专利名称：促红细胞生成素融合蛋白的制作方法
促红细胞生成素融合蛋白本发明涉及促红细胞生成素(EP0)融合多肽和二聚体；编码所述多肽的核酸分子 和使用所述多肽/二聚体治疗的方法。细胞因子受体可被分为两个不同的类型。1类受体(也称为造血或生长激素家族) 是由它们的胞外结构域的氨基末端部分中四个保守的半胱氨酸残基以及C-端部分中保守 的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序的存在表征的。受体由两条多肽链组成。I类受体可被再分 为 GM-CSF 亚家族(其包括 IL-3、IL-5、GM-CSF、GCSF)和 IL-6 亚家族(其包括 IL_6、IL_11 和IL-12)。在IL-6亚家族中，有与一种或两种不同的细胞因子亚基相关的常见的转导亚 基(gpl30)。还有一种亚家族被称为IL-2亚家族(包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15)。 重复的Cys基序也存在于2类(干扰素受体家族)中，其配体为a、0和Y干扰素，但是 缺少保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序。人类EP0是参与调节骨髓中红血球生成的35kD的糖蛋白激素。它由肾产生并且 自从在1977年将其纯化和在1985年将其克隆以来，它常被用来在慢性肾衰竭和其他疾病 中治疗贫血。响应EP0的细胞包括内皮细胞、神经和心脏细胞。由于不同的糖基化，EP0的 制剂是非均质的。体外活性不需要EP0的糖基化表明EP0的成熟形式可在没有糖基化存在 的情况下结合EP0受体。然而，EP0的体内活性依赖于防止其降解并延迟清除的糖类部分 的加合。EP0通过活化在红系细胞上以低水平表达而在成熟的血红细胞中缺乏的单一的高 亲和力受体来活化红血球发育。EP0受体(EP0R)属于I类细胞因子受体超家族。EP0与 EP0R的结合导致受体二聚化，其诱导大量胞质和膜相关的分子包括EP0R的酪氨酸磷酸化。 已经在肌细胞、神经元细胞和内皮细胞中检测到EP0R，并且据信EP0起到控制心脏和大脑 发育的作用。已经显示EP0保护心脏和大脑不受炎性和缺血性损害。EP0的血清水平可响应于 正常和病理状况而变化。EP0的水平可响应于缺氧或失血而升高100-1000倍。贫血可由大量病理状况所导致。例如，缺血状态可由失血、溶血、缺铁症、骨髓再生 障碍或营养缺乏所导致。在一些病理状况中，EP0的水平可以低很多并且由导致EP0的生成 减少和随后的贫血的慢性肾衰竭所导致。此外，在患有疾病例如类风湿性关节炎、AIDS和癌 (作为化学治疗的结果)的患者中，EP0的水平可能是低的。当施用重组的EP0(如Epogen、 Aransesp和Epogin)时，对贫血的治疗是非常有效的。通常重组的EP0通过皮下注射或静 脉内地每周施用两次或三次。EP0的施用不是没有风险的。一些副作用包括增加的血压、恶 心、呕吐、头疼和呼吸急促。有开发可被较低频率施用并且具有增加的血清稳定性从而导致较低剂量的施用 和较少的副作用的另外的形式的EP0的需要。本公开内容涉及具有改善的药物动力学和活性的EP0重组形式的鉴定。新的EP0 分子是生物学上有活性的，形成二聚体并且具有改善的稳定性。根据本发明的一个方面，提供了包含编码具有促红细胞生成素活性的多肽的核酸 序列的核酸分子，其中所述多肽包含与促红细胞生成素受体的促红细胞生成素结合结构域直接或间接连接的促红细胞生成素或者其部分。根据本发明的一个方面，提供了融合多肽，其包含与促红细胞生成素受体的促红 细胞生成素结合结构域直接或间接连接的促红细胞生成素或其活性结合部分的氨基酸序 列。在本发明的优选的实施方案中促红细胞生成素通过肽连接体优选柔性肽连接体 与促红细胞生成素受体的结合结构域连接。在本发明的优选的实施方案中所述肽连接分子包含至少一个拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0在本发明的优选的实施方案中所述肽连接分子包含2、3、4、5或6个拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser。优选地，所述肽连接分子由3个拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser组成。在本发明的可选的优选的实施方案中，所述肽连接分子由4个拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser 组成。在本发明的另外的可选的实施方案中，所述多肽不包含肽连接分子，而是促红细 胞生成素和促红细胞生成素受体的促红细胞生成素结合结构域的直接融合物。根据本发明的另外的方面，提供了包含选自下列的核酸序列的核酸分子i)如SEQ ID NO 1中所表示的核酸序列；ii)如SEQ ID NO 3中所表示的核酸序列；iii)如SEQ ID NO 5中所表示的核酸序列；iv)如SEQ ID NO 7中所表示的核酸序列；或v)包含在严格杂交条件下与SEQ ID NO :1、3、5或7杂交并且编码具有促红细胞 生成素受体调节活性的多肽的核酸序列的核酸分子。在本发明的优选的实施方案中所述多肽是激动剂。在本发明的可选的优选的实施方案中所述多肽是拮抗剂。当两个互补的核酸分子具有一定量的彼此键合的氢时，发生核酸分子的杂交。杂 交的严格性可根据核酸周围的环境条件、杂交方法的性质以及所用的核酸分子的组成和长 度来变化。关于获得特定级别的严格性所需要的杂交条件的分析论述在Sambrook等人， Molecular Cloning :A LaboratoryManual (分子克隆实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor，NY，2001)禾口Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes (生物 化学和分子生物学中的技术一使用核酸探针的杂交)I部分，第2章(ElseviehNew York, 1993)。1 是核酸分子的给定链的50%与其互补链杂交的温度。下列是杂交条件的示例性 设定并且是非限制性的非常高的牛(fr.i^)杂交5x SSC 于 65 °C 16 小时清洗两次2x SSC于室温(RT)每次15分钟清洗两次0. 5x SSC于65°C每次20分钟^r^t^ (fri午H有至小、80%同一件的序歹I丨杂交)杂交5x-6x SSC 于 65°C-70°c 16-20 小时
清洗两次2x SSC于RT每次5-20分钟清洗两次lx SSC于55°C _70°C每次30分钟低戶鼎(介午‘辟4、50%胃一性請歹丨丨棘)杂交6x SSC 于 RT 至 55 °C 16-20 小时清洗至少两次 2x_3xSSC于RT至55°C每次20-30分钟。在本发明的优选的实施方案中所述核酸分子包含如SEQ ID NO :1中所表示的核酸 序列或由如SEQ ID NO 1中所表示的核酸序列组成。在本发明的优选的实施方案中所述核酸分子包含如SEQ ID NO :3中所表示的核酸 序列或由如SEQ ID NO :3中所表示的核酸序列组成。在本发明的优选的实施方案中所述核酸分子包含如SEQ ID NO :5中所表示的核酸 序列或由如SEQ ID NO :5中所表示的核酸序列组成。在本发明的优选的实施方案中所述核酸分子包含如SEQ ID NO :7中所表示的核酸 序列或由如SEQ ID NO :7中所表示的核酸序列组成。根据本发明的一个方面，提供了由根据本发明的核酸编码的多肽。根据本发明的另外的方面，提供了包含选自下列的氨基酸序列的多肽i)如SEQ ID NO 2中所表示的氨基酸序列；ii)如SEQ ID NO 4中所表示的氨基酸序列；iii)如SEQ ID NO 6中所表示的氨基酸序列；iv)如SEQ ID NO 8中所表示的氨基酸序列；v)如SEQ ID NO 17中所表示的氨基酸序列；vi)如SEQ ID NO 18中所表示的氨基酸序列；或其中所述多肽具有促红细胞生成 素受体调节活性。在本发明的优选的实施方案中所述多肽是激动剂。在本发明的可选的优选的实施方案中所述多肽是拮抗剂。在本发明的优选的实施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO :2中所表示的氨基酸序 列或由如SEQ ID NO :2中所表示的氨基酸序列组成。在本发明的优选的实施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO :4中所表示的氨基酸序 列或由如SEQ ID NO :4中所表示的氨基酸序列组成。在本发明的优选的实施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO :6中所表示的氨基酸序 列或由如SEQ ID NO :6中所表示的氨基酸序列组成。在本发明的优选的实施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO :8中所表示的氨基酸序 列或由如SEQ ID NO :8中所表示的氨基酸序列组成。在本发明的优选的实施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO 17中所表示的氨基酸 序列或由如SEQ ID NO 17中所表示的氨基酸序列组成。在本发明的优选的实施方案中所述多肽包含如SEQ ID NO 18中所表示的氨基酸 序列或由如SEQ ID NO 18中所表示的氨基酸序列组成。根据本发明的一个方面，提供了由两个多肽组成的同型二聚体，其中所述多肽中 的每一个包含i)包含促红细胞生成素或其受体结合结构域的第一部分，其任选地通过肽连接分子连接至ii)包含促红细胞生成素受体的促红细胞生成素结合结构域的第二部分。在本发明的优选的实施方案中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包含SEQ ID NO 2 或由 SEQ ID NO 2 组成。在本发明的优选的实施方案中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :4 或由 SEQ ID NO 4 组成。在本发明的优选的实施方案中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :6 或由 SEQ ID NO 6 组成。在本发明的优选的实施方案中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :8 或由 SEQ ID NO 8 组成。在本发明的优选的实施方案中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包含SEQ ID NO 17 或由 SEQ ID NO 17 组成。在本发明的优选的实施方案中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包含SEQ ID NO 18 或由 SEQ ID NO 18 组成。在本发明的另外的方面提供了包含根据本发明的核酸分子的载体。在本发明的优选的实施方案中所述载体是适于表达根据本发明的核酸分子的表 达载体。含有根据本发明的核酸的载体不必包含启动子或其他调节序列，尤其是如果载体 将被用于将核酸引入细胞以便为了稳定的转染重组至基因组。优选地载体中的核酸可操作 地连接于适当的启动子或其他调节元件以便在宿主细胞中转录。载体可以是在多个宿主中 起作用的双功能表达载体。“启动子”意指来自转录起始位点上游的核苷酸序列，并且包含 所有转录所需的调节区。适合的启动子包括组成型、组织特异型、可诱导的、发育的或用于 在真核或原核细胞中表达的其他启动子。“可操作地连接”意指连接为同一核酸分子的部 分，适当地定位并且定向以便从启动子起始转录。可操做地连接于启动子的DNA处于启动 子的“转录起始调节之下”。在优选的实施方案中，启动子是组成型的、可诱导的或者可调节的启动子。根据本发明的另外的方面，提供了用根据本发明的核酸分子或载体转染或转化的 细胞。优选地，所述细胞是真核细胞。可选择地所述细胞是原核细胞。在本发明的优选的实施方案中所述细胞选自由下列组成的组真菌细胞(例如毕 赤酵母属(Pichia spp)、酵母属(Saccharomyces spp)、脉胞菌属(Neurospora spp)),昆虫 细胞(例如灰翅夜蛾属(Spodoptera spp))，哺乳动物细胞(例如COS细胞、CH0细胞)，植 物细胞。根据本发明的另外的方面，提供了包含含有赋形剂或载体的根据本发明的多肽的 药物组合物。在本发明的优选的实施方案中所述药物组合物与另外的治疗剂组合。当被施用时，本发明的药物组合物以药学上可接受的制剂被施用。这种制剂可常 规地含有药学上可接受的浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体和任选的其他治疗剂。本发明的药物组合物可通过任何常规的途径被施用，包括注射。施用和使用可以例如是□服的、静脉内的、腹膜内的、肌肉内的、腔内的、关节内的、皮下的、局部(眼部)的、 皮肤的(例如脂溶性的渗入皮肤或粘膜的乳膏)、经皮的或鼻内的。可以以有效的量施用本发明的药物组合物。“有效的量”是单独或与另外的剂量或 协同的药物一起产生所期望的响应的药物/组合物的量。这可仅包括暂时性地减缓疾病发 展，尽管更优选地，其包括永久地停止疾病的发展。这可通过常规方法监测或可根据诊断学 方法监测。向受治疗者施用的药物组合物的剂量可根据不同的参数尤其是根据所使用的施 用的方式和受治疗者的状况(即，年龄、性别)来选择。当施用时，以药学上可接受的量并 以药学上可接受的组合物来应用本发明的药物组合物。当用于药品中时，盐应当是药学上 可接受的，但非药学上可接受的盐可被常规地用于制备其药学上可接受的盐并且不被排除 在本发明的范围之外。这种药理学和药学上可接受的盐包括但不限于从下列酸所制备的那 些氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、柠檬酸、富马酸、丙二酸、琥珀 酸以及类似酸。而且，药学上可接受的盐可被制备为碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾或钙
Trrt. o如果需要，药物组合物可以是与药学上可接受的载体组合的。如本文所用的，术语 “药学上可接受的载体”意指适于施用于人类的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释 剂或包封物质。术语“载体”意指天然或合成的有机或无机的成分，活性成分与其组合以促 进应用。药物组合物的组分也能够以没有显著损害所期望的药物功效的相互作用的方式与 本发明的分子共混以及彼此共混。药物组合物可含有适当的缓冲剂，包括醋酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。药物组合物任选地还可含有适当的防腐剂，例如氯化苯甲烃铵、三氯叔丁醇、尼 泊金类和硫柳汞。药物组合物可方便地被制备为单位剂型并且可通过药学领域熟知的方法中任一 种来制备。所有的方法包括使活性剂与组成一种或多种助剂的载体联合的步骤。通常组合 物通过使活性化合物均勻并且紧密地与液体载体、精细分离的固体载体或两者联合并且之 后如果必须，将产品成型来制备。适用于口服施用的组合物可被制备为分离的单位，例如胶囊、片剂、锭剂，其每一 种含有预定量的活性化合物。其他的组合物包括含水液体或不含水液体中的悬浮液，例如 喷雾、酏剂或乳液。适用于胃肠外施用的组合物常规包含无菌的含水或非含水制剂，其优选地与受 体的血液等渗。这种制剂可根据使用适当的分散剂或增湿剂以及悬浮剂的已知方法来配 制。无菌的可注射的制剂还可是溶于无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注 射的溶液或悬浮液，例如溶于1，3_ 丁二醇的溶液。可被使用的可接受的溶剂是水、林格溶 液和等渗的氯化钠溶液，此外，无菌的不挥发的油被常规用作溶剂或悬浮介质。为了这一 目的可使用任何温和的不挥发的油，包括合成的单甘油酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如 油酸可被用于可注射的制剂。适用于口服、皮下、静脉内、肌肉内等等施用的载体制剂可在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿药学)，Mack Publishing Co. ,Easton, PA中找到。根据本发明的另外的方面，提供了治疗患有从促红细胞生成素激动剂的施用受益的病况的人类受治疗者的方法，其包括施用有效的量的至少一种根据本发明的多肽。在本发明的优选的方法中所述多肽被静脉内施用。在本发明的可选的优选的方法中所述多肽被皮下施用。在本发明的另外的优选的方法中所述多肽被以两天的间隔施用；优选地，所述多 肽被以每隔一周、两周或一个月的间隔施用。在本发明的优选的方法中所述病况是贫血。在本发明的优选的方法中所述病况是由慢性肾脏疾病导致的贫血。在本发明的优选的方法中所述病况是由癌的治疗中的化学治疗所导致的贫血。在本发明的优选的方法中所述病况是由类风湿性关节炎的治疗中的化学治疗所 导致的贫血。在本发明的优选的方法中所述病况是由AIDS的治疗中的化学治疗所导致的贫血。根据本发明的一个方面，提供了根据本发明的多肽在制备用于治疗贫血的药物中 的用途。在本发明的另外的优选的实施方案中所述多肽被以两天的间隔施用；优选地，所 述多肽被以每隔一周、两周或一个月的间隔施用。在本发明的优选的方法中所述病况是由慢性肾脏疾病导致的贫血。在本发明的可选的优选的实施方案中所述病况是由癌的治疗中的化学治疗所导 致的贫血。在本发明的可选的优选的实施方案中所述病况是由类风湿性关节炎的治疗中的 化学治疗所导致的贫血。在本发明的可选的优选的实施方案中所述病况是由AIDS的治疗中的化学治疗所 导致的贫血。根据本发明的另外的方面，提供了结合根据本发明的多肽或二聚体的单克隆抗 体。优选地，所述单克隆抗体是结合多肽或二聚体但没有个别地特异性结合促红细胞 生成素或促红细胞生成素受体的抗体。单克隆抗体结合通过本发明的多肽或包含本发明的多肽的二聚体而呈递的构象 抗原。在本发明的另外的方面，提供了制备产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞 系的方法，其包括下列步骤i)使用含有至少一种根据本发明的多肽的免疫原使免疫活性的哺乳动物免疫；ii)将免疫的免疫活性的哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细 胞；iii)根据对(i)的多肽的结合活性筛选通过步骤(ii)的杂交瘤细胞产生的单克 隆抗体；iv)培养杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；以及v)从培养上清液获得单克隆抗体。优选地，所述免疫活性的哺乳动物是小鼠。可选择地，所述免疫活性的哺乳动物是大鼠°使用杂交瘤细胞生产单克隆抗体是本领域中熟知的。用于产生单克隆抗体 的方法由 Kohler 和 Milstein 于 Nature 256,495-497(1975)中以及由 Donillard 和 Hoffman, “ Basic Facts about Hybridomas ( ^T^^^WS^ff % ) " T Compendium of Immunology V. II Schwartz编，1981中公开，它们通过引用并入。根据本发明的另一个方面提供了通过根据本发明的方法获得的或可获得的杂交 瘤细胞系。根据本发明的另一个方面提供了诊断检验以在生物样品中检测根据本发明的多 肽，其包括i)提供有待检验的分离的样品；ii)将所述样品与结合根据本发明的多肽的配体接触；以及iii)检测所述样品中所述配体的结合。在本发明的优选的实施方案中所述配体是抗体，优选地，单克隆抗体。这一说明书的整个描述和权利要求中，词“包含(comprise) ”和“含有”以及词的 变体例如“包含(comprising) ”和“包含(comprises) ”意指“包括但不限于”并且不意图 (并且不)排除其他的部分、添加剂、成分、整数或步骤。这一说明书的整个描述和权利要求中，除非上下文另外要求，单数包含复数。尤其 是当使用不定冠词时，除非上下文另外要求，说明书应被理解为涵盖复数以及单数。连同本发明的特定的方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、表征、化合物、化 学部分或基团应被理解为除非与其矛盾，则可用于本文描述的任何其他的方面、实施方案 或实施例。现在将仅通过实施例并引用下列附图来描述本发明的实施方案图la是编码用于在哺乳动物细胞中表达的EP0-Ll-EP0rEC (EP0经由(G4S)4与 EPOrEC连接)的核酸序列(核酸序列长度=1299bp，包含信号序列)。序列含有以粗体 小写字体形式的信号序列*是指终止密码子；图lb氨基酸序列(没有信号序列的长度= 406aa)。信号序列以粗体显示；图2a是编码用于在细菌细胞中表达的EP0-Ll-EP0rEC (EP0经由(G4S) 4与 EPOrEC连接)的核酸序列(核酸序列长度=1242bp)。粗体字母是指Xhol和6x组氨酸残 基*是指终止密码子，以粗斜体表示ATG起始密码子；图2b氨基酸序列(长度=414aa)；图3a是编码用于在哺乳动物细胞中表达的EP0-L2-EP0rEC (EP0经由(G4S) 3与 EPOrEC连接)的核酸序列(核酸序列长度=1284bp，包含信号序列)。核苷酸和蛋白序 列代表在哺乳动物细胞系中表达的伴随有信号序列的全序列。序列含有以粗体小写字体形 式的信号序列。*是指终止密码子；图3b氨基酸序列(没有信号序列的长度=401aa)。信 号序列以粗体显示；图4a是编码用于在细菌细胞中表达的EP0-L2-EP0rEC (EP0经由(G4S) 3与 EPOrEC连接)的核酸序列(核酸序列长度=1227bp)。核苷酸和蛋白序列代表在大肠杆 菌(E. coli)中表达的具有6X组氨酸标签而没有信号序列的全序列。粗体字母是指Xhol和 6x组氨酸残基。*是指终止密码子。以粗斜体表示ATG起始密码子，图4b氨基酸序列(长 度=409aa)；
图5a是编码用于在哺乳动物细胞中表达的EP0的核酸序列(核酸序列长度= 579bp，包含信号序列)。核苷酸和蛋白序列代表在哺乳动物细胞系中表达的伴随有信号序 列的全序列。序列含有以粗体小写字体形式的信号序列*是指终止密码子；图5b氨基酸 序列(没有信号序列的长度=166aa)。信号序列以粗体显示。图6a是编码用于在细菌细胞中表达的EP0的核酸序列(核酸序列长度= 522bp)。核苷酸和蛋白序列代表在大肠杆菌中表达的具有6X组氨酸标签的全序列。粗体 字母是指Xhol和6x组氨酸残基。*是指终止密码子。以粗斜体表示ATG起始密码子；图 6b氨基酸序列(长度=174aa)；图7a是编码在哺乳动物细胞中表达的EPOrEC的核酸序列(核酸序列长度= 732bp，包含信号序列)。核苷酸和蛋白序列代表在哺乳动物细胞系中表达的伴随有信号序 列的全序列；图7b氨基酸序列(没有信号序列的长度=220aa)。信号序列以粗体显示；图8a是编码在细菌细胞中表达的EPOrEC的核酸序列(核酸序列长度=684bp)。 核苷酸和蛋白序列代表在大肠杆菌中表达的具有6X组氨酸标签的全序列。粗体字母是指 Xhol和6x组氨酸残基。*是指终止密码子。以粗斜体表示ATG起始密码子；图8b氨基酸 序列(长度=228aa)；图9a)PCR被用于产生由适合的限制性位点(包含在引物Rl_4中)侧翼的所感 兴趣的基因组成的DNA。b)PCR产物于连接体区的任一侧被连接至适合的载体中。c)之后 将构建体修饰以引入正确的连接体，其不含有任何所不需要的序列(即非天然的限制性位占).
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图10a)寡核苷酸被设计以部分地形成具有独特重叠的双链区，当被退火并且加 工时，将编码具有侧翼区的连接体，其将退火至配体和受体，b)使用“大引物”和末端引物 (R1和R2)进行PCR以产生LR融合基因。R1和R2引物被设计以引入有用的侧翼的限制性 位点以便连接至靶载体中；图11说明了 EP0融合蛋白的蛋白质印迹分析。表达EP0和EP0嵌合构建体的CH0 flpln稳定细胞系的蛋白质印迹分析，道1 = 3B2 ；道2 = 3B2 ；道3 = EP0 ；道4 = 3A1 ；道 5 =模拟介质。A =非还原性条件；B =还原条件；图12说明了与人类EP0相比EP0融合蛋白3A1的活性。图12A显示TF-1细胞增 殖测定中对EP0国际标准品的剂量响应；显示在TF-1细胞增殖测定中对AFT-EPO 3A1的剂 量响应；图13是显示TF-1细胞增殖测定中对EP0国际标准品的剂量响应的图示；图14是显示TF-1细胞增殖测定中对AFT-EP0融合蛋白(3A1)的剂量响应的图 示；图15是显示与未处理的阴性对照和EP0阳性对照相比，3A1对％网状细胞的影响 的图示；图15是显示与未处理的阴性对照和EP0阳性对照相比，3A1对血红蛋白计数(g/ dL)的影响的图示。材料和方法体外检验对EP0的体外生物测定是本领域熟知的。这些测定测量EP0诱导的对增殖的刺激和/或表达EP0R的细胞的分化。一些测定使用骨髓作为EP0响应细胞的来源测量红细胞 系的集落形成。其他生物测定使用3H-胸苷测量增殖或通过测量悬浮液培养基中放射性铁 向红血蛋白的结合来测量分化。EP0响应肿瘤细胞系(TF1细胞)或用EP0R转化的细胞已 经被用于检验EP0激动剂活性。体内检骑对促红细胞生成素的体内测定是本领域中熟知的并且是以在动物模型例如大鼠 中通过红细胞形成的外源EP0刺激为基础的，其中红细胞系先祖库已经由缺氧、出血或细 胞毒类药物扩展。响应通常通过放射性铁向脾或红细胞的结合来测量。一种这样的检验被称为超低氧红细胞增多症小鼠测定，并且是检验重组EP0的工 业标准(参见 Coles 等人 Nature 191 :1065，1961)。免疫检骑测量EP0对多克隆和单克隆抗体的结合的免疫测定是本领域已知的。商业上可得 的EP0抗体可用于检测样品中的EP0并且还被用于竞争性抑制研究。例如，单克隆抗体可 在 http://www.ab_direct.com/index AbD Serotec 获得。融合蛋白的重组牛产融合蛋白的组分由使用如下的引物的PCR产生被设计以退火至配体或受体并将 用于克隆的适合的限制性位点引入靶载体(图8a)。用于PCR的模板包含靶基因并且从 IMAGE克隆、cDNA库或从委托合成的基因获得。一旦具有适当的侧翼限制性位点的配体和 受体基因被合成，之后这些被连接在靶载体中连接体区的任何一侧(图8b)。之后通过将委 托合成长度的DNA插入连接体区任一侧的两个独特的限制性位点之间，通过经由ssDNA修 饰技术的连接体区的突变，通过将引物双链体/多链体插入适合的限制性位点之间或通过 PCR修饰，将构建体修饰以含有正确的连接体而没有侧翼限制性位点(图8c)。可选择地，被设计以退火至所选择的配体或受体结构域的具有侧翼序列的连接 体，通过产生寡核苷酸双链体而被初始合成并且其被加工以产生双链的DNA(图9a)。之后 使用连接体序列作为“大引物”，即针对配体和受体的与“大引物”所退火至的末端相对的末 端设计的引物，并用配体和受体作为模板进行PCR。末端引物被设计以具有用于连接至所选 择的表达载体的适合的限制性位点(图％)。融合蛋白的表达和纯化在适当的体系(例如哺乳动物CH0细胞、大肠杆菌)中进行表达，并且其取决 于产生EP0融合基因的载体。之后使用不同的方法分析表达，其可包括本领域中熟知的 SDS-PAGE、天然PAGE、蛋白质印迹、ELISA中的一种或多种。在75cm2瓶中培养稳定转染的CHO Flp-In细胞系约3_4天，于此点采集样品用以 分析。将样品与等体积的laemmli上样缓冲液在25mM DTT存在或不存在的情况下混合并 且煮沸5分钟。将样品在15% (w/v)的双丙烯酰胺凝胶上分离并转移至PVDF膜。在溶于 PBS-0. 05% (v/v)吐温20的5% (w/v)牛乳蛋白中封闭后，使用特异性抗EP0抗体与轭合 二抗的辣根过氧化物酶(HRP) —起进行样品检测。通过使用HRP检测试剂盒的对照相胶片 的化学发光来显影；参见图11。一旦达到适合的表达水平，就大规模表达RL融合物以产生足以纯化并之后分析 的蛋白。使用一种或多种层析步骤的适当组合进行纯化，所述层析步骤例如离子交换层析、疏水相互作用层析、硫酸铵沉淀、凝胶过滤、尺寸排阻和/或亲和层析(使用镍/钴_树脂， 固定抗体的树脂和/或固定配体/受体的树脂)。使用包括Bradford测定、SDS-PAGE、天 然PAGE、蛋白质印迹、ELISA中的一种或多种的不同方法分析纯化的蛋白。LR-融合物的表征变性PAGE、天然PAGE凝胶和蛋白质印迹被用于分析融合多肽并且使用对LR融合 物非构象敏感的抗体进行的蛋白质印迹。可从技术诸如使用Superose G200分析柱的尺寸 排阻层析和分析性超速离心的技术获得天然溶解状态分子量信息。统计学如果两组的方差是正态分布用学生检验(Student' s test)对比，或者如果不是 正态分布用学生_萨脱斯威特检验(Student-Satterthwaite ‘ s test)。用F检验来检验 分布。使用单因素方差分析比较3组或更多组的平均数，如果显著的水平为p<0. 05，用邓 奈特检验进行个体比较。所有统计性检验两侧5%显著水平，并且不对漏失值进行差补。体外牛物测定细胞制备在体外TF-1细胞增殖模型中测定3A1的生物活性。从液氮储存取出TF-1细胞 (ATCC，批号5003310)并放入37°C水浴2分钟。之后将瓶中内容物转移至含有9ml培养 基(溶于RPMI的10% FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100 y g/ml链霉素、2ng/ mlGM-CSF)的15ml试管。将细胞于123Xg离心5分钟；将细胞团重悬于培养基中并且将细 胞密度调整至4xl04细胞/ml。细胞培养在C02培养箱(5% C02，37°C )中于培养基中以2xl04-5xl04细胞/ml的密度培养 细胞。每周进行两次传代确保细胞密度不超过7xl05细胞/ml。通过锥虫蓝不相容评估细 胞活力。在测定前将细胞用PBS通过以约125xg旋转5分钟来清洗3次。之后将细胞团重 构于测定培养基(溶于RPMI的10% FBSU00U/ml青霉素、100 u g/ml链霉素、2mM L-谷氨 酰胺)中并将细胞密度调整至2xl05细胞/ml。标准品/样品制备将EP0(国际标准品，NIBSC，批号88/574)在测定培养基中重构至1 P g/ml (120IU/ ml)的浓度，分为100 yl等份并储存于-80°C。每天测定时从冰箱取出1瓶并制备工作浓度。TF-1生物测定将50 ill的每种检测的蛋白放入96孔微板的适当的孔中。之后加入50 u 1的细 胞悬浮液并且将板温和振荡以允许细胞和标准品/样品混合。对照孔仅含有测定培养基和 细胞悬浮液(50iil+50ia)并且空白孔仅有测定培养基(100 ill)。在C02培养箱(5% co2， 37 °C )中将细胞暴露于不同浓度的检测蛋白72小时，并且之后向每孔加入10 yl的MTT。 孵育(5% C02，37°C )4小时后加入增溶缓冲液(10(^1/孔)，并且将板在C02培养箱中静 置过夜。之后于570nm和650nm(参考)读取吸光率。结果计算使用具有下列转换的Gen5软件分析所有原始数据1.从于570nm获得的结果减去来自参考(650nm)的结果
2.之后从暴露于不同浓度的检测蛋白的细胞获得的结果减去从对照获得的结果3.将从步骤2获得的结果作图为0D/0Dmax(% )的比以各自的剂量响应曲线(对数，4参数)为基础，计算每种蛋白的EC5Q (产生最大 响应的50%的浓度)的值。体内牛物测定如下文所详述的在Normocythaemic小鼠模型中检测EP0-LR融合蛋白(3A1)。 Normocythaemic小鼠模型是以在小鼠中对网状细胞产生的刺激的测量为基础的。此外，该 模型可被用于检测促红细胞生成素(EP0)或其EP0模拟蛋白的生物学活性。动物类型32 B6D2Fl/01aHsd小鼠，雌性，研究开始时6-9周大。每个处理使用4只小鼠。动物来源于来 自HarlanWinkelmann GmbH的可控的全屏障的维持繁育系统(SPF)。测定步骤开始时，将小鼠随机分配为每笼4只小鼠。将这些动物通过尾部图色(每 笼一个标记)加以标记以便鉴别。将动物用0. 5mL的适当的处理(每笼一种溶液)皮下注 射并放入新的笼中。以装有处理小鼠的每笼含有每种不同处理的一只小鼠的方式组合小 鼠。注射后四天，从尾部静脉收集血液并且通过流式细胞仪测定网状细胞的数目。实施例1以IMAGE克隆获得EP0基因并且亚克隆至表达载体pET21a+ (用于大肠杆菌表达) 和pSecTag(用于哺乳动物表达)中。PCR被用于产生含有侧翼有用于向载体插入的适合的 限制性位点的EP0基因的DNA。对于细菌表达来说，所使用的引物是用于组氨酸标签的蛋白的NdeEP0F(5，-aatta attcatatggccccaccacgcctcatctg-3，)和 EP0XhoR(5，-aattctcgagtctgtcccctgtcctgcag-3，)以及用于未标签的蛋白的 NdeEPOF 和 EP0*XhoR (5，-aattctcgagctatctgtcccctgtcctgc ag-3，)。之后将PCR产物连接于pET21a+中的Ndel和Xhol位点之间。所得的克隆通过测 序确认。在用pET21a+EP0+/_His质粒转化的大肠杆菌BL21 (DE3) RIPL细胞中进行来自大 肠杆菌的EP0的表达。用IPTG诱导表达并且通过使用抗EP0的抗体的蛋白质印迹确认(图 2X)。对于哺乳动物表达来说，所使用的引物是NheEPOF ( 5 '-aaatttgctagccac catgggggtgcacgaatgtcctg-3 ‘)禾口 epo*H3R (5 ‘-aattaagcttctatctgtcccctgtcctgca g-3 ‘)。
之后将PCR产物连接于pSecTag中的Nhel和Hindlll位点之间。实施例2EP0R是委托合成的基因/获得自胎儿肝脏cDNA文库并且被亚克隆至表达载体 pET21a+(用于大肠杆菌表达)和pSecTag(用于哺乳动物表达)中。PCR被用于产生含有 侧翼有用于向载体插入的适合的限制性位点的EP0基因的DNA。对于细菌表达来说，所使用的引物是用于组氨酸标签的蛋白的NdeE PORFor (5' -gcgcataCATATGgcgcccccgcctaacctccc-3')禾口 EP0RXhoRev2(5‘ -g cgcCTCGAGCGTCAGCAGCGACACAGGCT-3，)以及用于未标签的蛋白的 NdeEPOF 和 EP0R*XhoRev2 ( 5'-gcgcCTCGAGtcaCGTCAGCAGCGACACAGGCT -3，)。之后
将PCR产物连接于pET21a+中的Ndel和Xhol位点之间。所得的克隆通过测序确认。对于哺乳动物表达来说，所使用的引物是NheEPORFor (5，-gcgcGCTAGCcaccatggaccacctcggggcgtc-3，)和 EP0RHindRev2(5， -gcgcAAGCTTtcaCGTCAGCAGCGACACAGGCT-3，)。 之后将PCR产物连接于pSecTag中的Nhel和Hindlll位点之间。实施例3通过将下列三个寡核苷酸一起退火以形成寡核苷酸的多链体来合成在一个末端 具有与EP0互补的侧翼序列而在另一个末端具有与EP0R互补的侧翼序列的(G4S)3连接体 EP01ink3F(5，-aggtagtggtggcggaggtagcggtggcgg-3，)、EP01ink3Rl (5，-gggaggttaggcgg gggcgcagaacctccgccaccgctacc-3，)和 EP01 ink3R2 (5，-tccgccaccactacctccgccacctctgtc ccctgtcctgcag-3')。这一多链体之后被加工以产生可被用作PCR中的引物的双链DNA。之后用弓丨物 BamNheEPOFor (5，-aaatttggatccgctagccaccatgggggtgcacgaatgtcct g-3，)、EP0RHindRev2 (5，-gcgcAAGCTTtcaCGTCAGCAGCGACACAGGCT_3，)和之前产生的连接体 “大引物”以及作为模板的EP0和EP0R进行PCR。这产生侧翼有用于连接至哺乳动物表达 载体pSecTag中的适合的限制性位点(Nhel和Hindlll)和用于连接至噬菌体载体M13mpl8 中的适合的限制性位点(BamHI和Hindlll)的EP0-(G4S) 3_EP0rEC基因。对于细菌表达来说，通过使用引物NdeEP0F(5，-aattaattcatatggccccacc acgcctcatctg-3，)禾口 EP0R*XhoRev2 ( 5，-gcgcCTCGAGtcaCGTCAGCAGC GACACAGGCT -3')的 PCR 用 Ndel 和 *XhoI 侧翼区产生 EP0-(G4S)3-EP0rEC 基因。之 后其被连接至pET21a+。实施例4图11说明EP0受体融合蛋白的两个实例3A1和3B2的表达和检测。3A1和3B2都 运行在75和lOOkDa之间。如对糖基化蛋白所预期的EP0运行在37和45kDa之间。与人类EP0相比测定3A1的生物活性并且说明于图12、13和14中。实施例5对3A1所检测的剂量范围是从每kg动物体重2. 5至150ug(与标准EP0相等的质 量)。图15和16显示给药4天之后3A1对网状细胞和血红蛋白的体内活性。
权利要求
一种核酸分子，包含编码具有促红细胞生成素活性的多肽的核酸序列，其中所述多肽包含与促红细胞生成素受体的促红细胞生成素结合结构域直接或间接连接的促红细胞生成素或者其部分。
2.一种融合多肽，包含与促红细胞生成素受体的促红细胞生成素结合结构域直接或 间接连接的促红细胞生成素或其活性结合部分的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的融合多肽，其中促红细胞生成素通过肽连结体与促红细胞生成 素受体的结合结构域连接。
4.如权利要求2所述的融合多肽，其中所述肽连接分子包含至少一个拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser。
5.如权利要求4所述的融合多肽，其中所述肽连接分子包含2、3、4、5或6个拷贝的肽 Gly Gly Gly Gly Ser。
6.如权利要求5所述的融合多肽，其中分子由3个拷贝的肽GlyGlyGly Gly Ser组成。
7.如权利要求5所述的融合多肽，其中所述肽连接分子由4个拷贝的肽GlyGly Gly Gly Ser 组成。
8.如权利要求2-7中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽不包含肽连接分子，而是 促红细胞生成素和促红细胞生成素受体的促红细胞生成素结合结构域的直接融合物。
9.一种核酸分子，包含选自下列的核酸序列i)如SEQID NO 1中所表示的核酸序列；ii)如SEQID NO 3中所表示的核酸序列；iii)如SEQID NO 5中所表示的核酸序列；iv)如SEQID NO 7中所表示的核酸序列；或v)包含在严格杂交条件下与SEQID NO :1、3、5或7杂交并且编码具有促红细胞生成 素受体调节活性的多肽的核酸序列的核酸分子。
10.如权利要求9所述的核酸分子，其中所述多肽是激动剂。
11.如权利要求9所述的核酸分子，其中所述多肽是拮抗剂。
12.如权利要求9-11中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含如SEQID NO 1中所表示的核酸序列。
13.如权利要求9-11中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含如SEQID NO 3中所表示的核酸序列。
14.如权利要求9-11中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含如SEQID NO 5中所表示的核酸序列。
15.如权利要求9-11中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含如SEQID NO 7中所表示的核酸序列。
16.一种多肽，由如权利要求1或9-15中任一项所述的核酸编码。
17.一种多肽，包含选自下列的氨基酸序列i)如SEQID NO 2中所表示的氨基酸序列；ii)如SEQID NO 4中所表示的氨基酸序列；iii)如SEQID NO 6中所表示的氨基酸序列；iv)如SEQID NO 8中所表示的氨基酸序列；v)如SEQID NO 17中所表示的氨基酸序列；vi)如SEQID NO 18中所表示的氨基酸序列；或 其中所述多肽具有促红细胞生成素受体调节活性。
18.如权利要求17所述的多肽，其中所述多肽是激动剂。
19.如权利要求17所述的多肽，其中所述多肽是拮抗剂。
20.一种多肽，包含如SEQ ID NO :2中所表示的氨基酸序列。
21.一种多肽，包含如SEQ ID NO :4中所表示的氨基酸序列。
22.—种多肽，包含如SEQ ID NO :6中所表示的氨基酸序列。
23.一种多肽，包含如SEQ ID NO :8中所表示的氨基酸序列。
24.—种多肽，包含如SEQ ID NO 17中所表示的氨基酸序列。
25.一种多肽，包含如SEQ ID NO 18中所表示的氨基酸序列。
26.一种同型二聚体，由两个多肽组成，其中所述多肽中的每一个包含i)包含促红细胞生成素或其受体结合结构域的第一部分，任选地通过肽连接分子连接至ii)包含促红细胞生成素受体的至少一个促红细胞生成素结合结构域的第二部分。
27.如权利要求26所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :2。
28.如权利要求26所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :4。
29.如权利要求26所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :6。
30.如权利要求26所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :8。
31.如权利要求26所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :17。
32.如权利要求26所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :18。
33.一种载体，包含如权利要求1或9-15所述的核酸分子。
34.一种细胞，用如权利要求1或9-15中任一项所述的核酸分子或如权利要求33所述 的载体转染或转化。
35.如权利要求34所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
36.如权利要求34所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
37.一种药物组合物，包含如权利要求2-8或16或17-25中任一项所述的多肽，包含赋 形剂或载体。
38.如权利要求37所述的药物组合物，其中所述组合物与另外的治疗剂组合。
39.一种治疗患有从促红细胞生成素激动剂的施用受益的病况的人类受治疗者的方 法，包括施用有效的量的至少一种如权利要求2-8或16或17-25中任一项所述的多肽。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述病况是贫血。
41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述病况是由慢性肾脏疾病导致的贫血。
42.如权利要求39或40所述的方法，其中所述病况是由癌的治疗中的化学治疗所导致 的贫血。
43.如权利要求39或40所述的方法，其中所述病况是由类风湿性关节炎的治疗中的化 学治疗所导致的贫血。
44.如权利要求39或40所述的方法，其中所述病况是由AIDS的治疗中的化学治疗所 导致的贫血。
45.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述多肽被静脉内施用。
46.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述多肽被皮下施用。
47.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述多肽以两天的间隔被施用。
48.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述多肽每隔一个星期被施用。
49.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述多肽每隔两个星期被施用。
50.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述多肽每隔一个月被施用。
51.如权利要求2-8或16或17-25中任一项所述的多肽在制备用于治疗贫血的药物中 的用途。
52.一种单克隆抗体，结合如权利要求2-8、16、17-25或26-32中任一项所述的多肽或二聚体。
53.如权利要求52所述的单克隆抗体，其中所述抗体结合所述多肽或二聚体但没有个 别地特异性结合促红细胞生成素或促红细胞生成素受体。
54.一种制备产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，包括下列步骤i)使用含有至少一种根据本发明的多肽或其片段的免疫原使免疫活性的哺乳动物免疫；ii)将所述免疫的免疫活性的哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；iii)根据对(i)的多肽的结合活性筛选通过步骤(ii)的杂交瘤细胞生产的单克隆抗体；iv)培养所述杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；以及v)从培养上清液获得所述单克隆抗体。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述免疫活性的哺乳动物是小鼠或大鼠。
56.一种杂交瘤细胞系，通过如权利要求54或55所述的方法获得或可获得。
57.一种诊断检验，以在生物样品中检测根据本发明的多肽，包括i)提供有待检验的分离的样品；ii)将所述样品与结合如权利要求2-8、16和17-25中任一项所述的多肽的配体接触；以及iii)检测所述样品中所述配体的结合。
58.如权利要求57所述的检验，其中所述配体是抗体。
59.如权利要求58所述的检验，其中所述抗体是单克隆抗体。
全文摘要
本公开涉及促红细胞生成素(EPO)融合多肽；编码所述多肽的核酸分子和使用所述多肽治疗的方法。
文档编号A61K38/18GK101878224SQ200880110331
公开日2010年11月3日 申请日期2008年8月4日 优先权日2007年8月3日
发明者乔恩·塞耶斯, 彼得·阿蒂米克, 理查德·罗斯 申请人:埃斯特瑞恩有限公司