肥大细胞稳定剂治疗肥胖症的制作方法

专利名称：肥大细胞稳定剂治疗肥胖症的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗和预防肥胖症的组合物和方法。发明的背景肥胖症是非常常见和有害的代谢性疾病，严重威胁美国以致全世界的公共卫生健 康。自二十世纪八十年代中期这种疾病的流行开始显著上升。在美国，50%的成年人超重 并且30%肥胖。更为严重的是，儿童的肥胖症的流行和相关的糖尿病也快速增加。尤其是 在卫生保健资源的费用和利用方面，肥胖症对个人、家庭、社会的影响是很严重的。因此，控 制体重不仅仅是科学课题，而是不断发展的社会所关切的问题。肥大细胞(MCs)通过释放细胞质颗粒(其成分通过被IgE或补体因子致敏而促进 过敏性炎症)帮助诱导过敏反应(Schwartz, et al.，Prog. Allergy 34 :271_321 (1984)； Mekori, et al. , J. Allergy Clin. Immunol. 104 517-523 (1999)) 最近生物化学和组 织学观察结果提示MCs可能参与血液来源的白细胞聚集(Mekori，et al. , J. Allergy Clin. Immunol. 104 :517-523 (1999))，平滑肌细胞(SMC)/ 内皮细胞(EC)增生(Toda, N.，Circ. Res. 61 280-286 (1987) ；Inoue, et al.，Am. J. Pathol. 149 2037-2054 (1996)； Mueller, et al., Circ. Res.77 54-63 (1995)), _ t (Latti, et al. , J.Cell. Physiol. 195 130-138 (2003) ；Leskinen, et al. , Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 23 238-2343(2003) ；Leskinen, et al. , Biochem. Pharmacol. 66 :1493_1498 (2003))，T 淋巴细 胞迁移和活化(Mekori, et al.，J. Allergy Clin. Immunol. 104 :517_23 (1999))，血管发生 (Zudaire et al.，Am. J. Pathol. 168 :280_291 (2006))，和基质重塑(Daugherty, et al.， Curr. Atheroscler. Rep. 4 -.222-221 (2002))。迄今为止，肥大细胞对肥胖症的作用尚不明 确。现在，肥大细胞缺陷型小鼠的发现(Duttlinger，etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3754-3758(1995) ；ffolters, et al. ,Clin. Exp Allergy 35:82-88(2005))和肥胖 症模型(基因和饮食引起的肥胖症小鼠)的获得使我们可以评价肥大细胞在肥胖症及其并 发症中的作用。此外，重要的的肥大细胞介质或白色脂肪组织(WAT)趋化因子受体的基因 敲除小鼠的获得使我们可以鉴定肥大细胞中对肥胖症重要的介质和WAT中肥大细胞归巢 所需要的趋化因子。发明概述本发明以实验研究结果为基础，结果提示肥大细胞在肥胖症的发展中起重要作用，可能是由于促炎细胞因子和其他介质的产生和释放。缺乏肥大细胞的小鼠在给予西方膳食后，与正常对应体相比，体重增加显著较少。然而，如果给予正常小鼠肥大细胞稳定剂， 也显著避免了体重增加。第一方面，本发明涉及通过给予有效量的使肥大细胞稳定的药物来治疗或预防 动物或人中的肥胖症的一种方法。术语“有效量”是指药物达到治疗目的的充足的量。在 本发明中，这是指当作为用于肥胖症的疗法时，必需给予以促进体重减轻的肥大细胞稳定 剂的足够的量，或者当被给予以预防肥胖症发展时，必需给予以预防体重增加的肥大细胞 稳定剂的足够的量。如果经鼻给药，通常剂量为5-100mg/天，口服剂量会高一些，通常为 50-1500mg/天。出于本发明的目的，如果人或动物超过理想体重20%、体重指数(BMI)在 30或更高和/或身体脂肪超过30%的，则被视为肥胖。在上述方法中给予的肥大细胞稳定性药物，优选在24小时期间分为两次或者更 多次平均给予。首选的药物是色甘酸、奈多罗米、酮替芬和洛度沙胺。这些药物可以任何药 物学可接受的形式，包括药物学可接受的盐类如钠盐、二钠盐、钾盐或锂盐。应该理解为，除 非另外说明，涉及这些药物的一种就包括所有药物学可接受的形式。一些优选的形式为 奈多罗米钠(尤其是经鼻5-50mg/天或口服50-500mg/天)；富马酸酮替芬(尤其是口服 l-200mg/天)和洛度沙胺氨丁三醇(尤其是口服l-200mg/天)。最优选的药物是色甘酸 钠或二钠，以200-1，OOOmg/天的剂量口服给药。在此提及的所有剂量是就人的药物给予而 言的。如果将所述药物给予动物，可以人的剂量为参考再根据体重差异调整。例如，体重约 为501bs的动物应接受人剂量的三分之一。上述方法可用于促进肥胖个体的体重下降或者预防个体的体重增加，尤其是由于 遗传或环境因素而容易增加体重的个体。当给予人或动物治疗肥胖症时，需要持续每天给 药直到个体体重下降至少原来体重的10%，优选15或20%。在特别优选的实施方式中，给 予肥胖个体色甘酸，特别是色甘酸钠或二钠，在此期间，以约200-1，OOOmg/天的剂量给予。 被治疗的患者在治疗期间可有除肥胖症以外的其他症状，或者它们可以没有症状，如过敏， 心血管疾病或糖尿病。另一方面，本发明涉及具有肥大细胞稳定剂和将该稳定剂给予患者以预防和治疗 肥胖症的说明书的治疗组合物。所述稳定剂应该是单位剂型的药物组合物的一部分，并被 包装在成品药物容器中。单位剂型是指单个药物给予实体如片剂，胶囊或溶液量。成品药 物容器中是指任何个用于药物包装的不同类型，如瓶、小玻璃瓶、泡罩包装等。出于本发明 的目的，成品药物容器中包括设计用于经鼻给药的包装，即，瓶或小玻璃瓶，其包含或可用 于递送鼻腔喷雾的溶液或者粉末。类似地，单位剂型包括药物在其中以提供治疗效果的浓 度溶解的溶液，当以固定的量经鼻或口服给予患者时。包含在治疗组合物中的最优选的肥大细胞稳定剂是色甘酸、奈多罗米、酮替芬和 洛度沙胺。当这些药物以片剂或胶囊形式口服给予时，单位剂量通常为5-l，000mg，并且更 通常用地为10_500mg。以口服溶液给予的单位剂量是等量的。如果经鼻给药，溶液应该通 常包含充足的药物浓度，以便患者每喷一下可以接受0. l-10mg。形成治疗组合物的一部分的说明书可以出现在包含肥大细胞稳定剂的包装上，在 成品药物容器上或作为单独的包装说明书。所述说明书包括应给与患者的肥大细胞稳定剂 的剂量，例如用于治疗或预防肥胖症。主治的患者典型地是肥胖患者，以前肥胖，有肥胖症家族史，或者是会由于体重增长带来严重的健康风险的患者，如罹患心血管疾病的患者。本发明也包括通过检测化合物稳定肥大细胞的能力来确定具体的化合物是否对肥胖症的治疗或预防有用。活性有抑制作用本领域公知的任何一种稳定作用检测方法，特 别是那些已开发的用以筛选在过敏性治疗中无用的药物的，均可用于该目的。发明详述本发明基于以下表明肥大细胞稳定剂可以用来控制肥胖症的实施例部分总结的 实验。这些药物可以用于帮助肥胖症患者减轻体重或者预防人们变胖。A.肥大细胞稳定剂稳定肥大细胞的药物在治疗过敏方面已经被广泛研究，并且这些药物的数种已经 是商购可得的。最优选的肥大细胞稳定剂是色甘酸、奈多罗米、酮替芬和洛度沙胺，并且可 以购得，或者可以使用本领域已知的方法合成。此外，本领域中描述的其他任何药物学可 接受的肥大细胞抑制剂也可用于本发明。这些包括在以下的美国专利中公开的化合物 6，207，684 ；4，634，699 ；6，207，684 ；4，871，865 ；4，923，892 ；6，225，327 和 7，060，827。在每 一项美国专利中提供了制备所述化合物的方法，伴随如何纯化的所述化合物以及其以何种 方式使用的信息。这些化合物可以任何任何何药物学可接受的形式给与患者，包括任何任 何何药物学可接受的盐类，最优选的药物是色甘酸钠或色甘酸二钠。B.制备制药组合物肥大细胞稳定性药物可以依据本领域的标准方法掺入药物组合物中(参见例如 ReminRton' s Pharmaceutical Sciences, MackPublishinR Co., (1990))。配制齐阿以设 计为通过本领域常规使用的任何任何途径递送，优选制剂设计为口服或经鼻递送。对于口 服组合物，例如片剂或胶囊，肥大细胞稳定性药物应典型地以1和500mg的剂量提供。对 于经鼻递送的组合物，稳定剂应典型地以0. 5mg/ml-50mg/ml的剂量提供并更优选以Img/ ml-20mg/ml。类似的浓度范围可以用于口服溶液。尽管不是优选的，但是其他的给药途径 也可以采用。肥大细胞稳定剂可以与任何药物制剂中常规使用的任何赋形剂和辅料结合使用， 包括水，盐溶液，醇类，阿拉伯树胶，植物油，苯并醇(benzo-alcohol)，聚乙二醇，明胶，碳水 化合物如乳糖、淀粉酶(amylase)或淀粉，硬脂酸镁，滑石粉，水杨酸，石蜡，脂肪酸酯，聚合 物等。药物制剂可以被灭菌，如果需要的话，与以下佐剂混合如分散剂，润滑剂，防腐剂，稳 定剂，润湿剂，乳化剂，影响渗透压的盐类，缓冲剂，着色剂，调味剂和/或芳香物质。溶液，尤其是注射用溶液，可以用水或生理上相容的有机溶剂如乙醇，1，2_丙二 醇，聚乙二醇，二甲基亚砜，脂肪醇类，甘油三酯类，甘油偏酯等制备。可以采用常规技术所 述制剂，并且可包括灭菌的等渗盐水，水，1,3- 丁二醇，乙醇，1,2-丙二醇，聚乙二醇与水混 合，Ringer溶液等。C.剂型和给药途径本发明适合任何给药途径，包括口服，经口服，内服，直肠，经鼻，舌下，经皮，阴 道，静脉内，动脉内，肌内，腹膜内，皮内和皮下途径。可以采用的剂型包括片剂，胶囊，粉 齐 ，气雾剂，栓剂，皮肤贴剂，非口服剂，缓释制剂和口服液，包括混悬液溶液和乳液。最 优选的给药途径是口服和经鼻。如果需要的话，将组合物，尤其是用于注射的组合物可 以冻干并将冻干物给药前重构。剂型可以包括肥大细胞稳定剂作为唯一的活性成分，或者可以同时包含其他的活性剂。所有剂型可以采用本领域常规方法并在参考文献如 Remington' sPharmaceutical Sciences(Osol，A, ed.，Mack Publishing Co. (1990))中 教导的方法制备。D.治疗方法在此描述的方法的治疗目的是减轻患者体重或预防体重进一步增加。当用于预防 体重增加时，最佳剂量是基于动物研究的结果的，例如本文所述的那些，以及使用本领城众 所周知的方法进行的临床研究。稳定肥大细胞的药物已经可获得用于其他症状的治疗，特 别是过敏反应，并且目前的剂量可以用作评价在预防和治疗肥胖症中有效剂量的起点。在 现有知识的基础上，预计，使用口服递送的方法，患者典型地接受口服剂量50和1500mg/天 的肥大细胞稳定剂，优选分为相等的两剂。当经鼻给药时，预计给予5和IOOmg/天量的稳 定剂，同样将该量分为相等的几剂。
E.关于糖尿病的注释尽管在此描述的实验主要针对肥胖症，某些方面提示同样的方法也可以用来治疗 或预防1型糖尿病。治疗糖尿病的治疗目的是减轻或消除胰岛素依赖。优选的药物和剂量 与用于肥胖症的相同。F.治疗组合物的包装正如之前描述的，包含肥大细胞稳定剂的药物组合物应置于成品药物容器中，并 与针对医生的关于该组合物的使用说明书一同销售。在经鼻递送的制剂的情况下，药物组 合物典型地为溶液或粉末，其包装在设计为将组合物作为喷雾递送的装置中。本领域已知 的任何以此方式递送药物的装置均适用于本发明。取决于意欲的递送途径，其他容器可以 包括瓶，小玻璃瓶，安瓿瓶，泡罩包装等等。关于药物组合物的使用的说明书可以与药物组合物一起包含在容器上或作为包 装说明书。可替代地，说明书也可以包含其中销售有药物组合物的盒子或其他包装上。在 所有情况下，说明书都应该标明给予药物组合物以用来促进体重减轻或预防体重增加的目 的。活性成分的描述也与关于剂量和如何给予药物组合物的信息一起包括在内。G.检测方法本发明也包括基于化合物使肥大细胞稳定的能力来评价其在治疗和预防肥胖症 中的潜在用途的方法。这些检测方法是本领域众所周知的并且曾经用于在治疗过敏性反应 中有用的药剂的鉴别。可以使用的一个适合的检测方法的实例在美国6，225，327中描述。简言之，肥大 细胞(约5，000/测定管)在37°C与试验化合物孵育约15分钟，然后暴露于抗人IgE(约 10yg/ml)中。再孵育15分钟后，通过离心终止反应。然后收集上清液，并分析组胺含量， 例如通过放射免疫法。然后将该样品(试验样品)中存在的组胺量与通过在不存在试验化 合物的情况下孵育肥大细胞和抗人IgE而获得的对照制剂中的量进行比较。与对照相比， 试验样品中组胺含量的减少是试验化合物起稳定肥大细胞的作用的指示。稳定剂的效力可 以通过达到给定抑制水平所需的浓度来反应，例如，组胺释放减少50%。
实施例本研究证实肥大细胞对饮食引起的肥胖症和糖尿病起重要作用。来自肥胖的人和小鼠的白脂肪组织(WAT)比来自他们的瘦对应体的WAT包含较多的肥大细胞。小鼠中遗传 决定的肥大细胞缺陷和肥大细胞的药物稳定减少了体重增加和血清和/或WAT中炎性细胞 因子、趋化因子和蛋白酶的水平，并且与改善的葡萄糖内稳态和能量消耗相呼应。机制研究 揭示肥大细胞提高WAT和肌肉的血管发生和相关的脂肪生成有关的组织蛋白酶活性。与减 少体重增加和改善葡萄糖耐量一致，肥大细胞缺陷和稳定提高肌肉和WAT中抗脂肪生成的 基质纤维连接蛋白、葡萄糖运载体Glut4和胰岛素受体的水平。细胞因子缺陷型肥大细胞 的使用确立了这些细胞体外诱导小鼠脂肪细胞的脂质沉积和组织蛋白酶的表达，并且体内 通过产生IL6和IFN-γ促进饮食引起的肥胖症和葡萄糖代谢。临床使用肥大细胞稳定剂 减轻了小鼠肥胖症和糖尿病，提示对这些常见人类代谢性疾病的新疗法。I.方法小鼠野生型(C57BL/6)、116+型(C57BL/6, Nil)和 Ifng+ 型(C57BL/6, N10)小鼠 购自Jackson实验室(Bar Harbor, ME)。同基因型的Tnf+型(C56BL/6, N10)和肥大细 胞缺陷型Kitw_slVw_sh(C57BL/6，N> 10)小鼠通过与C57BL/6背景如所述地回交(Sim，et al.Nat. Med. 13 :719-724(2007) ；ffolters,et al. ,Clin Exp Allergy 35 :82_88 (2005))而 产生。哈佛大学医学院常务委员会批准了所有动物研究草案，所有小鼠都饲养在无病原体 的设施内。为诱导肥胖症，给6周龄小鼠(雌性和雄性)饲以西方膳食(Research Diet, New Brunswick，NJ) 12-20周。每周监测小鼠体重。直至西方膳食的消耗的各个过程结束 为止，如先前所报道地进行葡萄糖耐量和能量消耗检测(Yang，etal.，Nat. Cell Biol. 9 970-977(2007))。采集小鼠血样用于血清脂肪因子测量。独立采集皮下脂肪、内脏脂肪和 棕脂肪以及骨骼肌用于蛋白提取和石蜡切片的制备。组织蛋白提取物用于进行酶联免疫吸 附试验(ELISA)、免疫印迹分析和半胱氨酸组织蛋白酶活性中心标记。对于免疫印迹分析， 30 μ g蛋白在8% SDS-PAGE上分离以检测220kDa的纤维连接蛋白(小鼠单克隆，1 100， NeoMarkers, Fremont, CA)和 200kDa 的胰岛素受体(小鼠单克隆，1 100，Calbiochem, SanDiego，CA)，或者在12% SDS-PAGE上分离以测定Glut4(小鼠单克隆，1 200，R&D Systems, Minneapolis, MN)、解偶联蛋白 UCPl(兔多克隆，1 3000，Abeam, Cambridge, ΜΑ)、肌动蛋白(小鼠单克隆，1 500，Abeam)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH，兔多克隆， 1 1000，Santa Cruz Biotechnolog, Santa Cruz, CA)。对于组织蛋白酶活性中心标记， 将30 μ g蛋白与1 μ 1的600mM的二硫苏糖醇、1 μ 1的[125I]-JPM在ρΗ5. 5的缓冲液中如在 先所述地一起孵育。在37°C孵育反应混合物1小时后，于12% SDS-PAGE上分离经标记的 蛋白。凝胶用考马斯蓝染色、脱色、干燥并暴露于χ射线胶片。采集肝脏和胃肠道用于组织 学分析。患者选择本研究入选在2003-2007 年H0tel-Dieu 医院营养科(ReferenceCenter for the Medical and Surgical Care of Obesity, Paris, France)预征募的 80 位月巴胖受试 者(平均年龄37. 5岁，在20-66岁之间；平均BMI为48. 5kg/m2，范围是32-85 ；女性/男 性比69/11)。在Assistance Publique-Hopi taUX de Paris支持的临床研究计划中，受 试者是饮食干预或者胃手术的候选人。排除了有炎症或传染性疾病、癌症、酒精滥用或肾 脏疾病迹象的那些。在胃手术时，在肥胖受试者小组(N = 6，BMI = 51.71±1.40kg/m2，&糖:5. 38士0. 13mmol/l，胰岛素:13. 32士 1. 06 μ U/ml)中，我们获得了脐周区的皮下脂肪组 织。在同一地理区域生活的健康不肥胖的年龄匹配的(P = 0. 2)个体(N = 32，平均年龄 41. 4岁，范围20-62 ；平均BMI 22. 8kg/m2，范围19. 9-28. 4 ；女性/男性比22/10)征募为 对照组。在10位瘦对照(BMI = 23. 67士0. 48kg/m2，葡萄糖4. 82士0. 45mmol/l，胰岛素 7.20±1.56yU/ml)中我们通过穿刺活检获取了脐周区的皮下脂肪组织。参与代谢研究的 志愿者在干预前3个月是体重稳定的。在禁食后的早上得到的血液样本和血清，于-80°C冷 冻直至使用。将组织标本进行福尔马林固定和石蜡包埋。HGtel-Dieu医院伦理委员会批 准该临床研究，并且所有受试者都签署了书面知情同意书。免疫组织学将人和小鼠的WAT和肌肉组织用10%福尔马林固定过夜并包埋在石蜡中，由此制备厚度5μπι的切片。抗人肥大细胞类胰蛋白酶(小鼠单克隆，1 100，Dako，TRAPPES CBDEX, France)，抗小鼠肥大细胞 CDl 17 (兔多克隆，1 10，eBiosciences, Inc.，San Diego, CA)，和抗小鼠 CD31(兔单克隆，1 400，Pharmingen, San Diego, CA)对 WAT，肌肉 和肝切片上的肥大细胞和微血管进行免疫染色。对组织来源不知情的研究者计数人的类胰 蛋白酶阳性和CD117阳性的肥大细胞，并且数据提供为每mm2的细胞数。在WAT和肌肉组织 中的⑶31阳性区如所述地使用Image-Pro Plus软件来测定，并且数据提供为⑶31阳性区 的百分比(Wang，et al.，J. Biol. Chem. 281 :6020_6029 (2006) ；Wild，Microvasc Res. 59 368-376 (2000) )0苏木精和伊红染色有助于胃肠道的组织学评价。ELISA将经冷冻的小鼠WAT粉化并溶解在包含组织蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Calbiochem， San Diego, CA)的 RIPA 缓冲液(Pierce，Rockford, IL)中。WAT 和血清样本都根据 生产商的说明书经针对 IL6 (BDBiosciences)，TNF- α (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-y (PeproTech), MCP-1 (P印roTech)，脂连蛋白(R&D Systems), MMP-9 (R&D Systems), CatS (R&D Systems)禾口 CatL(Bender MedSystems Inc，Burlingame，CA)的 ELISA 检测。为测量人血清中类胰蛋白酶水平，将96孔板用兔的抗人的类胰蛋白酶多克隆抗 体(1 1000,Calbiochem)预涂覆。将经稀释的人血清样本(1 2)与重组的人的类胰蛋 白酶一起作为标准添加到抗体涂覆孔板中。室温孵育2小时后，洗涤板，并与抗人的类胰蛋 白酶单克隆抗体(1 2000,AbD Serotec,Raleigh,NC)孵育1小时。过氧化物酶(HRP)缀 合的抗鼠 lgG(l 1000, Thermo scientific，Waltham，MA)用作检测用抗体。3T3-L1细胞培养和分化将小鼠前月旨肪细胞 3T3_Ll(The American Type CultureCollection, Manassas, VA)在胰岛素、地塞米松和异丁甲基黄嘌呤中在6孔板或24孔板上如所述地培养并分化为 脂肪细胞(Yang, et al.，Nat. Cell Biol. 9 :970_977 (2007))。为评价肥大细胞在 3T3-L1 分 化中的作用，我们在100%融合的3T 3-L1细胞中加入活肥大细胞(对于6孔板加入2 X IO6 个细胞/孔，或对于24孔板加入5X IO5个细胞/孔)或者肥大细胞脱粒蛋白提取物(等于 活细胞数)。将共同培养物保持7-9天，每2天更换具有活肥大细胞或肥大细胞脱粒蛋白提 取物的培养基。油红0染色定量脂质沉积，并且数据提供为OD51tlnm读数。通过如所述地将 细胞溶解在PH5. 5的缓冲液中，分化的3T3-L1细胞还用于组织蛋白酶活性中心标记(Shi， et al.，J. Biol. Chem. 267 :7258_7262 (1992))。
骨髓来源吧大细胞(BMMC)的培养和重津由WT, 116+，Tnf+，and Ifng+小鼠的骨髓制备BMMC，如在先报道(Sun, et al. Nat. Med. 13 :719_724(2007) ；Sun, et al.，J.Clin. Invest. 117 :3359_3368(2007))。 在重组小鼠IL3 (P印roTech)和干细胞因子(PeproTech)分化5周后(Sun, et al. Nat. Med. 13 :719-724(2007))，分别用⑶117介导的荧光活化细胞分选系统(FACS)分析和甲苯 胺蓝染色鉴定细胞纯度和形态。为检测肥大细胞在小鼠肥胖症中的作用，将来自每种小鼠 的BMMCaxiO7/小鼠)注入6周龄雄性Kitw_slVw_slM、鼠的尾静脉。BMMC重建2周后，小鼠 消耗西方膳食以诱导肥胖症和糖尿病。每周记录小鼠体重，在收集WAT制备蛋白提取物之 前进行葡萄糖耐量分析。Mt来自所有小鼠的数据以平均值士标准差表示，并且由于我们的数据大小小和数 据分布是非正态的因此采用非参数秩和检验(Marm-Whitney test)来确定统计显著性。人 血清糜蛋白酶和类胰蛋白酶数据表示为平均值士标准差。Shapiro-Wilcoxon检验估计 所有临床和生物学参数的高斯分布。统计分析前，将偏态变量(糜蛋白酶和类胰蛋白酶) 经对数转换并验证以使它们的分布正态化。不连续数值的Student' s t检验，方差分析 (ANOVA)和X2检验被用于组间比较。用JMP统计软件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)进 行统计分析。P <0.05被认为是显著的。II.结果除脂肪细胞外，肥胖受试者中的WAT还包含巨噬细胞和淋巴细胞(Weisberg， et al. , J.Clin. Invest. 112 1796-1808 (2003) ；ffu, et al. , Circulation 115 1029-1038 (2007))。这些炎性细胞提供WAT中的细胞因子、生长因子、趋化因子和蛋 白 _ (ffu, et al. , Circulation 115 1029-1038(2007) ；Fantuzzi, J. Allergy Clin. Immunol. 115 :911_919 (2005))。但是这些细胞在肥胖症和相关的代谢并发症糖尿病的发病 机制中的作用仍不清楚。其他未明确的细胞也可能起重要作用。人脂肪组织切片用肥大细 胞特异性类胰蛋白酶单克隆抗体的免疫染色显示，与瘦削供体相比，来自肥胖受试者的WAT 中肥大细胞数量增加。伴随着较高的肥大细胞含量，肥胖供体的血清中肥大细胞蛋白酶水 平增高。使用ELISA，测得，与瘦削的受试者(BMI < 30kg/mm2)相比，肥胖供体(人体质量指 数=BMI彡30kg/mm2)在性别差异校正之前(P < 0. 01)和之后的(P < 0. 01，多变量分析) 具有显著较高的类胰蛋白酶水平。这些观察结果提示了肥大细胞在肥胖症中的作用。为评价肥大细胞直接参与肥胖症，我们研究了饮食诱导的肥胖症的肥大细胞缺陷 型KitW-SlVhh小鼠。尽管由于C-Kit启动子区域的倒位突变而使得KitW-sh/W-sh小鼠缺乏成 熟的肥大细胞(Duttlinger, et al. ,Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 92 :3754_3758 (1995))， 但是血液中其他淋巴细胞的数量和活性是正常的，所以允许体内探测肥大细胞的功能。饲 以西方膳食12周，与野生型(WT)同基因型的对照相比，6周龄雄性Kitw_slVw_sh小鼠增加显 著较少的体重。类似地，接受每日腹膜内(i. P.)注射肥大细胞稳定剂色甘酸二钠(DSCG) (Eigen，et al. ,J. Allergy Clin. Immunol. 80 :612_621 (1987))的 WT 小鼠也具有减少的体 重增加。DSCG治疗并不进一步影响Kitw-slVw_sh小鼠的体重，提示是通过肥大细胞起作用的。 与减轻体重一致，雄性Kitw_slVw_sh小鼠或者接受DSCG的那些，与未治疗的野生型WT对照相 比，具有显著较少的皮下和内脏脂肪。雌性Kitw_sh/w_sh小鼠或DSCG治疗的WT小鼠表现出相似的体重增加和皮下及内脏脂肪的减少。和人的脂肪组织一样，来自饮食导致肥胖的小鼠 的WAT包含大量的c-Kit (CDl 17)阳性的肥大细胞，而来自饲料喂饲 (chow diet-fed)的瘦 削小鼠的WAT具有少得多的肥大细胞。有趣的是，在相同的饮食条件下，DSCG治疗小鼠的 WAT中肥大细胞数量与未治疗小鼠的WAT中肥大细胞数量相近，尽管在体重增加方面这些 小鼠与Kitw_slVw_sh小鼠反应类似，提示与未治疗的WT小鼠相比，DSCG治疗WT小鼠具有较少 的活性肥大细胞。与雄性和雌性Kitw_sh/w_sh小鼠或接受DSCG的那些的体重减轻一致，这些小 鼠还具有比WT对照显著较低水平的血清瘦素水平。Kitw_sh/w_sh和经DSCG治疗的小鼠不仅较 瘦，而且还证实它们对葡萄糖负荷的敏感性较高。葡萄糖耐量检测表明无肥大细胞(Kitw_slV w_sh)的小鼠或具有被稳定的肥大细胞(用DSCG治疗的WT)的小鼠中显著改善的葡萄糖耐 量。为理解肥大细胞缺陷或失活的这些有益效果的机制，我们进行了能量消耗检测并测量 了棕色脂肪非偶联蛋白-1 (UCPl)。通过测量食物/水的摄入，粪便/尿液的产生和O2消耗 及CO2的产生，发现Kithh^h小鼠和经DSCG治疗的WT小鼠的静息代谢率增加，这通过与未 治疗WT小鼠相比显著更多的O2消耗及的CO2产生而阐明。相比WT对照小鼠，Kitw--小 鼠和接受DSCG的那些具有明显较高的棕脂肪UCPl (能量消耗的标志)表达。重要的是，既 不是食物/水的摄入减少，也不是DSCG的毒性作用引起经DSCG治疗的WT小鼠的体重减轻 和葡萄糖耐量改善。组织学分析表明，与饲料喂饲的WT小鼠相比，经DSCG治疗的西方膳食 饮食喂饲的小鼠的肝脏和胃肠道(GI)病理上没有差异。在西方膳食喂饲的WT小鼠的脂肪 肝里出现大量肥大细胞和脂肪细胞，而在饲料喂饲的WT小鼠或经DSCG治疗的西方膳食饮 食喂饲的WT小鼠的肝脏中没有检测到肥大细胞或负载脂质的脂肪细胞。类似地，胰脏、胃、 结肠和小肠组织学检查显示饲料喂饲的WT小鼠和经DSCG治疗的西方膳食喂饲的WT小鼠 之间没有明显区别。为进一步观察，我们对WT小鼠饲以西方膳食12周以引发肥胖症和糖 尿病，并将这些肥胖和糖尿病小鼠分为4个治疗组1，持续用西方膳食喂饲，II，转为饲料； III，持续用西方膳食喂饲连同每日腹膜内注射DSCG ；IV，转为饲料并且用DSCG治疗。尽管 饮食的改变(组II)也会引起预计到的体重减轻(8% )和葡萄糖耐量改善，然而饮食改变 与给予DSCG(组IV)联合产生体重和葡萄糖耐量的最大改善。DSCG治疗8周后，组III的 小鼠体重下降了 12%，但是组IV的小鼠下降了 19%，并且稳定在约40-41克。重要的是， 在这4四组中组的IV小鼠也显示了最高的葡萄糖耐量，提示通过稳定肥大细胞来控制人的 肥胖症和糖尿病的可能性。III.讨论肥胖症的发展包括脂肪生成、血管发生和基质重塑。血管发生在肥胖症中尤为重 要。微血管除了给WAT提供营养，还为白细胞侵润及随之的脂肪因子释放提供通道。血管 发生的抑制阻断小鼠脂肪组织的发育(Rupnick, et al.，Proc. Natl Acad. Sci. USA 99: 10730-10735 (2002)) ο肥胖WT小鼠的WAT和肌肉组织显示了内皮细胞标记物CD31明显的 免疫染色。相反，西方膳食喂饲的Kitw-sh/w_sh小鼠或接受DSCG的那些具有与饲料喂饲的瘦 小鼠相似的CD31阳性区域。减少的血管发生可能影响白细胞侵润，因此减少WAT炎症介质 的产生(Skoura, etal.，J. Clin. Invest. 117 :2506_2516 (2007))。与此观点一致，Kit[sh/ w_sh小鼠或接受DSCG的那些具有较低的血清和/或WAT中IL6，TNF-α，IFN- y , MCP-I，基 质金属蛋白酶-9(ΜΜΡ_9)和组织蛋白酶S(CatS)，尽管某些脂肪因子(如脂连蛋白和CatL) 没有明显变化。基质蛋白酶解可能通过释放促血管生成的肽而有助于血管发生(Xu，etal.，J. Cell Biol. 154:1069-1079(2001))。我们以前已经揭示了 CatS通过降解抗血管生成的 肽和产生促血管生成的核纤层蛋白-5的片段Y 2而在血管发生中发挥重要作用(Wang，et al.，J. Biol. Chem. 281 =6020-6029 (2006)) 0 在 Kit—小鼠或 DSCG 治疗小鼠中血管发 生减少，伴有WAT和血清中的低CatS水平。将WAT蛋白提取物与选择性标记活性组织蛋 白酶的[125I] -JPM孵育后，在Kitw-sh^sh小鼠WAT中我们发现活性受损的组织蛋白酶，包括 CatS, CatK和CatB。有趣的是，经DSCG治疗的小鼠的WAT中仍具有与WT对照相似的活性 CatS和CatK水平，与在这些组织中观察到大量肥大细胞一致。CatSELISA使我们能够测定 不同小鼠中局部和全身的水平。与JPM标记实验的观察结果相似，雄性和雌性的Kitw-sh^sh 小鼠都显示低于WT对照的血清和WAT中CatS水平。相反，DSCG治疗组显著降低在血清中 而不是在WAT中的CatS水平，提示该抗变态反应药剂有效地使肥大细胞失活。我们以前的研究提示半胱氨酰组织蛋白酶不仅促进血管发生，而且通过降解抗 脂肪生成的基质构成纤维连接蛋白、葡萄糖运载体Glut4和胰岛素受体(IR)参与脂肪生
(Wang, et al. ， J Biol Chem. 281 6020-6029 (2006) ；Yang, et al. ，Nat. Cell Biol. 9 970-977(2007) ；Taleb，et al. ,Endocrinology 147:4950-4959(2006))。肥大细胞缺陷和 失活由于组织蛋白酶活性降低可能间接影响这些蛋白。与该假说一致的是，Kitw-sh/w_sh小鼠 的WAT和肌肉组织中所有这三种分子都增加。有趣的是，在经DSCG治疗小鼠的WAT和肌肉 组织中我们检测到比Kitw_slVw_sh小鼠更多的纤维连接蛋白、Glut4和IR分子，提示DSCG比 肥大细胞影响更大。但是，DSCG的这种附加效应并未进一步改变Kitw_slVw_sh小鼠的体重增 加和葡萄糖耐量或者改变WT小鼠的肝脏及胃肠道组织学。为进一步理解肥大细胞控制小鼠肥胖症和糖尿病的分子机制，我们制备了缺乏三 种常见肥大细胞分泌的细胞因子(IL6，TNF-α，和IFN-γ )之一的小鼠的骨髓来源的肥大 细胞(BMMC)，并检查了任何细胞因子的缺乏是否损害肥大细胞体外诱导前脂肪细胞分化及 体内对饮食引起的肥胖症和糖尿病中的活性。来自WT、Tnf+，和Ifng+小鼠的BMMC即使在 无分化诱导鸡尾酒(胰岛素，地塞米松，异丁基甲基黄嘌呤)的条件下也诱导3T3-L1细胞 的血管发生和相关的组织蛋白酶表达，尽管根本机制仍未知。相反，116+的BMMC对这两个 变量具有低得多的效力。为体内验证这些肥大细胞的细胞因子在肥胖症中发挥作用，我们 将这些BMMC细胞过继转染到雄性Kitw-sh/w_sh小鼠。给予西方膳食13周后，与没有进行BMMC 重建小鼠相比，WT和Tnf+B匪C重建但非116+和Ifng+B匪C的小鼠显著增加更多的体重 尽管它们都比WT对照瘦。与体重差异一致，和未重建的小鼠或接受116+和Ifng+BMMC的 那些相比，接受WT和Tnf+BMMC的那些具有显著更高的血清胰岛素和葡萄糖水平。相比WT 对照，接受116+和Ifng+BMMC但非WT或Tnf+BMMC的Kitw-sh/w-sh小鼠也显示了改善的葡 萄糖耐量，提示肥大细胞来源的IL6和IFN-Y促成了这些代谢紊乱。为支持该结论，相比 WT小鼠或者接受WT或Tnf+BMMC的那些，我们在116+和Ifng+BMMC重建的Kiw-slVw_sh小 鼠WAT提取物中检测到更高量的基质纤维连接蛋白、Glut4和IR。WAT中这些分子的差异可 能是由于蛋白酶解的改变或脂肪细胞大小不同造成的。尽管我们发现Kitw_sh/w_sh小鼠比WT 对照的WAT脂肪细胞小，但是WAT脂肪细胞的大小在不同BMMC重建小鼠之间并没有显著变 化。相反，不同重建的接受者在半胱氨酰组织蛋白酶的表达上具有明显不同。不知道为什 么Ifng+BMMC与WT BMMC相同地诱导3T3-L1脂肪生成和组织蛋白酶活性，但是不能恢复体 重和葡萄糖敏感性。肥大细胞来源的IFN-γ除了影响脂肪细胞分化外，还可能影响其他过程如通过旁分泌效应影响邻近细胞的血管发生或蛋白酶表达。在Ifng+BMMC重建Kitw_slV w-s1mh^wat中观察到低组织蛋白酶活性支持了这一观点。因此，肥大细胞介质体外如何调 节WAT的生长及何种附加的肥大细胞因子参与还值得进一步研究。本研究确立了肥大细胞在鼠类肥胖症和糖尿病中的新作用并提示了临床常规应 用的抗过敏反应药物用于这些常见人类代谢性疾病的潜在新疗法。_本文引用的所有参考文献通过参考完全并入。现在完整地描述了本发明，本领域 的技术人员了解本发明可以在宽的和相当范围的条件、参数范围等下实施，而不影响发明 及其任何实施方式的精髓或范围。
权利要求
治疗或预防人或动物对象肥胖症的方法，其包括给予所述对象有效量的稳定肥大细胞的药物。
2.权利要求1的方法，其中给予肥胖的人对象所述稳定肥大细胞的药物至少足以使所 述对象相比他们开始治疗时的总体重减少至少15%的时段。
3.权利要求1的方法，其中所述人或动物对象在开始治疗时没有过敏反应、心脏病和 糖尿病。
4.权利要求1的方法，其中所述药物选自色甘酸、奈多罗米、酮替芬和洛度沙胺。
5.权利要求4的方法，其中所述药物是以50-1500mg/天的剂量口服给予的。
6.权利要求4的方法，其中所述药物是以5-100mg/天的剂量经鼻给予的。
7.权利要求4的方法，其中所述药物是以200-1000mg/天的剂量口服给予的色甘酸钠 或色甘酸二钠。
8.权利要求4的方法，其中所述药物是以5-50mg/天的剂量经鼻给予的奈多罗米钠。
9.权利要求4的方法，其中所述药物是以50-500mg/天的剂量口服给予的奈多罗米钠。
10.权利要求4的方法，其中所述药物是以l_200mg/天的剂量口服给予的富马酸酮替芬。
11.权利要求4的方法，其中所述药物是以l_200mg/天的剂量口服给予的洛度沙胺氨 丁三醇。
12.治疗组合物，其包含a)成品药物容器中的肥大细胞稳定剂，和b)给予人或动物患者所述肥大细胞稳定剂以治疗肥胖症的说明书。
13.权利要求12的方法，其中所述药物选自色甘酸、奈多罗米、酮替芬和洛度沙胺。
14.权利要求13的方法，其中所述药物是色甘酸钠或二钠。
15.权利要求13的方法，其中所述药物是奈多罗米钠。
16.权利要求13的方法，其中所述药物是富马酸酮替芬。
17.权利要求13的方法，其中所述药物是洛度沙胺氨丁三醇。
18.权利要求13的治疗组合物，其中所述肥大细胞稳定剂是药物组合物的一部分，是 以单位剂量形式并且以每个单位剂量为l_500mg存在。
全文摘要
本发明涉及通过给予稳定肥大细胞的化合物来治疗或预防肥胖症发展的方法，此外，所述方法包括具有肥大细胞稳定剂和关于所述稳定剂用于治疗或预防肥胖症的说明书的药物组合物。
文档编号A61K31/517GK101808642SQ200880108966
公开日2010年8月18日 申请日期2008年9月24日 优先权日2007年9月28日
发明者施国平 申请人:布里格海姆妇女医院公司