诱导抗高危型人乳头瘤病毒的交叉反应性中和抗体的疫苗抗原的制作方法

专利名称：：诱导抗高危型人乳头瘤病毒的交叉反应性中和抗体的疫苗抗原的制作方法
技术领域：
：本发明涉及诱导抗高危型(高U7々群)人乳头瘤病毒的交叉反应性中和抗体的疫苗抗原。特别是，本发明涉及在人乳头瘤病毒(HPV)16型Ll蛋白质的特定部位插入人乳头瘤病毒16型的特定L2表位而得到的嵌合蛋白质以及作为该嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体。本发明的病毒壳体作为抗原是有用的，所述抗原能够作为疫苗使用而用于预防作为子宫颈癌的原因的人乳头瘤病毒群感染。
背景技术：
：人乳头瘤病毒(HPV)(图1)是小型DNA病毒，存在100个以上的基因型，其中有15个基因型(高危型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73型)是子宫颈癌的原因。HPV16型在50-60%的子宫颈癌中被检出。在欧美以18型居多，而在日本以52、58型居多。有报告称尽管日本努力通过群体检测诊断来实现早期发现，但每年仍有15000人发病、2500人死亡。HPV病毒壳体为正20面体骨架上具有12分子的L2蛋白质的结构，所述正20面体骨架由72个Ll蛋白质五聚体(病毒壳粒)形成。L2蛋白质的两端位于病毒壳体内部，而其N末端侧的一部分则露出在病毒壳体表面(L2-表面区域)(图2)。如果采用重组DNA技术仅使Ll蛋白质大量表达，则会产生病毒样粒子(Virus-likeparticle；VLP)0如果将牛乳头瘤病毒、棉尾兔乳头瘤病毒的VLP或L2蛋白质接种于动物，则会对病毒侵染表现出抵抗性。而且，图2的HPV和VLP为截面示意图。尚没有可供HPV增殖的培养细胞系。为了监测HPV的感染，制作了假病毒(偽,O)。在表达SV40T抗原的人293细胞中导入具有SV40复制起点的分泌性碱性磷酸酶(SEAP)表达质粒、以及Ll和L2蛋白质表达质粒，则复制的SEAP表达质粒组入L1/L2-病毒壳体，从而形成了感染性假病毒(图3)。可以通过抑制假病毒的感染性的活性来测定中和抗体。(非专利文献1)将HPV的VLP接种于动物而得的抗血清具有基因型特异性的中和活性。Merck公司开发出了HPV16、18型VLP与作为尖锐湿疣(良性)的原因的6、11型VLP的混合疫苗，而GlaxoSmithKline公司开发出了HPV16、18型VLP的混合疫苗。(非专利文献2、非专利文献3)这些疫苗在大规模临床实验中显示出基因型特异性的感染预防效果，Merck公司的疫苗于2006年取得了FDA和欧洲委员会的认证并上市销售。如上述，如果用HPV的Ll-病毒壳体免疫动物，则会诱导出极其基因型特异性的免疫应答。使用16型Ll-病毒壳体疫苗进行的临床实验的中间成绩显示对16型的感染的预防有效性，但也显示对于其它基因型基本上没有预防效果。因此，为了用疫苗阻止子宫颈癌的发病，至少必须开发出能够抗所有高危型的疫苗抗原。目前为止，本发明人等已经开发出了利用存在于HPV16型L2蛋白质的氨基酸108-120区域的高危型共有中和表位的疫苗抗原。但是，该表位的氨基酸序列在高危型L2蛋白质间显示约6075%左右的同源性，诱导出的抗体虽然能与多种高危型HPV相结合，但与HPV16型相比结合能力低下。因此，希望有基因型共有性更高的抗原。本发明人等发现通过将HPV16型L2蛋白质的氨基酸64-81区域附加在HPV16L1蛋白质上而得到嵌合蛋白质，能够制作诱导更强力的基因型共有中和抗体的疫苗抗原，该疫苗抗原是至少能够抗所有高危型的抗原，而且是基因型共有性更高的抗原，并申请了在先专利(W02007/018049，专利文献1)。而且，在专利文献1中，如上述，考虑到在HPV16L1蛋白质中插入HPV16型L2蛋白质的氨基酸108-120区域而得到嵌合蛋白质，基于该嵌合蛋白质的粒子具有强免疫原性和高危HPV群共有的中和抗体诱导能力，还提供在上述附加了氨基酸64-81区域的嵌合蛋白质的基础上插入HPV16型L2蛋白质的氨基酸109-117区域而得到的嵌合蛋白质。非专利文献1=Pastrana,D.V.，Buck,C.B.，Pang,Y.Y.，Thompson,C.D.，Castle,P.Ε.,FitzGerald,D.C.,Kruger,Kjaer,S.,Lowy,D.R.,Schiller,J.Τ.,2004.Reactivityofhumanserainasensitive,high-throughputpseudovirus-basedpapi1lomavirusneutralizationassayforHPV16andHPV18.Virology.321:205_216.#专禾IjJC^2:Villa,L.L.,etal.prophylacticquadrivalenthumanpapi11omaνirustypes6,11,16,and18)Llvirus-likeparticlevaccineinyoungwomen-.arandomiseddouble-blindplacebo-controlledmulticentrephaseIIefficacytrial.Lancet0ncology6,271-278,2005__专禾[!文3:Harper，D.Μ.,etal.:Sustainedefficacyupto4.5yearsofabivalentLlvirus-likeparticlevaccineagainsthumanpapillomavirustype16andl8:followupfromarandomizedcontroltrial.Lancet367(9518),1247-1255.专利文献1:W02007/018049上述非专利文献13和专利文献1的全部记载在此引用作为本申请特别公开的内容。在15个高危HPV群中，现在销售的HPV疫苗仅对16型和18型有效。因为VLP诱导基因型特异性的中和抗体，为了针对全部高危HPV群，必须使用15种VLP的鸡尾酒，以此作为实用性疫苗抗原是困难的。因此，希望开发诱导交叉反应性中和抗体的疫苗抗原。专利文献1记载的抗原是至少能够抗全部高危型的抗原，而且是基因型共有性更高的抗原。但是，其存在以下问题。专利文献1的研究中使用的感染性假病毒仅为16、18型，相对于这些感染性假病毒，专利文献1记载的抗原显示了良好的中和活性。但是，随后，在针对本发明人等新开发的31、52、58型的感染性假病毒进行的中和实验中，可以判明上述专利文献1记载的抗原抗31、52和58型的中和活性并不是很高。因而，本发明的目的是提供能够诱导抗高危型人乳头瘤病毒的交叉反应性中和抗体的疫苗抗原。
发明内容本发明的第1方面为一种病毒壳体，该病毒壳体是在人乳头瘤病毒(HPV)16型Ll蛋白质的环部位插入1个人乳头瘤病毒16型的L2表位而得到的嵌合蛋白质的聚集体；其中，所述L2表位插入的环部位是氨基酸430与433之间，所述L2表位具有LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下称为18-38L2表位)、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下称为56-75L2表位)或DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下称为96-115L2表位)所表示的氨基酸序列。在上述本发明的上述病毒壳体方面，可以列举出以下的具体实施方式。1)所述L2表位由在所述的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生缺失、取代或增加而得到的氨基酸构成，且由对所述病毒壳体赋予与具有原来的L2表位的HPV的交叉反应性相同的交叉反应性的氨基酸。2)所述聚集体是多个五聚体病毒壳粒的聚集体，所述五聚体病毒壳粒由五个嵌合蛋白质聚集而成。3)所述多个五聚体病毒壳粒的聚集体具有粒子结构。4)构成所述聚集体的五聚体病毒壳粒的个数为6580个的范围。5)构成所述聚集体的五聚体病毒壳粒的个数为72个。6)所述病毒壳体为用于Ll-病毒壳体疫苗的生产的病毒壳体。本发明的第2方面为含有2种以上的上述本发明的病毒壳体的病毒壳体混合物。在上述本发明的上述病毒壳体混合物方面，可以列举出以下的具体实施方式。1)下述两种病毒壳体的混合物插入有18-38L2表位的嵌合蛋白质的聚集体与插入有56-75L2表位的嵌合蛋白质的聚集体。2)下述两种病毒壳体的混合物插入有18-38L2表位的嵌合蛋白质的聚集体与插入有96-115L2表位的嵌合蛋白质的聚集体。3)下述两种病毒壳体的混合物插入有56-75L2表位的嵌合蛋白质的聚集体与插入有96-115L2表位的嵌合蛋白质的聚集体。4)下述三种病毒壳体的混合物插入有18-38L2表位的嵌合蛋白质的聚集体、插入有56-75L2表位的嵌合蛋白质的聚集体和插入有96-115L2表位的嵌合蛋白质的聚集体。5)上述病毒壳体混合物是用于Ll-病毒壳体疫苗的生产的病毒壳体混合物。6)上述病毒壳体混合物是用于能够诱导至少抗16型、18型、31型、52型和58型的人乳头瘤病毒的中和抗体的Ll-病毒壳体疫苗的生产的病毒壳体混合物。本发明的第3方面是一种嵌合蛋白质，该嵌合蛋白质是在人乳头瘤病毒(HPV)16型Ll蛋白质的环部位插入1个人乳头瘤病毒16型的L2表位而得到的；其中，所述L2表位插入的环部位为氨基酸430与433之间，所述L2表位具有LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下称为18-38L2表位)、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下称为56-75L2表位)或DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下称为96-115L2表位)所表示的氨基酸序列。在上述本发明的上述嵌合蛋白质方面，作为具体实施方式，可以列举出下述实施方式所述L2表位由在所述的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生缺失、取代或增加而得到的氨基酸构成，且由对由所述嵌合蛋白质构成的病毒壳体赋予与具有L2表位的HPV的交叉反应性相同的交叉反应性的氨基酸构成。本发明的第4方面是上述本发明的病毒壳体的生产方法，该方法包括通过使上述本发明的嵌合蛋白质聚集来形成病毒壳体。本发明的第5方面是上述本发明的病毒壳体混合物的生产方法，该方法包括采用上述本发明的病毒壳体的生产方法所述的方法生产2种以上的病毒壳体，并将生产得到的病毒壳体混合起来。本发明的第6方面为匙孔血蓝蛋白与人乳头瘤病毒16型的L2表位的复合体；其中，所述L2表位具有LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下称为18-38L2表位)、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下称为56-75L2表位)或DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下称为96-115L2表位)所表示的氨基酸序列。在上述本发明的上述复合体方面，作为具体实施方式，可以列举出下述实施方式，所述匙孔血蓝蛋白与所述L2表位通过半胱氨酸相结合。通过本发明，能够提供Ll-病毒壳体疫苗抗原，所述Ll-病毒壳体疫苗抗原的粒子结构具有强免疫诱导活性，并且能够强力地抗原呈递HPV的L2-表位，特别是其能够诱导抗16型、18型、31型、52型和58型的人乳头瘤病毒的中和抗体。而且，从前述15种高危型人乳头瘤病毒的L2氨基酸序列的同源性来推测，可以十分强烈地推定本发明的能够诱导抗16型、18型、31型、52型和58型的人乳头瘤病毒的中和抗体的Ll-病毒壳体疫苗抗原是与上述15种高危型基本上对应的抗原。VLP疫苗已经实用化，并展现出基因型特异性感染预防效果。本发明人等开发的嵌合VLP是在现有疫苗抗原的基础上增加交叉反应性L2-表位而得到的抗原，其中保留了现有疫苗的中和表位，因而，其能够诱导抗16型的基因型特异性中和抗体，也能够诱导抗18型、31型、52型和58型的交叉反应性中和抗体。VLP由360个分子的Ll蛋白质形成，因此，嵌合VLP具有360个交叉反应性L2-表位。嵌合VLP是粒子结构具有强免疫诱导活性、同时强力呈递交叉反应性L2-表位的新疫苗抗原。[图1]人乳头瘤病毒(HPV)的说明图。基因组环状双链DNA，粒子正二十面体(55nm)，各种哺乳动物固有的乳头瘤病毒(Papillomavirus)持续感染，HPV有约100个以上的基因型，其中15个基因型(高危型)的感染是子宫颈癌发病的原因。[图2]病毒样粒子(Virus-likeparticle；VLP)的说明图。没有可供HPV增殖的实用化培养细胞系。如果用重组杆状病毒等表达Ll蛋白质，则在核内发生聚集而形成VLP。第一代疫苗以16型、18型VLP作为抗原。VLP的抗原性的基因型特异性高。[图3]感染性假病毒形成的说明图。[图4]L2_表面区域的说明图。致癌性HPV的L2表面区域的氨基酸序列的同源性高，在HPV感染中起到不可或缺的作用。[图5]HPV16L2_表面区域的氨基酸序列。[图6]将交叉反应性表位插入Ll蛋白质而制作的嵌合VLP的说明图。嵌合VLP具有360个交叉反应性L2表位。VLP的抗原性、安全性已经得到证实。[图7]嵌合VLP、Chl8/38、Ch56/75、Ch96/115(101L、112S)的说明图(氨基酸序列)与粒子的照片。16L1WT-VLP为非嵌合VLP粒子的照片。发明的具体实施例方式(Li-病毒壳体)本发明的Ll-病毒壳体是这样的病毒壳体其是在人乳头瘤病毒(HPV)16型Ll蛋白质的环部位插入1个人乳头瘤病毒16型的L2表位而得的嵌合蛋白质的聚集体。如前述，HPV粒子中，72个由5个分子的Ll蛋白质聚集而成的病毒壳粒聚集在一起，形成正20面体的病毒壳体。如果使Ll蛋白质在细胞中高表达，则Ll蛋白质集中在核内，并自主性地形成病毒壳体。仅由Ll蛋白质形成的病毒壳体称为Ll-病毒壳体或病毒样粒子(virus-likeparticle:VLP)。如果使Ll蛋白质和L2蛋白质同时表达，则12个分子的L2蛋白质会组入Ll-病毒壳体，从而形成L1/L2-病毒壳体(或L1/L2-VLP)。但，Ll-病毒壳体与L1/L2-病毒壳体无法用电子显微镜辨别。本发明的Ll-病毒壳体是以HPV16型的Ll-病毒壳体为基础的病毒壳体。HPV的基因型多，因而，通常以HPV16、HPV58等表示方式将其基因型一并表示出来。这里，例如将HPV16型的Ll-病毒壳体表述为16L1-病毒壳体。本发明的Ll-病毒壳体是在HPV16型Ll蛋白质中插入HPV16型的L2表位而得的嵌合蛋白质的聚集体。以下，嵌合蛋白质是指“在人乳头瘤病毒(HPV)16型Ll蛋白质的环部位插入1个人乳头瘤病毒16型的L2表位而得的嵌合蛋白质”，本发明也包括该嵌合蛋白质。为了制作本发明的嵌合蛋白质而插入Ll蛋白质的人乳头瘤病毒16型的L2表位具有LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(18-38L2表位)、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(56-75L2表位)或DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(96-115L2表位)所表示的氨基酸序列。18-38L2表位由HPV16型的L2蛋白质的氨基酸18-38区域的21个氨基酸构成。56-75L2表位由HPV16型的L2蛋白质的氨基酸56-75区域的20个氨基酸构成。96-115L2表位由HPV16型的L2蛋白质的氨基酸96-115区域的20个氨基酸(但，将第101位取代成亮氨酸，将第112位取代成丝氨酸)构成。而且，在本发明中，从蛋白质的氨基末端起依次对氨基酸残基进行编号，例如第50位的氨基酸记作氨基酸50。L2-表面区域与许多细胞蛋白质结合。如果导入氨基酸取代突变，则感染性消失，这表明L2-表面区域在HPV的感染中担负着不可或缺的功能(图4)。该区域的氨基酸序列在所有高危型HPV的L2蛋白质中极为保守(图5)。本发明人等研究了用具有HPV16SL2-表面区域的氨基酸序列的合成肽免疫兔而得到的抗血清。结果如实施例所示(表1)。从表1的结果中发现氨基酸18-38、49-75、96-115区域中存在交叉反应性表位。S卩，由表1所示的结果可知在氨基酸18-38、56-75、96_115区域中存在抗16型、18型、31型和58型的交叉反应性表位。但，关于抗52型的交叉反应性，现阶段尚未进行研允。对于96-115区域，将第101位的S替换为L，并将第112位的T替换为S。这是因为，与天然型的96-115区域相比，将第101位的S替换成L、并将第112位的T替换成S后的96-115区域具有更良好的交叉反应性。而且，表1的结果显示49_68区域中也存在针对16型、18型、31型和58型的交叉反应性表位。但是，虽然制作了插入包含49-68区域的49-75区域的嵌合蛋白质，但却未获得粒子结构，而且，如图5所示，49-55区域在15种HPV中L2氨基酸的同源性并不怎么高，因而，将49-68区域排除在本发明的对象之外。因此，将上述交叉反应性表位插入到Ll蛋白质的氨基酸430与433之间，制作了嵌合蛋白质，并进一步制作了嵌合VLP。S卩，本发明涉及在人乳头瘤病毒(HPV)16型Ll蛋白质的环部位的氨基酸430与433之间插入1个人乳头瘤病毒16型的L2表位而得到的嵌合蛋白质，其中，所述L2表位具有LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下称为18-38L2表位)、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下称为56-75L2表位)或DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下称为96-115L2表位)所表示的氨基酸序列。而且，本发明涉及作为上述嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体。该聚集体是多个五聚体病毒壳粒的聚集体，所述五聚体病毒壳粒是五个嵌合蛋白质聚集而成的，而且，多个五聚体病毒壳粒的聚集体具有粒子结构对于发挥抗原性而言是适宜的。构成所述聚集体的五聚体病毒壳粒的个数是例如6580个的范围，优选为与天然型相同的72个。天然型VLP通常由360个分子的Ll蛋白质形成，这种情况下，每个粒子具有360个交叉反应性表位(图6)。使用重组杆状病毒在昆虫sf9细胞中表达将HPV16L2蛋白质的氨基酸1838、5675、96115(第101位取代成亮氨酸、第112位取代成丝氨酸)的序列插入HPV16L1蛋白质的氨基酸430433之间而得到嵌合蛋白质，来制作嵌合VLP，其分别命名为Chl8/38、Ch56/75、Ch96/115(101L、112S)(图7)。图7的电子显微镜照片显示各嵌合VLP形成了粒子。在以这些嵌合VLP作为抗原的ELISA中显示针对插入表位的抗体特异地结合(后述实施例中的表2)、表位被呈递到VLP表面。用这些嵌合VLP免疫兔，得到了抗血清。在以具有与交叉反应性表位相同的序列的合成肽作为抗原的ELISA中显示各抗血清与插入表位特异地反应。96/115(101L，112S)的肽容易凝集，结合到ELISA平板的量少，因而显示低效价(后述实施例中的表3)。对朋￥16、18、31、52、58型假病毒的中和活性进行考察，结果抗0118/38的抗体中和了16、18、31型，抗Ch56/75的抗体中和了全部类型，抗Ch96/115(101L、112S)的抗体中和了16、18、31、58型(效价低的抗血清未见中和58型)(后述实施例中的表4、5)。全部抗血清均针对以嵌合VLP作为骨架的HPV16型强烈反应，这表明VLP所具有的中和表位在嵌合VLP中得以保存。感染性假病毒由360个分子的Ll蛋白质和12个分子的L2蛋白质构成，因而，样品中过量合成的L2蛋白质以游离状态存在。因此，显示低的抗L2抗体的中和效价。在动物乳头瘤病毒的实验中，VLP疫苗与L2蛋白质疫苗的效果为同等程度，这显示本发明的嵌合VLP能够成为诱导抗交叉反应性表位的抗体的实用性疫苗抗原。所述L2表位还可以由下述氨基酸序列构成，所述氨基酸序列是在前面所述的氨基酸序列即SEQIDNO:24中任一项所述的氨基酸序列中1或数个氨基酸发生缺失、取代或增加而得到的、且能够对本发明的病毒壳体赋予与具有原来的L2表位(具有SEQIDNO:24中任一项所述的氨基酸序列)的VLP的交叉反应性相同的交叉反应性的氨基酸序列。即，18-38L2表位还包括具有下述氨基酸序列的L2表位的突变体，所述氨基酸序列由在LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(SEQIDNO2)所表示的氨基酸序列中1或数个氨基酸发生缺失、取代或增加而得的氨基酸构成，且能够对本发明的病毒壳体赋予与具有18-38L2表位的HPV16型的VLP的交叉反应性相同的交叉反应性。具有18-38L2表位的HPV16型的VLP的交叉反应性如表4所示。56-75L2表位还包括具有下述氨基酸序列的L2表位的突变体，所述氨基酸序列由在GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(SEQIDNO:3)所表示的氨基酸序列中1或数个氨基酸发生缺失、取代或增加而得到的氨基酸构成，且能够对本发明的病毒壳体赋予与具有56-75L2表位的HPV16型的VLP的交叉反应性相同的交叉反应性。具有56-75L2表位的HPV16型的VLP的交叉反应性如表4所示。类似地，96-115L2表位还包括具有下述氨基酸序列的L2表位的突变体，所述氨基酸序列由在DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(SEQIDNO:4)所表示的氨基酸序列中1或数个氨基酸发生缺失、取代或增加而得到的氨基酸构成，且能够对本发明的病毒壳体赋予与具有96-115L2表位的HPV16型的VLP的交叉反应性相同的交叉反应性。具有96-115L2表位的HPV16型的VLP的交叉反应性如表4所示。而且，在本说明书中，氨基酸的缺失、取代或增加中的数个氨基酸是指2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在本发明的嵌合蛋白质中，插入L2表位的Ll蛋白质是Ll蛋白质的环部位即氨基酸430与433之间。S卩，插入上述2021个氨基酸的L2表位来替代Ll蛋白质的氨基酸430433这4个氨基酸。HPV16型Ll蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0:1所示。从HPV16L1蛋白质的结构解析、中和抗体表位的分布以及病毒壳体形成所必需的半胱氨酸残基的位置等观点来看，可以推定包含氨基酸430433的426-446区域，是Ll蛋白质的外侧，并且是能够作为抗原被识别的区域之一。插入Ll蛋白质的L2表位在1分子的Ll蛋白质中有1个。但，也可以将种类不同的至少2种L2表位插入到1个Ll蛋白质的不同环部位。例如，也可以将上述3个交叉反应性表位以外的肽插入到Ll蛋白质的氨基酸430433以外的部位。或者，也可以将上述3个交叉反应性表位中的任一个插入到Ll蛋白质的氨基酸430433以外的部位。(含L2表位的制作)L2肽(氨基酸18-38、56-75或96-115)的制作可以通过常规方法，采用96柱自动肽合成装置上的Fmoc固相法来进行合成。而且，该肽因为是用于抗体制作目的，所以连接有KLH(匙孔血蓝蛋白)，为了防止该KLH掩蔽肽区域，在N末端增加了半胱氨酸残基。本发明包含匙孔血蓝蛋白与人乳头瘤病毒16型的L2表位的复合体。所述L2表位具有LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(18-38L2表位)、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(56-75L2表位)或DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(96-115L2表位)所表示的氨基酸序列。匙孔血蓝蛋白与L2表位优选通过半胱氨酸结合在一起。(插入L2表位的Ll蛋白质(嵌合蛋白质)的制作)制作嵌合Ll基因，并利用杆状病毒载体表达制作的嵌合Ll基因，从而制作了嵌合Ll蛋白质、嵌合病毒壳体。嵌合Ll基因的制作是通过PCR进行的。具体如下。(A)制作带有希望插入的部分的引物对。(B)将带有插入部分的引物中的一个与引物1或引物2组合来进行PCR。(C)合成了2个一侧带有插入片段的DNA。使各互补部分退火，进行延伸反应。(D)制作带有插入DNA的嵌合基因。(E)以该DNA为模板使用引物1和引物2进行PCR。(F)从而能够扩增带有插入基因的DNA。本发明包括病毒壳体的生产方法，该病毒壳体的生产方法包括通过使本发明的嵌合蛋白质聚集来形成病毒壳体。如上述，制作嵌合Ll基因，并利用杆状病毒载体表达该基因，从而制作嵌合Ll蛋白质。这样，嵌合Ll蛋白质被制造出来后，其会自主地形成嵌合病毒壳体(本发明的病毒壳体)。利用杆状病毒载体进行的表达可以通过常规方法进行，但从促进嵌合病毒壳体的自主性形成的观点来看，优选对条件进行设定。本发明的病毒壳体用于Ll-病毒壳体疫苗的生产。Ll-病毒壳体疫苗的生产可以使用例如杆状病毒表达系统。本发明包括含有2种以上的上述本发明的病毒壳体的病毒壳体混合物。本发明的3种病毒壳体各自具有的交叉反应性不同，通过将这些交叉反应性不同的病毒壳体2种以上混合使用，优点是能够得到更高的中和活性。本发明的病毒壳体混合物例如可以是作为插入了18-38L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体、与作为插入了56-75L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体的混合物。混合物中，这2种病毒壳体的质量比在例如11001001的范围。但，2种病毒壳体的混合比不限于在上述范围内，可以在考虑免疫原性、中和活性的基础上，适宜地确定。本发明的病毒壳体混合物例如可以是作为插入了18-38L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体、与作为插入了96-115L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体的混合物。混合物中，这2种病毒壳体的质量比在例如11001001的范围。但，2种病毒壳体的混合比不限于在上述范围内，可以在考虑免疫原性、中和活性的基础上，适宜地确定。本发明的病毒壳体混合物例如可以是作为插入了56-75L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体、与作为插入了96-115L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体的混合物。混合物中，这2种病毒壳体的质量比在例如11001001的范围。但，2种病毒壳体的混合比不限于在上述范围内，可以在考虑免疫原性、中和活性的基础上，适宜地确定。本发明的病毒壳体混合物例如可以是作为插入了18-38L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体、作为插入了56-75L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体、与作为插入了96-115L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体的混合物。对这3种病毒壳体而言，它们中每2种病毒壳体的质量比可以在例如11001001的范围。但，3种病毒壳体的混合比不限于在上述范围内，可以在考虑免疫原性、中和活性的基础上，适宜地确定。本发明的病毒壳体混合物还可用于Ll-病毒壳体疫苗的生产。使用病毒壳体混合物的疫苗的生产方法与上述相同。本发明的病毒壳体混合物可以用于能够诱导抗16型、18型、31型、52型和58型人乳头瘤病毒的中和抗体的Ll-病毒壳体疫苗的生产。实施例以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。例1兔肽抗血清的制作对2只日本白兔(2.5kg3.Okg)进行了免疫。所使用的抗原是化学合成的肽与KLH(keyholelimpethemocyanin)相结合而得到的。首次致敏是将0.5mg抗原与弗氏完全佐剂一起皮下施用。首次施用2周后将0.25mg抗原与弗氏完全佐剂一起皮下施用。而且，在2周后、4周后、6周后同样(0.25mg)地进行致敏，共计进行5次致敏。在末次致敏1周后，采集全血，得到了血清。(委托株式会社Scrum完成)采用以下所示的中和实验，考察了用具有HPV16型L2-表面区域的氨基酸序列的合成肽免疫兔而得到的抗血清。结果如表1所示。由表1所示的结果可知氨基酸18-38、49-75,96-115区域中存在交叉反应性表位。中和实验1.中和实验前一天，在96孔细胞培养用平板中播种10000个/孔的293FT细胞(购自Invitrogen公司)。2.用NeautralizationBuffer(在除去酚红的DMEM培养基中添加10%FCSU%非必需氨基酸、L-谷氨酸、IOmMHEPES而得到)稀释血清，并与感染性假病毒相混合，4V反应1小时，再将其添加于前一天播种的293FT细胞。3.培养约72小时后，回收上清20μ1，采用Roden等的方法(参照http://home.ccr.cancer.gov/lco/ColorimetricSEAP.htm)测定了碱性磷酸酶活性。[表1]抗L2肽抗体的中和活性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>例2病毒壳体杭原的制作方法用重组杆状病毒系统表达了16L1、16L1/L2基因。使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(GIBCO-BRLInc.、NewYork,NY)制作重组病毒，并在sf9细胞(草地贪夜蛾来源细胞)中进行了表达。将16L1基因克隆在pFastbacl载体上，从而得到了pFSatbacl/16Ll。将16L1/L2克隆在pFastbac二元载体上，从而得到了pFastbacdual/16Ll/L2。然后，将分别克隆的pFastbac载体导入DH10BAC大肠杆菌(包含杆状病毒DNA和辅助质粒的最大效率感受态细胞(MaxEfficiencycompetentcellcontainingbaculovirusDNAandhelperplasmid)，GIBCOBRL)，从而制作了杆粒(Bacmid)。使用EffecteneTransfectionReagent(QIAGENGmbH,Hilden,Germany)将杆粒DNA导入sf_9细胞，从而得到了表达病毒壳体蛋白质的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染sf-9细胞，并在72小时后回收细胞。将感染细胞悬浮于0.5%NP40溶液，室温放置10分钟后，通过离心(9000rpm、15分钟、4°C)将其分成核级分(沉淀)和细胞质级分。将核级分悬浮于1.28g/ml的氯化铯-PBS溶液，超声波(Sonifier250,Branson)破碎后，用SW50.1转子(BeckmanCoulterInc.,FulIeron,CA)进行超离心(34000rpm、20小时、20°C)。回收氯化铯梯度中聚集在比重1.28g/ml附近的蛋白质，用0.5MNaCl-PBS进行透析，得到了病毒壳体蛋白质溶液。通过上述病毒壳体抗原的制作方法，使用重组杆状病毒在昆虫sf9细胞中表达将HPV16L2蛋白质的氨基酸1838、5675、96115(第101位取代成亮氨酸，第112位取代成丝氨酸)的序列插入HPV16L1蛋白质的氨基酸430433间而得的嵌合蛋白质，制作了嵌合￥1^，分别命名为0118/38、0156/75、0196/115(10仏、1125)。图7的电子显微镜照片显示各嵌合VLP形成了粒子。在以这些嵌合VLP作为抗原的ELISA中显示针对插入表位的抗体特异性地结合，表位被呈递在VLP表面。病毒壳体ELISA测定方法1.添加1μg/ΙΟΟμ1/孔的各病毒壳体抗原，4°C静置一夜。2.除去抗原液后，加入封闭液(含5%脱脂乳的PBS)350μ1，37°C静置2小时。3.除去封闭液后，用清洗液(含0.05%Teen20/0.05%NP40的PBS)清洗3次。4.用封闭液将抗血清稀释500倍，在各孔中加入50μ1稀释后的抗血清，室温静置1小时。5.除去血清样品后，清洗9次，在各孔中加入HRP结合抗兔IgG抗体的2000倍稀释物50μ1。室温静置30分钟，除去液体后用清洗液清洗6次。6.添加底物液(邻苯二胺24mg溶于柠檬酸-磷酸缓冲液(pH5.0)12ml，再加入H2O2L2μ1)50μ1，生色15分钟后用Immunoreader(免疫读取器)测定450nm的波长。通过病毒壳体抗原的制作方法(例2)，利用重组杆状病毒在昆虫sf9细胞中表达将HPV16L2蛋白质的氨基酸1838、5675、96115(第101位取代成亮氨酸，第112位取代成丝氨酸)的序列插入HPV16L1蛋白质的氨基酸430433间而得的嵌合蛋白质，制作了嵌合VLP，分别命名为Chl8/38、Ch56/75、Ch96/115(101L、112S)。图7的电子显微镜照片显示各嵌合VLP形成了粒子。在以这些嵌合VLP作为抗原的ELISA中显示针对插入表位的抗体特异性地结合，表位被呈递在VLP表面。结果如表2所示。［０１６６］<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>而且，用上述嵌合VLP免疫兔，得到了抗血清。抗血清的制备与例1的方法相同(但，嵌合病毒壳体的1次施用量为50μg，使用TiterMax(美国TiterMax公司制造)作为佐剂)。在以与交叉反应性表位具有相同序列的合成肽作为抗原的ELISA中，各抗血清与插入表位特异性地反应。结果如表3所示。而且，96/115(101L，112S)的肽容易凝集，在ELISA平板上的结合量少，因而与其它2个的结果相比，显示低效价。[表3]抗嵌合VLP抗体(血清)与L2肽的结合<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(ELISA中的吸光度，其中，各肽抗原用血清1500稀释，HPV16LlVLP用血清12000稀释)*显示第二次测定结果。括号内为第一次测定结果。例3感染件假病毒的制作1.对于293TT细胞，使用HPV16L1蛋白质表达质粒、HPV16L2蛋白质表达质粒、分泌型碱性磷酸酶表达质粒通过FugeneHD进行了转染。转染72小时后，回收了细胞。2.将回收的细胞悬浮于洗涤剂缓冲液(Detergentbuffer)(含0·5%Briji58,0.5%Benzonase,1%ATP依赖性质粒安全外切核酸酶C(1%ATPdependentplasmidsafeexonucleaseC)的D-PBS(CaCl2ImM,MgCl2IOmM))中，37°C静置一夜。3.然后，4°C、静置10分钟后，添加5MNaCl使得NaCl终浓度为850mM。4.1500g离心10分钟，回收上清。5.将回收的上清加载在27%，33%，39%的optipr印(AXIS-SHIELDPoCAS制造)溶液(用PBS稀释)之上，50000rpm、16°C超离心3小时。6.超离心后，从底面对级分进行回收，一次回收约300μ1，将效价最高的级分作为感染性假病毒级分用于感染实验。中和实验1.中和实验前一天，在96孔细胞培养用平板上播种10000个/孔的293FT细胞(购自Invitrogen公司)。2.用NeautralizationBuffer(在除去酚红的DMEM培养基中添加10%FCSU%非必需氨基酸、L-谷氨酸、IOmMHEPES而得)稀释血清，并与感染性假病毒混合，4°C反应1小时，将其添加于前一天播种的293FT细胞。3.培养约72小时后，回收上清20μ1，采用Roden等的方法(参照http://h0me.ccr.cancer.gov/lco/ColorimetricSEAP.htm)测定了碱性磷酸酶活性。采用上述方法，考察了亚￥16、18、31、35、52、58型假病毒的中和活性。结果如表4所示。抗Chl8/38的抗体中和了16、18、31型。抗Ch56/75的抗体中和了全部的6个类型。抗Ch96/115(101L、112S)的抗体中和了16、18、31、58型(未见效价低的抗血清对58型的中和)。作为比较的抗HPV16VLP中和了16、31、35型。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>而且，考察了上述抗体的混合体系(质量比11)的HPV16、18、31、52、58型假病毒的中和活性。结果如表5所示。抗Chl8/38的抗体与抗Ch56/75的抗体的混合体系，以及抗Ch56/75的抗体与抗Ch96/115(101L、112S)的抗体的混合体系，中和了全部的5个类型。抗Chl8/38的抗体与抗Ch96/115(101L、112S)的抗体的混合体系中和了HPV16、18、31、58型的假病毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在实施说明书实施例的各实验时，可以参考下述文献。下述文献的所有记载在此引用作为公开的内容。引用文献DMatsumoto.K,etal.Antibodiestohumanpapillomavirus16，18，58，and6bmajorcapsidproteinsamongJapanesefemales.Jpn.J.CancerRes.,88,369-375,1997.2)XiaojiangS.Chen,etal.Structureofsmallvirus-likeparticlesassembledfromtheLlproteinofhumanpapillomavirus16.Mol.Cell.,5,557-567，2000.3)Jean-RemySadeyen,etal.insertionofaforeignsequenceoncapsidsurfaceloopsofhumanpapillomavirustype16virus-likeparticlesreducestheircapacitytoinduceneutralizingantibodiesanddelineatesaconformationalneutralizingepitope.Virology.，309，32—40，2003.4)Ishii.Y,etal，！Mutationalanalysisofhumanpapillomavirustype16majorcapsidproteinLl:thecysteinesaffectingtheintermolecularbondingandstructureofLl-capsids.Virology.,308,128-136,2003工业实用性本发明的病毒壳体是在HPV16型VLP中增加L2的基因型共有表位而得的抗原。在保持现有疫苗的抗原性的基础上，每个粒子还包含了360个新表位。经过与抗L2抗体的感染防御活性相关的实证实验，则可以作为能够预防全部致癌性HPV的感染的疫苗抗原使用。高危HPV群的感染是以子宫颈癌为中心的11%的世界女性恶性肿瘤(45万人)的原因，本发明的病毒壳体成为预防高危HPV群的感染的第二代HPV疫苗抗原。权利要求一种病毒壳体，该病毒壳体是在人乳头瘤病毒(HPV)16型L1蛋白质的环部位插入1个人乳头瘤病毒16型的L2表位而得到的嵌合蛋白质的聚集体；其中，所述L2表位所插入的环部位是氨基酸430与433之间，所述L2表位具有LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下称为18-38L2表位)GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下称为56-75L2表位)或DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下称为96-115L2表位)所表示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的病毒壳体，其中，所述L2表位由在所述的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生缺失、取代或增加而得到的氨基酸构成，且由对所述病毒壳体赋予与具有原来的L2表位的HPV的交叉反应性相同的交叉反应性的氨基酸构成。3.根据权利要求1或2所述的病毒壳体，其中，所述聚集体是多个五聚体病毒壳粒的聚集体，所述五聚体病毒壳粒由五个嵌合蛋白质聚集而成。4.根据权利要求3所述的病毒壳体，其中所述多个五聚体病毒壳粒的聚集体具有粒子结构。5.根据权利要求4所述的病毒壳体，其中，构成所述聚集体的五聚体病毒壳粒的个数为6580个的范围。6.根据权利要求4所述的病毒壳体，其中，构成所述聚集体的五聚体病毒壳粒的个数为72个。7.权利要求16中任一项所述的病毒壳体，其用于L1-病毒壳体疫苗的生产。8.病毒壳体混合物，其含有2种以上的权利要求16中任一项所述的病毒壳体。9.根据权利要求8所述的病毒壳体混合物，其是作为插入有18-38L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体、与作为插入有56-75L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体的混合物。10.根据权利要求8所述的病毒壳体混合物，其是作为插入有18-38L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体、与作为插入有96-115L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体的混合物。11.根据权利要求8所述的病毒壳体混合物，其是作为插入有56-75L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体、与作为插入有96-115L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体的混合物。12.根据权利要求8所述的病毒壳体混合物，其是作为插入有18-38L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体、作为插入有56-75L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体、以及作为插入有96-115L2表位的嵌合蛋白质的聚集体的病毒壳体的混合物。13.根据权利要求812中任一项所述的病毒壳体混合物，其用于L1-病毒壳体疫苗的生产。14.根据权利要求812中任一项所述的病毒壳体混合物，其用于L1-病毒壳体疫苗的生产，所述L1-病毒壳体疫苗能够诱导至少抗16型、18型、31型、52型和58型人乳头瘤病毒的中和抗体。15.一种嵌合蛋白质，该嵌合蛋白质是在人乳头瘤病毒(HPV)16型L1蛋白质的环部位插入一个人乳头瘤病毒16型的L2表位而得到的；其中，所述L2表位所插入的环部位是氨基酸430与433之间，所述L2表位具有LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下称为18-38L2表位)、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下称为56-75L2表位)或DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下称为96-115L2表位)所表示的氨基酸序列。16.根据权利要求15所述的嵌合蛋白质，其中，所述L2表位由在所述的氨基酸序列中1个或数个氨基酸发生缺失、取代或增加而得到的氨基酸构成，且由对由所述嵌合蛋白质构成的病毒壳体赋予与具有L2表位的HPV的交叉反应性相同的交叉反应性的氨基酸构成。17.权利要求16中任一项所述的病毒壳体的生产方法，该方法包括通过使权利要求15或16所述的嵌合蛋白质聚集来形成病毒壳体。18.权利要求814中任一项所述的病毒壳体混合物的生产方法，该方法包括采用权利要求17所述的方法生产2种以上的病毒壳体，并将生产得到的病毒壳体混合。19.匙孔血蓝蛋白与人乳头瘤病毒16型的L2表位的复合体，所述L2表位具有LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下称为18-38L2表位)、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下称为56-75L2表位)或DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下称为96-115L2表位)所表示的氨基酸序列。20.根据权利要求19所述的复合体，其中，所述匙孔血蓝蛋白与所述L2表位通过半胱氨酸结合。全文摘要本发明提供能够诱导抗高危型人乳头瘤病毒的交叉反应性中和抗体的疫苗抗原。一种病毒壳体，该病毒壳体是在人乳头瘤病毒(HPV)16型L1蛋白质的环部位插入1个人乳头瘤病毒16型的L2表位而得到的嵌合蛋白质的聚集体。插入L2表位的环部位是氨基酸430与433之间，所述L2表位具有LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下称为18-38L2表位)、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下称为56-75L2表位)或DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下称为96-115L2表位)所表示的氨基酸序列。文档编号A61K35/00GK101835796SQ200880021650公开日2010年9月15日申请日期2008年6月25日优先权日2007年6月26日发明者神田忠仁,近藤一成申请人:财团法人日本健康科学振兴财团