确定为对骨胶原形成起作用的主要蛋白酶。对于创伤液中骨胶 原的降解并不特别有活性的画P的特定抑制剂明显不会呈现这样优异的结果，因此优选该 目标方法。 本发明的优点在于匪P抑制剂与创伤敷料共价结合从而使得基本上所有的匪P抑 制剂保持固定。再一次，以这种方式，创伤液中的匪P受到抑制、禁止、钝化，或者相比于创 伤组织中的那些匪P其活性以某种方式降低至更大的程度。 这不仅阻止了对于正常愈合有利的创伤组织中的活性匪P受抑制，而且减少甚至 消除了 MMP抑制剂的任何潜在副作用。例如，四环素及其类似物被用作匪P抑制剂，但是它 们表现出大量不合意的副作用，例如胃肠道紊乱和潜在的抗生素抗性问题。
由于其他现有技术疗法考虑使得匪P抑制剂全身可得或至少不阻止其扩散至组 织或循环系统，因此这些副作用是真正的问题。本发明的创伤敷料使得基本上所有的匪P 抑制剂保持结合，因此避免了所用匪P抑制剂可能会带来的任何潜在的副作用的问题。
本发明的进一步的优点在于为具有慢性创伤的患者提供一种简化的治疗方案。将 治疗性处理引入创伤敷料避免了需要口服、静脉、局部给药等。通常可以任何方式涂抹创 伤，因此将治疗性分子包括在敷料组合物中是方便和省时的。 本发明的创伤敷料组合物可提供作为患有慢性创伤的患者的唯一疗法或者其可 以与其他现有的疗法结合使用以改进创伤的愈合状态。施用所述创伤敷料直至创伤已经愈 合或者观察到愈合状态至少已改进。由于匪P抑制剂并不释放至创伤组织中，因此不必由
10医疗保健专业人员控制其剂量。只要需要就可以使用创伤敷料。
由本发明的创伤敷料组合物提供了另一优点。通常，创伤敷料吸收包含蛋白酶的
创伤液。因此，如果同时通过创伤敷料递送对蛋白酶敏感的治疗剂，例如生长因子、抗微生
物齐U、药品、抗生素，则存在于敷料中的匪P抑制剂可以钝化或降低蛋白酶远离创伤床的活
性，并阻止或最小化这些疗法的破坏作用，减少蛋白水解产物释放至创伤床中。 提及如下非限制性实施例以使得本发明易于理解并付诸实际效果。 实施例 采用阿伦膦酸盐的匪P抑制 由于发明人已经确定匪P-9是涉及降解慢性创伤液中的细胞外基质的主要蛋白 酶，因此测试二膦酸盐抑制匪P，特别是匪P-9活性的能力。选择阿伦膦酸盐(如其钠盐) 作为代表性的二膦酸盐。 用浓度为2mM的慢性创伤液样品在37t:下温育阿伦膦酸钠盐24小时。然后使用 骨胶原类型1酶谱法确定蛋白酶活性。胶原酶灵敏度可根据酶谱中深色背景上的清晰带来 确定，且可通过光密度分析法进行定量。 图2显示了该分析的结果。道1-6为六个不同患者的慢性创伤液样品，每个样品 加载500ng的总蛋白质。道7-12表示在用2mM阿伦膦酸盐在37。C温育24小时后相同的慢 性创伤液样品l-6，每个样品加载500ng的总蛋白质。 清晰可见的是，在用阿伦膦酸盐温育后蛋白酶活性大幅下降。这证明了二膦酸盐， 特别是阿伦膦酸盐是匪P的有效抑制剂，因此具有中和慢性创伤中存在的过量蛋白水解环 境并使它们向着愈合状态调整的潜力。
阿伦膦酸盐结合物形成和水凝胶弓|入 如图1所示，其中二膦酸盐为阿伦膦酸盐，阿伦膦酸盐的伯氨基能够与甲基丙烯 酰氯的酰氯官能团反应。这提供了结合物，其呈现阿伦膦酸盐并具有链烯烃官能团以使得 引入聚合物中，该聚合物为在图1中的pHEMA水凝胶聚合物。 为实现该目的，使得阿伦膦酸钠盐(300毫克，0. 92毫摩尔)溶解在含4-甲氧基酚 的NaOH水溶液(在7.4毫升1120中，148毫克，3.70毫摩尔)中以抑制聚合。在分步加入 新近蒸馏的甲基丙烯酰氯(120毫克，l. 15毫摩尔)和NaOH(在5.5毫升H20中，lll毫克， 2. 768毫摩尔)之前，在冰盐浴中冷却该溶液，并维持pH在11以上。在用HC1酸化至pH7 之前剧烈搅拌反应20小时。蒸发所得产物至干燥，并用氯仿提取以除去任何杂质。然后用 DMF沉淀水层以获得49%产率的阿伦膦酸盐-甲基丙烯酸酯结合物。
然后以大约50 %水30% PEG :20% HEMA的比例制备蒸馏的甲基丙烯酸2_羟乙 酯(HEMA)和PEG 20,000的水溶液。然后加入合适浓度的阿伦膦酸盐/甲基丙烯酰基结合 物，例如20mM。然后将溶液置于两个用硅橡胶垫圈分开的玻璃板之间并用氩气吹扫。
然后采用6°&)源，用Y-细胞220对模制品进行Y辐射以获得5kGY至10kGy 的总剂量。使用NIR FT-拉曼光谱表征聚合，其表明HEMA单体完全聚合为其聚合物形式 (pHEMA)，由此确保没有阿伦膦酸盐能从水凝胶中释放。通过鉴别1639cm—1处的特征C = C 峰的变化对此进行确定。
创伤敷料匪P抑制作用的表征 利用官能骨胶原降解测定法(functional collagen degrading assay)分析包含水凝胶的合成二膦酸盐抑制慢性创伤液中的MMP的能力。 如上所述，使慢性创伤液的混合样品在骨胶原类型I酶谱上运行，利用在非还原 条件下在10%总丙烯酰胺凝胶中最终浓度为0. 5毫克/毫升的骨胶原类型I。在Laemmli 条件下，在4t:进行电泳。然后在2. 5% Triton X-100中清洗凝胶30分钟，接着进一步清洗 60分钟，然后在pH7. 6的50mM Tris-HCl， CaCl2(10mM)和NaCl (50mM)中在37"C下温育24 小时。将阿伦膦酸盐官能化水凝胶(根据如上方法制得)切成小片，并包括在温育缓冲液 中，然后在37t:下温育24小时。使用两个浓度(2mM和20mM)的单体溶液中阿伦膦酸盐_甲 基丙烯酸酯的当量二膦酸盐部分以制备两个独立的水凝胶。也对2慮的阿伦膦酸盐-甲基 丙烯酸酯结合物进行酶谱分析。 当慢性创伤液中的蛋白酶在37°C /24小时温育步骤中为活性时，将它们固定在基 质凝胶中，然后暴露于抑制剂。在温育后，对凝胶适当染色，蛋白酶活性可视化为清晰(未 染色)带。 图3显示阿伦膦酸盐_甲基丙烯酸酯结合物在生理温度下能够抑制匪P超过24 小时。图3中的道l-6为六个不同患者的慢性创伤液样品(500ng蛋白质)，与图2中的样 品相同。道7-12表示在用如图1所示的2mM阿伦膦酸盐-甲基丙烯酸酯结合物温育之后 的相同样品。抑制活性与单独的阿伦膦酸盐相比处在略微降低的水平。
图4为相比于未处理对照样，用阿伦膦酸盐和阿伦膦酸盐_甲基丙烯酸盐结合物 进行抑制而获得的蛋白酶活性的相对减少的图示，因此表示了在图2和3中所示的结果。使 用光密度法定量化通过酶谱法显示的蛋白水解活性的降低，并将其图示于图4。其中显示了 阿伦膦酸盐-甲基丙烯酸酯结合物(标记为官能化的A2mM)和阿伦膦酸盐自身(标记为A 2mM)与未处理的对照样相比，骨胶原降解活性的匪P特异性抑制。如Tukey测试所确定的 统计显著性是相对于未处理的样品，并显示为#(P < 0. 01)。 图4表明，当用2mM的阿伦膦酸盐处理时，类型I骨胶原降解为在未处理对照样中 所见的10%或更少。阿伦膦酸盐-甲基丙烯酸酯结合物为在对照样中所见的30% -40%， 因此表明了骨胶原降解的非常显著水平的抑制。 包含阿伦膦酸盐-甲基丙烯酸酯结合物的水凝胶也表现出良好水平的匪P抑制。 与非水凝胶处理的对照样相比，包含20mM阿伦膦酸盐_甲基丙烯酸酯的水凝胶显示出能够 显著降低骨胶原类型I降解的能力。 图5显示了在用引入共价结合的阿伦膦酸盐的水凝胶聚合物温育前和温育后慢 性创伤液样品的骨胶原类型1酶谱法分析的结果。生成三个不同的水凝胶样品并将它们用 在该分析中。所有的水凝胶如上所述使用5. 0克H20， 2. 0克HEMA和3. 0克PEG 20， 000加 以合成。第一个样品(在图6中标记为"G")仅有不含二膦酸盐的这些组分，因此用作水凝 胶对照样。第二个(在图6中标记为"GA1X")水凝胶样品进一步包括7.68毫克阿伦膦酸 盐-甲基丙烯酸酯结合物，第三个样品(在图6中标记为"GA10X")包含76.80毫克的阿伦 膦酸盐-甲基丙烯酸酯结合物。 在图5中，道1为不含任何抑制剂的混合的慢些创伤液样品，而道2-4分别显示了 含有水凝胶G，GA1X和GA10X的相同的创伤液样品，它们被切成小片，并在37t:下温育24小 时。尽管对照样水凝胶和2慮阿伦膦酸盐-甲基丙烯酸酯结合物均降低了蛋白水解活性， 但是大部分清晰带的消失清楚地表明20mM结合物(GA10X)为最有效的样品。
图6表示了在图5所示的实验中所得蛋白酶活性的相对降低。图6的产生方式如 对图4的所述。 图6表明不含阿伦膦酸盐(样品"G")的水凝胶样品具有某种程度的抑制匪P的 能力。这是在本发明的敷料组合物中使用这种类型的聚合物的又一优点。虽然不愿受限于 任何特定的理论，但是本发明人假定这可归因于存在于HEMA单体中的三个氧原子，其可用 于与阳离子的螯合作用，这是匪P的稳定性所需的。 图6进一步显示了 2mM(GAlX)水凝胶-结合物样品表现出抑制活性，但是20mM样 品(GA10X)显示了较高水平的活性，并有效地证明了在慢性创伤的治疗中束缚于水凝胶作 为创伤敷料组合物一部分的二膦酸盐的效力。 因此，可以成功地使用本发明的包括与聚合物共价结合的二膦酸盐的敷料组合物 以抑制创伤液中的匪P。 本领域技术人员应该理解的是，本发明并不限于在文中详细描述的具体实施方
案，仍可以预期很多符合本发明的较宽精神和范围的其他具体实施方案。 在该说明书中提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献均全文引入本文中
作为参考。
1权利要求
一种敷料组合物，其包括与聚合物共价结合的二膦酸盐和/或其衍生物或其药学上可接受的盐，其中，当敷料与创伤接触时，基本上所有的二膦酸盐留在敷料中而不能进入创伤组织中。
2. 根据权利要求1所述的敷料组合物，其中，所述二膦酸盐为氨基_ 二膦酸盐。
3. 根据权利要求2所述的敷料组合物，其中所述氨基_ 二膦酸盐选自阿伦膦酸盐、氨羟 二磷酸二钠、奈立膦酸钠或伊卡膦酸盐。
4. 根据权利要求3所述的敷料组合物，其中，所述氨基_ 二膦酸盐为阿伦膦酸盐。
5. 根据权利要求1所述的敷料组合物，其中，所述聚合物为水凝胶聚合物。
6. 根据权利要求5所述的敷料组合物，其中所述水凝胶聚合物包括丙烯酸的羟烷基酯 或甲基丙烯酸的羟烷基酯。
7. 根据权利要求6所述的敷料组合物，其中，所述丙烯酸的羟烷基酯或甲基丙烯酸的 羟烷基酯为聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)。
8. 根据权利要求7所述的敷料组合物，其中所述水凝胶聚合物进一步包括聚(乙二 醇)。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的敷料组合物，其中所述二膦酸盐与共价结合至聚 合物的单体共价结合。
10. 根据权利要求9所述的敷料组合物，其中所述单体选自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、 乙烯砜或官能化的聚(乙二醇)。
11. 根据权利要求10所述的敷料组合物，其中所选单体具有选自如下的官能团羧酸、 酰卤、醛、酮、环氧化基团、磺酰或琥珀酸亚胺。
12. 根据权利要求11所述的敷料组合物，其中，所述单体为甲基丙烯酰氯。
13. —种选择性抑制需要治疗的患者的创伤液中的基质金属蛋白酶(匪P)而不抑制创 伤组织中的匪P的方法，该方法包括使创伤液与敷料组合物中与聚合物共价结合的匪P抑 制剂接触从而选择性抑制创伤液中的所述匪P而不抑制创伤组织中的所述匪P的步骤。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述匪P抑制剂为二膦酸盐和/或其衍生物或 其药学上可接受的盐。
15. 根据权利要求2至权利要求12中任一项所述的权利要求14的方法。
16. 根据权利要求13至权利要求15中任一项所述的方法，其中在创伤液中被抑制的所 述匪P为匪P-9。
17. 根据权利要求13所述的方法，其中所述患者为哺乳动物。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。
19. 一种制备敷料组合物的方法，该方法包括使得二膦酸盐与聚合物共价结合以制备 所述敷料组合物的步骤。
20. 根据权利要求2至权利要求12中任一项所述的权利要求19的方法。
21. 根据权利要求19所述的方法，其中，所述二膦酸盐通过辐射与引入聚合物中的单 体共价结合。
全文摘要
本发明提供一种敷料组合物，其包括与聚合物共价结合的二膦酸盐基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂，其中，当敷料与创伤接触时，基本上所有的二膦酸盐留在敷料中而不能进入创伤组织中。本发明还提供一种创伤的治疗方法，该方法包括使得包含共价结合的MMP抑制剂的敷料组合物与创伤液接触以选择性地抑制创伤液中的一种或多种MMP而不抑制创伤组织中的那些MMP。
文档编号A61L15/44GK101754775SQ200880019336
公开日2010年6月23日 申请日期2008年6月10日 优先权日2007年6月8日
发明者E·A·雷蒙特, T·达加维尔, Z·厄普顿 申请人:昆士兰技术大学