Mva用于治疗前列腺癌的用途的制作方法

专利名称：Mva用于治疗前列腺癌的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用编码肿瘤相关抗原(特别是前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸 性磷酸酶(PAP))的MVA病毒来预防和治疗癌症(特别是前列腺癌)。
背景技术：
改良痘苗安卡拉(ModifiedVaccinia Ankara, MVA)病毒与痘苗病毒(vaccinia virus)，即痘病毒科(Poxviridae)中的正痘病毒属(Orthopoxvirus)的一个成员有关。 MVA是通过痘苗病毒安卡拉株(CVA)在鸡胚成纤维细胞上连续传516代生成的(参见综述 Mayr, A. , et al. Infection 3:6-14(1975))。作为这些长期传代的结果，所得MVA病毒的 基因组中删除了其基因组序列的约31kb，而且因此记载为在复制方面宿主细胞高度受限于 鸟类细胞(Meyer, H. et al.，J. Gen. Virol. 72 :1031_1038 (1991))。在多种动物模型中显示 了所得 MVA 是显著无毒力的(Mayr，Α. & Danner，K.，Dev. Biol. Stand. 41 :225_34 (1978))。 另外，已经在临床试验中作为针对人天花病来免疫的疫苗测试了此MVA株(Mayr etal., Zbl. Bakt. Hyg. I，Abt. Org. B 167 :375_390 (1987) ；Stickl et al.，Dtsch. med. Wschr. 99 2386-2392(1974))。这些研究涉及120，000人以上，包括高风险患者，而且证明了，与基于 痘苗的疫苗相比，MVA具有降低的毒力或传染性，同时它诱导优良的、特异性的免疫应答。在 随后的几十年里，MVA被改造成用作病毒载体(用于重组基因表达)或重组疫苗(Sutter， G.et al. , Vaccine 12:1032-40(1994))。尽管Mayr等人在二十世纪七十年代里证明了 MVA在人和哺乳动物中是高度减 毒和无毒力的，某些调查人员报告了 MVA在哺乳动物和人细胞系中不是完全减毒的，因为 在这些细胞中可存在残余复制(Blanchard et al.，J GenVirol 79:1159-1167(1998); Carroll & Moss, Virology 238 :198_211(1997) ；Altenberger，U. S. Pat. No. 5，185，146 ； Ambrosini et al. ,J Neurosci Res 55(5) :569 (1999))。假设这些出版物中报告的结果是 用MVA的各种已知株获得的，因为所使用的病毒在它们的特性方面，特别是在它们在各种 细胞系中的生长行为方面是本质上不同的。出于各种原因，包括与在人类中使用有关的安 全考虑，此类残余复制是不希望有的。具有增强的安全性特征、用于开发更安全的产品(诸如疫苗或药品)的MVA株已 有记载。参见U. S. Pat. Nos. 6，761，893和6，193，752。此类株能够在非人细胞和细胞系中， 尤其在鸡胚成纤维细胞(CEF)中生殖性复制，但是不能在已知容许已知痘苗株复制的某些 人细胞系中生殖性复制。这些细胞系包括人角质形成细胞细胞系HaCat (Boukamp et al. J Cell Biol 106(3) :761_71 (1988))、人子宫颈腺癌细胞系 HeLa(ATCC No. CCL-2)、人胚肾 细胞系 293(ECACC No. 85120602)、和人骨骨肉瘤细胞系 143B(ECACC No. 91112502)。此类 病毒株也不能在体内生殖性复制，例如在某些小鼠品系中，诸如转基因小鼠模型AGR 129 中，该模型是重度免疫受损的且对复制型病毒高度易感的。参见U. S. Pat. Nos. 6，761，893。 一种这样的MVA株及其衍生物和重组体，称作“MVA-BN ”，已有记载。参见U. S. Pat. Nos. 6，761，893 和 6，193，752。MVA和MVA-BN 已经各自被改造成用作病毒载体(用于重组基因表达)或重组疫苗。参见例如 Sutter，G. et al. , Vaccine 12 1032-40 (1994) ；U. S. Pat. Nos. 6，761，893 和 6，193，752。癌症相关疾病是全世界死亡率和发病率的一项首要原因。例如，仅在美国，估计 六个人中有一个罹患前列腺癌。此外，尸检研究显示已知显著比例的男性人群早在30岁 就携带该疾病，尽管处于其最早的非恶性阶段。参见例如Taichman et al. , JCI 117(9) 2351-2361 (2007) ；Webster et al.，J. Clin. Oncol. 23 :8262_8269 (2005)。癌症免疫疗 法的新近办法包括疫苗接种肿瘤相关抗原。在某些情况中，此类办法包括使用投递系统 来促进宿主对肿瘤相关抗原的免疫应答。此类投递系统包括重组病毒载体，以及基于细 胞的疗法。参见例如 Harrop et al. , Front. Biosci. 11 804-817 (2006) ；Arlen et al.， Semin. Oncol. 32 549-555 (2005) ；Liu et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(suppl. 2) 14567-14571 (2004)。MVA已经在转移性结肠直肠癌、转移性肾癌和激素不应性前列腺癌患 者的临床试验中用作5T4癌胚抗原的疫苗佐剂。Amato，RJ.，Expert Opin. Biol. Ther. 7 (9) 1463-1469(2007)。在已经的肿瘤相关抗原中有前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶 (PAP)。参见例如 Taichman et al.，JCI 117(9) 2351-2361 (2007) ；Webster et al.， J. Clin. Oncol. 23 =8262-8269(2005)。PSA是由前列腺生成的，而且以升高的量见于具有 前列腺癌、良性前列腺增生、或前列腺感染或炎症的男性的血液中。PSA已经被鉴定为癌症 治疗的由细胞介导的免疫疗法办法的靶物。参见例如McNeel，D. G.，Curr. Opin. Urol. 17 175-181 (2007) ；Nelson W. G.，Curr. Opin. Urol. 17 157-167 (2007)。PAP 是一种在血液中 测量到的酶，其水平在具有已经侵入或转移别处的前列腺癌的患者中升高。除非肿瘤已经 或是经由局限性侵入或是经由远距离转移而扩散到解剖学上的前列腺囊以外，否则PAP不 会升高。因此，正在数项人疫苗试验中作为靶抗原调查这种前列腺肿瘤抗原，其中一些试 验获得了临床好处的证据。参见例如 McNeel, D. G.，Curr. Opin. Urol. 17 :175_181 (2007)； Waeckerle-Men et al. ,Cancer Immunol. Immunother. 66 811-821 (2006) ；Machlenkin et al. Cancer Immunol Immunother. 56(2) :217_226(2007)。已经使用重组痘苗病毒、纯化的PAP、DNA疫苗、和加载有抗原的树突细胞生成了 含有 PAP 的疫苗。Valone et al. , The Cancer Journal 7 :Suppl2 :S53_61 (2001) ；Fong et al.，J Immunol. 2001 Dec 15 ；167(12) :7150_6 ；Fong etal.，J. Immunol. 159(7) 3113-7(1997) Johnson et al. ,Vaccine 24(3) :293_303(2006) Johnson et al. ,Cancer Immunol Immunother. 56 (6) :885_95 (2007)。在一项研究中，当将经 PAP-GM-CSF 脉冲的树 突细胞注射入大鼠中时，没有检测到针对PAP的抗体(Valone et al. at S55)。在另一项研 究中，施用含有编码大鼠PAP或人PAP的基因的重组痘苗病毒不生成可测量的针对大鼠或 人PAP的抗体应答(Fong et al. (1997)at 3116-7)。在另一项研究中，在用hPAP蛋白质免 疫的动物的血清中以及在接受编码人PAP痘苗病毒疫苗接种、接着接受hPAP蛋白质作为强 化免疫接种的动物中能检测到PAP特异性IgG，但是在用编码人PAP的痘苗病毒免疫两次的 动物中检测不到(Johnson et al. (2007)at 890)。主动癌症免疫疗法依赖在癌症患者中对针对肿瘤细胞的免疫应答的诱导。对针对 广泛肿瘤相关抗原(TAA)的适应性免疫的体液和细胞这两种成分的诱导及伴随的对先天 性免疫的成分的激活对于主动免疫疗法产品的最大效能是至关重要的。具体而言，认为1型或Thl型适应性免疫(其以对生成抗原特异性IFN γ的细胞毒性T细胞(CD8T细胞)的 诱导为特征)对于抗癌症免疫疗法是重要的。尽管新近在癌症治疗中获得了进展，然而前列腺癌仍然是美国癌症患者死亡的第 二位首要原因。如此，需要这样的治疗性办法，该方法通过靶向肿瘤生长和转移的多个方面 来更好地减轻该疾病。紫杉烷(诸如帕利他塞和多西他塞)已经作为化疗用于癌症患者。参见例 如 Tannock et al.，N. Engl. J. Med. 351 1502-1512 (2004)。使用紫杉烷的化疗已经 与不同的肿瘤疫苗治疗组合，导致各种结果。参见Chu et al. , J. Immunotherapy 29: 367-380(2006) ；Machiels et al. , Cancer Res. 61 3689-3697(2001) ；Prell et al., Cancer Immunol. Immunother. 55 1285-1293 (2006) ；Arlen etal., Clinical Breast Cancer 7:176-179(2006)；及Arlen et al. ,Clinical Cancer Res. 12 1260-1269 (2006)。 关于癌症疫苗与化疗的组合的综述参见Chong et al.，Expert Opin. Phamacother. 6 1-8(2005) ；Emens et al.，Endocrine-Related Cancer 12 1-17 (2005)；及 McNeel，D. G.， Curr. Opin. Urol. 17 175-181 (2007)。如上所述，本领域需要用于癌症治疗的试剂和方法。发明概述本发明涵盖用于预防癌症和治疗癌症(包括原发性肿瘤和癌症转移)患者的方 法、试剂、和试剂盒。本发明涵盖一种用于治疗人类癌症患者的方法，包括对患者施用一种重组MVA，其 编码包含人前列腺特异性抗原(PSA)抗原的多肽和包含人前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原的 多肽。在一个实施方案中，所述MVA是MVA-BN。在一个实施方案中，所述MVA病毒包含核苷 酸序列SEQ ID NO :1和SEQ IDNO :2。在一个实施方案中，所述PSA抗原和所述PAP抗原插 入在MVA基因间区014L/015L中。在某些实施方案中，所述癌症是前列腺癌或前列腺癌转 移。在一个实施方案中，所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷之前施用的。在一 个实施方案中，所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷的同时施用的。在一个实施方案 中，所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷之后施用的。在优选的实施方案中，所述紫杉 烷是多西他塞或帕利他塞。本发明涵盖一种用于预防前列腺癌的试剂盒，包括重组MVA，其编码包含人PSA 抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及在检测到前列腺癌之前施用所述重组MVA的指令。本发明涵盖用于治疗前列腺癌的试剂盒，包括一种重组MVA，其编码包含人PSA 抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及对前列腺癌患者施用所述重组MVA的指令。本发明涵盖用于治疗癌症患者的试剂盒，包括一种重组MVA，其编码包含人PSA 抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及在用破坏肿瘤剂量的紫杉烷处理之前、同时、或之 后施用所述重组MVA的指令。本发明涵盖一种重组MVA病毒，其表达包含人PAP抗原的多肽。在一个实施方案 中，所述MVA病毒包含SEQ ID NO :2。在一个实施方案中，所述MVA是MVA-BN。本发明涵盖一种重组MVA病毒，其表达包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原 的多肽。在一个实施方案中，所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQ IDNO :1。在一个实施方案中，所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQ ID NO :2。在一个实施方案中，所述MVA是MVA-BN。本发明涵盖一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PAP抗原 的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PAP的B细胞和T细胞免疫应答。本发明涵盖一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PAP抗原 的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PAP的抗体。在一个实施方案 中，所述MVA病毒包含SEQ ID NO :2。本发明涵盖一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PSA抗原 的多肽和包含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PSA 和PAP的B细胞和T细胞免疫应答。附图简述图IA-B。MVA-BN 基因组的示意图。IA显示的是MVA-BN 基因组中六个 删除位点的位置阴影区段和字母(A至0)鉴别HindIII限制酶消化片段，而且在箭头上显 示了在MVA-BN 中所缺少的CVA序列的位置和大小。IB显示的是HindIII限制性片段 (字母A至0)和用于生成MVA-BN-PRO的IGR014L/015L位点。图2。MVA-BN-PRO病毒的示意概观。MVA-BN 基因组图(HindIII限制图，由 字母A至0表示)，粗绘在基因间区014L/015L中克隆的重组插入物PSA和PAP基因，各自 在牛痘病毒ATI启动子(ATI)的控制下。图3A-B。与MVA-BN-PRO —起温育的CT26细胞培养物的上清液中的PAP (A)和 PSA(B)检测。用MVA-BN-PRO(正方形)或MVA-BN (三角形)以所示感染复数(MOI) 感染密度为6 X IO5个细胞每孔(黑色正方形和三角形)或6E4细胞每孔(灰色正方形)的 CT26细胞。24小时后，收获细胞上清液，并分别通过PAP酶测定法和PSA ELISA来测量PAP 和PSA蛋白质水平。图4A-B。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中的抗PSA (A)和抗PAP (B)抗体应答。用 MVA-BN-PRO (白色正方形)或MVA-BN (黑色正方形)免疫动物三次(第1天、第15 天和第29天)。在处理前、第14天、第28天、和第42天收集血液样品。滴度为0. D.值比 背景(来自用TBS处理的动物的、相同稀释度的血清)高至少2倍的最后稀释度的倒数值。 显示为零的滴度在所测试的最低血清稀释度(1 50)呈阴性。 图5A-B。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中的抗PSA和抗PAP T细胞应答。将来自用 MVA-BN-PRO免疫的动物(A)和TBS对照动物(B)的脾细胞与所示浓度的来自PAP (灰色正 方形)、PSA(白色正方形)或HER2 (黑色正方形)序列的OPL —起温育。使用ImmimoSpot 分选仪对指示IFN-Y生成T细胞的斑点计数。为每一个所测试的OPL浓度呈现了来自一 式三份孔的均值和标准偏差。图6A-B。⑶4和⑶8T细胞对由MVA_BN_PR0介导的T细胞应答的贡献。用 MVA-BN-PRO免疫动物四次(第1天、第15天、第29天、和第49天)，并在最后一次处理后 六天收集脾细胞，将消减了 CD8的脾细胞(A)和消减了 CD4的脾细胞(B)与所示浓度的来 自PAP(灰色正方形)、PSA(白色正方形)或HER2(黑色正方形)序列的OPL—起温育。所 述分析是如图5所述进行的。图7A-F。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对肿瘤生长的预防。以3周时间间隔以所示TCID50的、在TBS中稀释的病毒处理动物3次。第三次处理后六周，用IXlO5个表达PSA 的E5肿瘤细胞皮内攻击动物。使用测径器每周两次测量肿瘤生长。如下计算肿瘤体积 (Lxff2)/20 7A至7E:为每个处理组报告了各小鼠中的肿瘤生长。7F:为所有处理组报告了 肿瘤大小均值和标准偏差。图8。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对肿瘤生长的预防。两项分开的实验中第29 天测量的比较。以2周时间间隔(灰色符号)用2X IO6TCID5tl的、在TBS中稀释的所示病 毒处理动物三次。最后一次处理后两周，用IX IO5个表达PSA的E5肿瘤细胞皮内攻击动 物。使用测径器每周两次测量肿瘤生长。如下计算肿瘤体积(LxW2)/2。点显示了每只动 物在肿瘤植入后第29天的肿瘤体积。来自图7所述分开的实验的匹配组的数据以黑色符 号呈现，供比较用。这里报告的这两项实验是在相似条件下进行的，除了处理时间间隔的长 度(3周对2周时间间隔)和肿瘤细胞植入时间(第三次处理后六周对两周)。图9A-F。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对肿瘤生长的治疗性遏制。BALB/c小鼠 (每组10只动物)在第1天用E6细胞(id注射IX IO5个细胞)攻击，并在第1天、第8天、 和第 15 天用 TBS(E)、MVA-BN (5X IO6 或 5X IO7TCID50 ；A 和 B)、或 MVA_BN_PR0(5X IO6 或5X IO7TCID5tl ；C和D)皮下处理。在第22天处死小鼠。小图A-E显示了各小鼠的肿瘤大 小。小图F中描绘了每个组的肿瘤大小平均值和标准偏差。使用测径器每周两次测量肿瘤 生长。如下计算肿瘤体积(LxW2)/2。误差棒代表标准偏差(SD)。

图10。用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对PAP阳性肿瘤生长的遏制。BALB/c小鼠 (每组10只动物)在第1天用CT26-PAP (静脉内注射5 X IO5个细胞)攻击，并在第4天用 TBS、MVA-BN(5 X IO7TCID50)、或 MVA_BN_PR0(2X IO6 和 5 X IO7TCID50)腹膜内处理。在第 14 天处死小鼠，并对它们的肺称重。数据点代表各小鼠的肺重量。水平棒指示每个组的肺重 量均值。图11。BALB/c或C57BL/6小鼠中诱导的抗PSA和抗PAP抗体应答。在第1天、第 15天、和第29天用5 X IO7TCID50的MVA-BN-PRO免疫雄性BALB/c和C57BL/6小鼠(每组5 只动物)。在第42天收集血液样品，并对通过ELISA合并血清的连续稀释液分析抗PSA或 抗PAP IgG的存在。滴度作为O.D.值比背景(定义为来自用TBS处理的动物的、相同稀 释度的血清)高至少2倍的最后稀释度的倒数值来计算。滴度低于所测试的最低稀释度 (< 125)的血清的数据点是任意放置在χ轴上的，出于绘图目的，将χ轴放置在比测定法的 第一稀释度(62. 5)低一个稀释度。图12。用MVA-BN-PRO处理的患者中的T细胞应答。在处理前(基础)或 MVA-BN-PRO处理后(TC3)收集来自患者J-D-1001血液的PBMC。将细胞与图上所示浓度的 PSA蛋白质、PSA交叠肽文库(0PL)、PAP蛋白质、PAP0PL、自肿瘤相关抗原(TAA)衍生的MHC I型和II型肽集合或MVA-BN —起温育40小时。通过测量所分泌的IFN- γ的ELISpot来测 定T细胞激活。对于每种刺激条件，结果表述成均值IFN-γ斑点形成细胞(SFC)每2Χ105 个PBMC。SFC值是自一式四份孔的均值减去背景而得来的。发明详述在一组体外和体内测定法中测试了表达人PSA和PAP抗原的重组 MVA (MVA-BN-PRO)。分别使用PSA检测试剂盒和磷酸酶活性功能测定法评估了这两种由 MVA-BN-PRO编码的前列腺特异性抗原(PSA和PAP)在与MVA-BN-PRO —起温育的真核细胞中的表达。使用ELISA和ELISpot测定法来监测用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对抗PSA和 抗PAP抗体及T细胞免疫应答的诱导。在PSA肿瘤模型中在预防设置和治疗设置两者中评 估了 MVA-BN-PRO的抗肿瘤活性。这些研究证明了(i)在体外细胞对MVA-BN-PRO的摄取导致PAP和PSA两者以 相似的量表达；(ii)用MVA-BN-PRO处理小鼠导致抗PSA和抗PAP体液免疫应答及Thl细 胞免疫应答；(iii)用MVA-BN-PRO处理小鼠在预防和治疗两种设置中都抑制PSA(+)肿瘤 生长；(iv)用MVA-BN-PRO处理小鼠在治疗设置中抑制PAP(+)肿瘤生长；(ν)在人体中， MVA-BN-PRO处理提高抗PSA T细胞和抗PAP T细胞两者的水平；及(vi)MVA-BN-PRO处理 在人体中导致针对其它肿瘤抗原的T细胞应答的扩散。如此，MVA-BN-PRO通过触发抗原特 异性体液应答和细胞Thl型应答而激活免疫系统，这在体内导致针对表达PSA和PAP的肿 瘤的显著治疗活性。因此，MVA-BN-PRO是人类中前列腺癌免疫疗法的有吸引力的疫苗候选 物。MVA-BN-PRO是能够诱导保护性抗肿瘤免疫力的有力免疫原，其在预防设置中预防 肿瘤生长且还遏制已建立的肿瘤的生长。MVA-BN-PRO的预防性和治疗性抗肿瘤活性是由抗 PSA特异性适应性免疫应答介导的。然而，适应性免疫应答是针对由MVA-BN-PRO编码的前 列腺特异性抗原，PSA和PAP诱导的。伴随的对针对多种肿瘤抗原的适应性应答的激活使 得MVA-BN-PRO能够更高效地抗击肿瘤和提高成功治疗癌症患者的潜力。在一个实施方案中，本发明涵盖重组MVA病毒用于前列腺癌治疗的意图。所述 重组MVA是通过将异源序列插入MVA病毒中而生成的。在本发明的实践中有用且已经依 照布达佩斯条约的要求保藏的MVA病毒株的例子有MVA 572(1994年1月27日保藏于欧 洲动物细胞培养物保藏中心(EuropeanCollection of Animal Cell Cultures, ECACC), Salisbury (UK)，保藏号 ECACC94012707)和 MVA 575(2000 年 12 月 7 日保藏于 ECACC 00120707)。别的例示性菌株有MVA-BN (2000年8月30日保藏于欧洲细胞培养物保 藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)，编号 V00083008)及其衍生物。虽然MVA-BN 由于其较高的安全性(复制能力较低)是优选的，但是所有MVA 都适合于本发明。依照本发明的一个实施方案，所述MVA株是MVA-BN 及其衍生物。参 见PCT/EP01/13628，通过述及收入本文。在某些实施方案中，重组MVA表达肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，肿瘤相关抗 原是PSA。在一个实施方案中，肿瘤相关抗原是PAP。在一个优选的实施方案中，所述MVA 表达两种肿瘤相关抗原，优选PSA和PAP抗原。在一个实施方案中，所述两种肿瘤相关抗原 包含核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。在一个实施方案中，所述两种肿瘤相关抗 原是自包含核苷酸序列SEQ ID NO 3的盒表达的。在其它实施方案中，所述肿瘤相关抗原被修饰成包括一种或多种外来Th表位。如 本文所述，此类癌症免疫治疗剂对于预防和/或治疗癌症(包括癌症转移)是有用的。本 发明容许将此类药剂用于人和其它哺乳动物的引发/强化疫苗接种方案，包括免疫受损的 患者；而且包括体液和细胞这两种免疫应答，诸如在先前存在的Th2环境中诱导Thl免疫应答。术语“多肽”指两个或更多个通过肽键或经修饰肽键而彼此连接的氨基酸的聚合 物。所述氨基酸可以是天然存在的以及非天然存在的，或者是天然存在氨基酸的化学类似物。该术语还指蛋白质，即如下的功能性生物分子，其包含至少一条多肽；当包含至少两条 多肽时，这些可形成复合物，是共价连接的，或者可以是非共价连接的。蛋白质中的多肽可 以是糖基化的和/或脂化的(lapidated)和/或包含辅基。在人细胞系诸如细胞系HaCAT (Boukamp et al. 1988，J Cell Biol 106(3) 761-71)或HeLa中术语“不能生殖性复制”在本申请中如WO 02/42480中所定义的那样使 用。如此，在细胞系中“不能生殖性复制”的病毒为在所述细胞系中显示不到1的扩增速率 的病毒。病毒的“扩增速率”指自受感染细胞生成的病毒(输出)对最初首先用于感染该细 胞的量(输入)的比。输出和输入之间的比“1”定义如下的扩增状态，其中自受感染细胞生 成的病毒的量与最初用于感染该细胞的量相同。依照本发明的一个实施方案，在人细胞系 中“不能生殖性复制”的病毒可以在上述人细胞系HeL^HaCat和143B任一中具有1. 0(平 均值)或更低、或甚至0.8 (平均值)或更低的扩增速率。在某些实施方案中，所述MVA是于2000年8月30日以编号V00083008保藏于 欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)且记载于U. S. Pat. Nos. 6，761，893和6，193，752的 MVA-BN 。如那些专利出版物中所记载的，MVA-BN 不在细胞系293、143B、HeLa和 HaCat中生殖性复制。具体而言，MVA-BN 在人胚肾细胞系293中展现出0.05-0.2 的复制速率。在人骨骨肉瘤细胞系143B中，MVA-BN 展现出0.0-0.6的复制速率。 MVA-BN 在人子宫颈腺癌细胞系HeLa中展现出0. 04-0. 8的复制速率，而在人角质形成 细胞细胞系HaCat中展现出0. 02-0. 8的复制速率。MVA-BN 在非洲绿猴肾细胞(CVl ATCC No. CCL-70)中具有0. 01-0. 06的复制速率。MVA-BN 的扩增速率在鸡胚成纤维细胞(CEF 原代培养物)中超出1，如 U. S. Pat. Nos. 6，761，893和6，193，752中所记载的。所述病毒能在CEF原代培养物中容易 地繁殖和扩增，速率超出500。在某些实施方案中，重组MVA是MVA-BN 的衍生物。此类“衍生物”包括展现 与保藏株(ECACC No. V00083008)本质上相同的复制特征但在其基因组的一个或多个部分 中展现差异的病毒。“衍生物”不必衍生自MVA-BN 。与所述保藏病毒具有相同“复制特 征”的病毒为与保藏株以相似的扩增速率在CEF细胞和细胞系HeL^HaCat和143B中复制； 且在体内显示相似的复制特征(如例如在AGR129转基因小鼠模型中所测定的)的病毒。本发明涵盖具有MVA-BN的下列两种特性中的一项或两项的MVA病毒-能够在鸡胚成纤维细胞(CEF)中生殖性复制，但是不能在人角质形成细胞细 胞系(HaCaT)、人胚肾细胞系(293)、人骨骨肉瘤细胞系(143B)、和人子宫颈腺癌细胞系 (HeLa)中生殖性复制；和-不能在能够生成成熟B和T细胞且因此是重度免疫受损的且对复制型病毒高度 易感的小鼠模型中复制。在某些实施方案中，所述MVA是含有与所述痘苗病毒异源的别的核苷酸序列的重 组痘苗病毒。在某些此类实施方案中，所述异源序列编码诱导免疫系统产生应答的表位。如 此，在某些实施方案中，使用所述重组MVA来针对包含所述表位的蛋白质或药剂进行疫苗 接种。在一个优选的实施方案中，所述表位是肿瘤相关抗原，优选PSA或PAP。在一个实施 方案中，所述PSA抗原包含序列SEQ ID NO :1。在一个实施方案中，所述PAP抗原包含序列 SEQ IDNO :2。
在某些实施方案中，将异源核酸序列插入病毒基因组的非必需区域中。在某 些那些实施方案中，将异源核酸序列插入在MVA基因组的天然存在删除位点处，如PCT/ EP96/02926中所记载的。用于将异源序列插入痘病毒基因组中的方法是本领域技术人 员已知的。在某些实施方案中，将异源核酸序列插入在MVA基因组的基因间区中，如以公 布的美国专利申请20050244428中所记载的。在一个实施方案中，所述基因间区是IGR 014L/015L。在某些实施方案中，药物组合物包含一种或多种药学可接受的和/或批准的载 体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。此类添加剂包括例如但不限于水、 盐水、甘油、乙醇、湿润剂或乳化剂、和PH缓冲物质。例示性的载体典型地是大的、缓慢代谢 的分子，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集物、诸 如此类。为了制备疫苗，可以将MVA转变成生理学可接受形式。在某些实施方案中，此类 制备基于在制备用于针对天花疫苗接种的痘病毒疫苗中的经验，如例如Stickl，H. et al.， Dtsch. med. Wschr. 99 2386-2392 (1974)中所记载的。下文是一种例示性的制备。将纯化的病毒以在IOmM Tris、HOmMNaCl，pH7. 4中配 制成5X 108TCID5(1/ml的滴度保存于_80°C。为了制备疫苗弹，在安瓿(优选玻璃安瓿)中 在存在2%蛋白胨和人清蛋白的情况中在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冻干例如IO2-IO8个 病毒颗粒。或者，可以通过逐步、冷冻-干燥配制剂中的病毒来制备疫苗弹。在某些实施方 案中，所述配制剂含有别的添加剂，诸如甘露醇、右旋糖苷、糖、甘氨酸、乳糖、聚乙烯吡咯烷 酮、或其它添加剂，诸如包括但不限于适合于体内施用的抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重 组蛋白质(例如人血清清蛋白)。然后将所述安瓿密封，而且可以于合适的温度(例如在 4°C和室温之间)保存数月。然而，只要没有需要，所述安瓿优选保存于低于-20°C的稳定。在涉及疫苗接种或治疗的各种实施方案中，将冻干物在0. 1-0. 5ml水溶液(优选 生理盐水或Tris缓冲液)中溶解，并系统或局部施用，即通过胃肠外、皮下、静脉内、肌肉 内、鼻内、皮内、或熟练从业人员已知的任何其它施用途径。施用模式、剂量、和施用次数的 优化在本领域技术人员的能力和知识之内。在某些实施方案中，减毒痘苗病毒株对于在免疫受损的动物(例如受SIV感染的 猴(CD4 < 400/μ 1血液))或免疫受损的人中诱导免疫应答是有用的。术语“免疫受损的” 描述只展现不完全的免疫应答或在针对传染剂的防御中具有降低的效率的个体的免疫系 统状态。某些例示性肿瘤相关抗原在某些实施方案中，在受试者中诱导针对细胞相关多肽抗原的免疫应答。在某些 此类实施方案中，细胞相关多肽抗原是肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，细胞相关多肽抗原是肿瘤相关抗原以外的自身蛋白质抗原 (其涉及多种病理学过程)、或病毒抗原、或自细胞内寄生物或细菌衍生的抗原。在某些情 况中，此类病原体相关抗原常常是相对较弱的免疫原(例如来自分支杆菌(诸如结核分支 杆菌(Mycobacterium tuberculosis)禾口麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)以及来自 原生动物(诸如疟原虫(Plasmodiumspp.)的抗原)。众多肿瘤相关抗原是本领域已知的。例示性的肿瘤相关抗原包括但不限于5种 α-还原酶、甲胎蛋白、AM-1、APC、April、BAGE, β-联蛋白、Bcll2、bcr-abl、CA-125、 CASP-8/FLICE、组织蛋白酶、CD19、CD20、CD21、CD23、CD22、CD33 CD35、CD44、CD45、CD46、 CD5、CD52、CD55、CD59、CDC27、CDK4、CEA、c-myc、Cox-2、DCC、DcR3、E6/E7、CGFR、EMBP、Dna78、 法尼基转移酶、FGF8b、FGF8a、FLK-1/KDR、叶酸受体、G250、GAGE家族、胃泌素17、胃泌素 释放激素、GD2/GD3/GM2、GnRH, GnTV, GPl、gpl00/Pmell7、gp-100_in4、gpl5、gp75/TRP_l、 hCG、类肝素酶(h印aranse)、Her2/neu、HMTV, Hsp70、hTERT、IGFRl、IL-13R、iNOS、Ki67、 KIAA0205、K-ras、H-ras、N-ras、KSA、LKLR-FUT、MAGE 家族、mammaglobin、MAP17、melan-A/ MART-U mesothelin、MIC A/B、MT-MMPs、粘蛋白、NY-ESO-l、骨粘连蛋白、pl5、P170/MDR1、 p53、p97/ 黑素运铁蛋白、PAI-I、PDGF, uPA、PRAME, probasin、progenipoientin、PSA、 PAP、PSM、RAGE-I、Rb、RCASl、SART-I、SSX 家族、STAT3、STn、TAG-72、TGF- α、TGF-β、胸腺 素-β -15,TNF- α、TPl、TRP-2、酪氨酸酶、VEGF、ZAG、pl6INK4、和谷胱甘肽-S-转移酶。前列 腺癌中的肿瘤相关抗原的具体例子包括但不限于PSA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PAP、 和前列腺干细胞抗原(PSCA)。PSA 禾口 PAP 抗原本发明涵盖PSA和PAP抗原，其是PSA和PAP的全长或片段。优选的是，所述PSA 和PAP抗原是人的。在另一个实施方案中，所述PSA和/或PAP是大鼠或小鼠的。在一个 优选的实施方案中，所述PSA和PAP抗原分别由核苷酸序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2编码。在一个实施方案中，所述PAP抗原是PAP片段。优选的片段包含人PAP的 氨基酸 181-95、112-120、133-152、155-163、173-192、199-213、228-242、248-257、 299-307、或 308-322。参见 Waeckerle-Men et al. , Cancer Immunol. Immunother. 55 1524-1533(2006) ；Klyushnenkova et al. ,Prostate67(10) 1019-28(2007) ；Matsueda et al.，Clin Cancer Res. 11(19 Pt 1) :6933_43 (2005) ；Harada et al.，Oncol Rep. 12(3) 601-7(2004) ；Machlenkin et al.，CancerRes. 65(14) :6435_6442 (2005)；及 McNeel et al. ,Cancer Res. 61(13) :5161_7 (2001)，通过述及收入本文。在一个实施方案中，所述多肽 包含这些表位之一。在其它实施方案中，所述多肽包含这些表位中的2、3、4、5、6、7、8、9、或 10种。本发明明确涵盖这些表位的每一种可能组合。在某些实施方案中，所述PAP片段包含人PAP的25、50、75、100、125、150、175、200、 225、250、275、300、325、或375个连续氨基酸。可以使用本领域公知测定法对PAP片段测定 表位的保留。参见例如Klyushnenkova etal. ,Prostate 67(10) 1019-28(2007) ；Matsueda et al. , Clin Cancer Res. 11(19 Ptl) :6933_43 (2005)，通过述及收入本文。可以通过PCR或其它常规分子生物学技术来生成编码这些片段的DNA。在一个实施方案中，所述PSA抗原是PSA片段。优选的片段包含人PSA的氨基 酸 16-24 或 154-163。参见 Waeckerle-Men et al. , Cancer Immunol. Immunother. 55 1524-1533(2006) ；Matsueda et al. ,Clin Cancer Res. 11(19 Ptl) :6933_43 (2005)，通过 述及收入本文。在一个实施方案中，所述多肽包含这些表位之一。在其它实施方案中，所述 多肽包含这两种表位。可以使用本领域公知测定法(诸如表位扫描)对PSA片段测定表位的保留。在某 些实施方案中，所述？34片段包含人？5々的25、50、75、100、125、150、175、200、225、或250个连续氨基酸。可以通过PCR或其它常规分子生物学技术来生成编码这些片段的DNA。可以通过本领域公知方法来生成各种经修饰的PAP和PSA多肽抗原和方法。例如， 可使用 U. S. Pat. No. 7，005，498 和 U. S. Pat. Pub. Nos. 2004/0141958 和 2006/0008465 中记 载的方法，通过述及收入本文。应当考虑下列参数1.已知的和预测的CTL表位；2.与相关蛋白质的同源性；3.半胱氨酸残基的保守性；4.预测的环、α -螺旋和β -片层结构；5.潜在的N-糖基化位点；6.对暴露的和埋藏的氨基酸残基的预测；7.结构域组织。与其它相关蛋白质具有高度同源性的区域对于“总体”三级结构及因此对于抗体 识别有可能在结构上是重要的，而具有低同源性的区域有可能能改变，结果只是结构的局 部改变。半胱氨酸残基常常涉及分子内二硫桥形成，而且如此涉及三级结构，不应当改变。 预测形成α-螺旋或β-片层结构的区域应当避免作为外来表位的插入点，因为认为这些 区域涉及蛋白质折叠。若想要蛋白质甘露糖基化，则应当考虑潜在的N-糖基化位点。(根据它们的疏水性特性)预测在分子内部的区域优选应当保留，因为它们可涉 及折叠。相反，溶剂暴露区能充当用于插入模型TH表位Ρ2和Ρ30的候选位置。最后，由于其对蛋白质结构和功能的相关性，应当考虑蛋白质的结构域排布 (organization)0通过免疫动物(诸如小鼠)以测定修饰对体液和细胞免疫应答的影响，可以测定 修饰PSA和PAP的效果。经过修饰的肿瘤相关抗原在某些实施方案中，细胞相关多肽抗原是经过修饰的，使得在与APC表面上的MHC I型分子结合而呈递时，针对呈递表位的细胞的CTL应答得到诱导，所述表位衍生自所述细 胞表面上的多肽抗原。在某些此类实施方案中，至少一种第一外来Th表位在被呈现时与APC 表面上的MHC II型分子结合。在某些此类实施方案中，细胞相关抗原是肿瘤相关抗原。
能够呈递表位的例示性APC包括树突细胞和巨噬细胞。别的例示性APC包括任何 胞饮或吞噬APC，其能够同时呈递1)结合至MHC I型分子的CTL表位和2)结合至MHC II 型分子的Th表位。 在某些实施方案中，对PSA和/或PAP进行修饰，使得在对受试者施用后，主要与 PSA和/或PAP起反应的多克隆抗体得到引发。此类抗体能攻击和消除肿瘤细胞以及预防 转移细胞发展成转移。这种抗肿瘤效应的效应器机制会是经由补体和抗体依赖性细胞的细 胞毒性介导的。另外，所诱导的抗体还能经由抑制受体的生长因子依赖性寡_ 二聚化和内 在化来抑制癌细胞生长。在某些实施方案中，此类经修饰PSA和/或PAP多肽抗原能诱导针对已知的和/或预测的、由肿瘤细胞展示的PSA和/或PAP表位的CTL应答。在一个优 选的实施方案中，所述PSA和PAP抗原诱导针对这些抗原的B细胞和T细胞应答。在某些实施方案中，经修饰的PSA和/或PAP多肽抗原包含细胞相关多肽抗原的 CTL表位和变异，其中所述变异包含外来Th表位的至少一种CTL表位。包含至少一种CTL 表位的某些此类经修饰PSA和/或PAP多肽抗原和包含外来Th表位的至少一种CTL表位 的变异及其生成方法记载于 U. S. Pat. No. 7，005, 498 和 U. S. Pat. Pub. Nos. 2004/0141958 和 2006/0008465 ο在某些实施方案中，外来Th本文是天然存在的“混杂”T细胞表位。此类混杂T细 胞表位在动物物种或动物群体的大比例的个体中是有活性的。在某些实施方案中，疫苗包 含此类混杂T细胞表位。在某些此类实施方案中，混杂T细胞表位的使用降低对同一疫苗 中有很大数目的不同CTL表位的需要。例示性的混杂T细胞表位包括但不限于来自破伤风 毒素(包括但不限于P2和P30表位(Panina-Bordignon et al.，1989))、白喉毒素、流感病 毒血凝素(HA)、和镰状疟原虫(P. falciparum) CS抗原的表位。别的混杂T细胞表位包括能够结合大比例的由不同HLA-DR编码的HLA-DR分 子的肽。参见例如 WO 98/23635 (Frazer IH et al.，assigned to TheUniversity of Queensland) ；Southwood S et.al, J.Immunol. 160 3363-3373(1998) ；Sinigaglia F et al. , Nature 336 778780 (1988) ；Rammensee HG et al. , Immunogenetics 41(4) 178-228(1995) ；Chicz RM et al.，J.Exp. Med 178 :27_47(1993) ；Hammer J et al.，Cell 74 197-203 (1993)；及 Falk K et al. , Immunogenetics 39:230-242(1994)。后一篇参考 文献还涉及HLA-DQ和-DP配体。这些参考文献中所列出的所有表位作为如本文所描述的 候选天然表位是相关的，正如与这些共享共同基序的表位。在某些其它实施方案中，所述混杂T细胞表位是人工T细胞表位，其能够结合 大比例的单元型(haplotype)。在某些此类实施方案中，所述人工T细胞表位是泛DR表 位月太(“PADRE”)，如 WO 95/07707 和相应的论文 Alexander J et al. , Immunity 1 751-761(1994)中所记载的。重组MVA本发明涵盖表达包含PAP抗原的多肽的重组MVA病毒。优选的是，MVA病毒表达人 PAP抗原。在一个实施方案中，所述MVA病毒表达大鼠或小鼠PAP抗原。在一个实施方案 中，MVA病毒编码全长PAP抗原。在一个优选的实施方案中，所述MVA包含核苷酸序列SEQ ID NO :2。在另一个实施方案中，所述MVA编码PAP片段。可以使用本领域公知测定法对PAP 片段测定表位的保留。参见例如Klyushnenkova et al.，Prostate67 (10) 1019-28 (2007)； Matsueda et al.，Clin Cancer Res. 11(19 Pt 1) :6933_43 (2005) ；Machlenkin et al.， Cancer Res. 65(14) :6435_6442 (2005)，通过述及收入本文。在某些实施方案中，所述PAP 片段包含人 PAP 的 25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、或 375 个连续 氨基酸。在优选的实施方案中，所述MVA编码包含人PAP氨基酸81-95、112-120、 133-152、155-163、173-192、199-213、228-242、248-257、299-307、或 308-322 的多肽。 参 见 Waeckerle-Men et al. , Cancer Immunol. Immunother. 55 1524-1533(2006)；Klyushnenkova et al. ,Prostate 67(10) 1019-28 (2007) ；Matsueda et al. ,Clin Cancer Res. 11(19 Pt 1) :6933_43 (2005) ；Harada et al.，Oncol Rep. 12(3) :601_7(2004)； Machlenkin et al. , Cancer Res. 65(14) 6435-6442(2005)；及 McNeel et al. , Cancer Res. 61 (13) :5161-7 (2001)，通过述及收入本文。在一个实施方案中，所述多肽包含这些表 位之一。在其它实施方案中，所述多肽包含这些表位中的2、3、4、5、6、7、8、9、或10种。本发 明明确涵盖这些表位的每一种可能组合。本发明涵盖表达包含PSA抗原的多肽的重组MVA病毒和表达包含PSA抗原的多肽 及包含PAP抗原的多肽的重组MVA病毒。优选的是，MVA病毒表达人PSA抗原。在一个实 施方案中，所述MVA病毒表达大鼠或小鼠PSA抗原。在一个实施方案中，MVA病毒编码全长 PSA抗原。在一个优选的实施方案中，所述MVA包含核苷酸序列SEQ ID NO :1。在另一个实施方案中，所述MVA编码PSA片段。可以使用本领域公知测定法对PSA 片段测定表位的保留。在某些实施方案中，所述PSA片段包含人PSA的25、50、75、100、125、 150、175、200、225、或250个连续氨基酸。在优选的实施方案中，所述MVA编码包含人PSA氨基酸16_24或154-163的多 月太。参见 Waeckerle-Men et al. , Cancer Immunol. Immunother. 55 1524-1533(2006)； Matsueda et al. ,Clin Cancer Res. 11(19 Pt 1) :6933_43 (2005)，通过述及收入本文。在 一个实施方案中，所述多肽包含这些表位之一。在其它实施方案中，所述多肽包含这两种表 位。所述重组MVA病毒可以在免疫原性组合物中使用，用于在对宿主施用时诱导针对 PAP和/或PSA的B细胞和T细胞免疫应答。在一个优选的实施方案中，所述免疫原性组合 物在对宿主施用时诱导针对PAP和/或PSA的抗体。所述免疫原性组合物可含有佐剂、稀 释剂和/或稳定剂。此类添加剂包括例如但不限于水、盐水、甘油、乙醇、湿润剂或乳化齐U、 和PH缓冲物质。在一个实施方案中，所述MVA是MVA-BN 。在一个非限制性实施方案中，如下构建包含肿瘤相关抗原的重组MVA，例如 MVA-BN-PR0，其编码PSA和PAP两种抗原。最初的病毒原种是使用允许复制的细胞类型 (例如CEF细胞)在细胞培养物中通过重组生成的。将细胞既用减毒的痘苗病毒(例如 MVA-BN )接种，又用编码肿瘤相关抗原(例如PSA或PAP)序列和病毒基因组侧翼区 的重组质粒(例如PBN217)转染。在一个非限制性实施方案中，所述质粒PBN217含有也在 MVA-BN 中存在的序列(014L和015L可读框)。将所述PSA和PAP cDNA序列插入在所 述MVA-BN 序列之间，以容许重组入MVA-BN 病毒基因组中。在某些实施方案中，所 述质粒还含有包含一种或多种选择基因的选择盒，以容许在CEF细胞中选择重组构建物。同时感染和转染培养物容许在病毒基因组和重组质粒之间发生同源重组。然后分 离携带插入物的病毒，表征，并制备病毒原种。在某些实施方案中，在没有选择的情况中在 CEF细胞培养物中将病毒传代，以容许编码选择基因(例如gpt和红色荧光蛋白(RFP))的 区域丢失。治疗方法具有由过表达肿瘤相关抗原(诸如PSA和/或PAP)的细胞介导的癌症的患者可 以用编码一种或多种此类抗原的重组MVA来治疗。在一个优选的实施方案中，所述MVA是MVA-BN 。在一个特别优选的实施方案中，所述MVA编码包含核苷酸序列SEQ ID NO 1 的多肽和包含核苷酸序列SEQ ID NO 2的第二多肽。所述癌症优选是前列腺癌。在一个实施方案中，所述癌症是转移性前列腺癌。所述 癌症患者可以是任何哺乳动物，包括小鼠或大鼠。优选的是，所述癌症患者是灵长类动物， 最优选是人。所述编码一种或多种肿瘤相关抗原(例如PSA或PAP)的重组MVA可以系统或局 部施用，即通过胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、鼻内、皮内、或熟练从业人员已知的任何其它 施用途径。在一个实施方案中，给患者施用IO5-IOiciTCID5ci的所述重组MVA。优选的是，给患 者施用IO7-IOiciTCID5ci的所述重组MVA。最优选的是，给患者施用IO8-IOiciTCID5ci的所述重 组MVA。最优选的是，给患者施用IO8-IO9或IO9-IOiciTCID5ci的所述重组MVA。优选的是，以 1 X 108、2X 108、或4X IO8TCID50的剂量给患者施用所述重组MVA。可以一次性地或在多个时间施用所述重组MVA。在某些实施方案中，所述重组MVA 施用两次、三次、四次、或五次。优选的是，所述重组MVA给予三次。最优选的是，以四周时 间间隔给予三次。各施用之间的间隔优选是1-4周、1-8周、1-16周、和1-52周。在一个实 施方案中，所述重组MVA在第0天施用，并在第8天和第15天再次施用。在一个优选的实 施方案中，为后续施用扩大剂量。在一个特别优选的实施方案中，以四周时间间隔给予三次1X108、2X108、和 4X IO8TCID50 0给予多剂重组MVA的基本原理基于小鼠中显示强化处理显著提高抗PSA和 抗PAP免疫应答的临床前免疫原性数据。考虑到人中的巨大免疫学多态性，给予三剂或更 多剂能确保每一名个体都能达到最大免疫应答。在一个实施方案中，抗PSA和/或抗PAP抗体应答。在一个实施方案中，用重组 MVA处理诱导抗PSA和/或抗PAP T细胞免疫应答。在一个实施方案中，用重组MVA处理诱 导抗PSA和/或抗PAP抗体及T细胞免疫应答。在一个实施方案中，用重组MVA处理诱导针对其它肿瘤抗原的T细胞应答的扩散。在一个实施方案中，用重组MVA处理在预防性和/或治疗性设置中抑制PSA (+)肿 瘤生长。在一个实施方案中，用重组MVA处理在预防性和/或治疗性设置中抑制PAP⑴肿 瘤生长。在一个实施方案中，用重组MVA处理在预防性和/或治疗性设置中抑制PSA⑴和 PAP(+)肿瘤生长。与细胞毒剂的组合疗法具有由过表达肿瘤相关抗原(诸如PSA和/或PAP)的细胞介导的癌症的患者可 以通过编码一种或多种此类抗原的重组MVA与紫杉烷的组合来治疗。在亚破坏肿瘤剂量展 现免疫调控活性的细胞毒剂对疫苗效能会是有益的。在破坏肿瘤剂量(高剂量)时，这些 药剂在重组MVA处理同时、之前、或之后的使用可优于任一单独的处理。在一个实施方案中，所述紫杉烷是多西他塞(docetaxel)。在另一个实施方案中， 所述紫杉烷是帕利他塞(paclitaxel)。所述紫杉烷优选以一个破坏肿瘤剂量施用。一个 “破坏肿瘤剂量”的多西他塞是至少50mg/m2。优选的是，所述破坏肿瘤剂量的多西他塞是 75-100mg/m2，其对应于大约25_33mg/kg的剂量。一个“破坏肿瘤剂量”的帕利他塞是至少 90mg/m2。优选的是，所述破坏肿瘤剂量的帕利他塞是135-175mg/m2。一个“亚破坏肿瘤剂量”的紫杉烷是低于破坏肿瘤剂量的剂量。所述紫杉烷可以通过熟练技术人员已知的任何 手段来施用，例如静脉内。在一个实施方案中，所述紫杉烷和编码包含前列腺肿瘤特异性抗原的多肽的MVA 是同时施用的。在一个实施方案中，所述紫杉烷是在所述重组MVA之前施用的。在一个实施方案 中，所述重组MVA是在所述紫杉烷施用的6个月内施用的。在某些实施方案中，所述重组 MVA是在所述紫杉烷后3个月内、2个月内、或1个月内施用的。在一个实施方案中，所述重 组MVA是在所述紫杉烷后21天内施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉 烷后14天内施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷后7天内施用的。 通常，所述重组MVA是在用所述紫杉烷处理后至少2天施用的。在一个实施方案中，所述紫杉烷是在所述重组MVA之后施用的。通常，所述重组 MVA是在用所述紫杉烷处理前至少1周施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所 述紫杉烷前不到2年施用的。在某些实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷前不到1 年、不到6个月、或不到3个月施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷 前1-26周施用的。在一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷前1-9周施用的。在 一个实施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷前1-3周施用的。在某些实施方案中，所述紫杉烷是在所述重组MVA之前及之后施用的。在其它实 施方案中，所述重组MVA是在所述紫杉烷之前及之后施用的。所述重组MVA和所述紫杉烷 的施用可以是单次施用或多次施用。例如，所述施用可相隔1、2、3、4、5、或6周。试剂盒本发明涵盖包含重组MVA的试剂盒。所述重组MVA可以装在管形瓶或容器中。在 一个实施方案中，所述重组MVA编码PAP抗原。在一个实施方案中，所述重组MVA编码包含 PSA抗原的多肽。在一个实施方案中，所述重组MVA编码包含PSA抗原的多肽和包含PAP抗 原的多肽。在各种实施方案中，用于疫苗接种的试剂盒在第一管形瓶或容器中装有用于第 一次疫苗接种(“引发”)的重组MVA且在第二或第三管形瓶或容器中装有用于第二或第三 疫苗接种(“强化”)的重组MVA。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和为预防前列腺癌而施用所述重 组MVA的指令。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和在检测到一种或多种前 列腺肿瘤相关标志物升高后为预防前列腺癌而施用所述重组MVA的指令。在一个优选的实 施方案中，所述指令可指示在确定循环中的PSA水平升高后为预防前列腺癌而要施用所述 MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为预防前列腺癌而要对30岁以上的男性患者施 用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为预防前列腺癌而要对30岁以上、40岁 以下的男性患者施用所述MVA。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和在40岁 后为预防前列腺癌而施用所述重组MVA的指令。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和为预防前列腺癌转移而施用所 述重组MVA的指令。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和在检测到前列腺肿 瘤细胞相关标志物升高后为预防前列腺癌转移而施用所述重组MVA的指令。在一个优选的 实施方案中，所述指令可指示在确定循环中的PSA水平升高后、尽管没有可检测的原发瘤 的情况下，为预防前列腺癌转移而施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为预防前列腺癌转移而要对30岁以上的男性患者施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令 可指示为预防前列腺癌转移而要对30岁以上、40岁以下的男性患者施用所述MVA。在一个 实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和为预防前列腺癌转移而在40岁后施用所述重组 MVA的指令。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和为治疗前列腺癌而施用所述重 组MVA的指令。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和在检测到一种或多种前 列腺肿瘤相关标志物升高后为治疗前列腺癌而施用所述重组MVA的指令。在一个优选的实 施方案中，所述指令可指示在确定循环中的PSA水平升高后为治疗前列腺癌而要施用所述 MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为治疗前列腺癌而要对30岁以上的男性患者施 用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示为治疗前列腺癌而要对30岁以上、40岁 以下的男性患者施用MVA。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和为治疗前列腺 癌而在40岁后施用所述重组MVA的指令。在一个实施方案中，所述试剂盒可装有重组MVA和在施用破坏肿瘤剂量的紫杉烷 前施用所述重组MVA的指令。所述指令可指示要在紫杉烷施用前6个月和1周之间的任何 时间点施用所述MVA。在优选的实施方案中，所述指令指示要在紫杉烷施用前3个月和1 周、六周和1周、1个月和1周、3周和1周、及2周和1周之间的任何时间点施用所述MVA。 在一个实施方案中，所述指令可指示要在紫杉烷施用前1周和0天之间的任何时间点施用 所述MVA。所述试剂盒也可装有重组MVA和在施用破坏肿瘤剂量的紫杉烷的同时施用所述 重组MVA的指令。所述试剂盒也可装有重组MVA和在施用破坏肿瘤剂量的紫杉烷后施用所述重组 MVA的指令。所述指令可指示要在紫杉烷施用后1天和6个月之间的任何时间点施用所述 MVA。在优选的实施方案中，所述指令指示要在紫杉烷施用后2天和1周、2天和2周、2天 和3周、2天和1个月、2天和2个月、及2天和3个月、及2天和6个月之间的任何时间点 施用所述MVA。在一个实施方案中，所述指令可指示要在紫杉烷施用后0和2天之间的任何 时间点施用所述MVA。下文给出了实施例和参考文献以更为详细地例示本发明，但是本发明的范围不受 这些实施例限制。所例示的论文中熟练技术人员想到的任何变化意图落在本发明的范围 内。此外，参考所引用的参考文献能最彻底地理解说明书，通过述及将它们都完整收入本 文。
实施例实施例1 :MVA-BN-PR0的构建和对受感染细胞中蛋白质表达的分析为了开发前列腺癌疫苗，生成了编码人前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷 酸酶(PAP)的重组痘苗病毒载体，MVA-BN-PR0。重组痘苗病毒载体MVA-BN-PRO衍生自高度 减毒的痘苗病毒株MVA-BN (改良痘苗病毒安卡拉一 Bavarian Nordic)。MVA-BN 高度适应了原代鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞，而且不在人细胞中生殖性复制。在人细胞中， 病毒基因表达，但是不生成感染性病毒。基因的起源
使用例行分子生物学技术，自购自ClonteCh(产品目录编号6410801)的人前列腺 总RNA转录(逆转录)PSA基因和PAP cDNA。PSA是由前列腺生成的前列腺特异性抗原，而 且以升高的量见于具有前列腺癌、良性前列腺增生、或前列腺感染或炎症的男性的血液中。 PSA已经被鉴定为由细胞介导的免疫疗法办法的靶物。PAP (前列腺酸性磷酸酶)是一种在 血液中测量到的酶，其水平在具有已经侵入或转移别处的前列腺癌的患者中升高。除非肿 瘤已经扩散到解剖学上的前列腺囊以外，否则PAP不会升高。因此，当前在数项人疫苗试验 中作为靶抗原调查这种前列腺肿瘤抗原，其中一些试验获得了临床好处的证据。所得扩增的PSA和PAP cDNA的序列据证实与那些已发表的序列匹配。也就是说， 下文显示了 PSA cDNA(例如GenBank M26663. 1 GI =618463 ；同义词激肽释放酶3 ；KLK3 ； 786bp 等)和 PAP cDNA 基因的序列(GenBankM34840. 1 GI 189620 ；同义词PAP，ACP3, ACP-3 ；ACPP ； 116Ibp)。人PSA cDNA序列(与GenBank序列M26663. 1具有99%同一性；粗体位于第48 位、第54位和第237位的三处沉默核苷酸替换，其不改变氨基酸序列)ATGTGGGTCCCGGTTGTCTTCCTCACCCTGTCCGTGACGTGGATTGGCGCTGCGCCCCTCATCCTGTCT CGGATTGTGGGAGGCTGGGAGTGCGAGAAGCATTCCCAACCCTGGCAGGTGCTTGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGT CTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGC TGGGTCGGCACAG1CTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCCCACACCCGCTC TACGATATGAGCCTCCTGAAGAATCGATTCCTCAGGCCAGGTGATGACTCCAGCCACGACCTCATGCTGCTCCGCCT GTCAGAGCCTGCCGAGCTCACGGATGCTGTGAAGGTCATGGACCTGCCCACCCAGGAGCCAGCACTGGGGACCACCT GCTACGCCTCAGGCTGGGGCAGCATTGAACCAGAGGAGTTCTTGACCCCAAAGAAACTTCAGTGTGTGGACCTCCAT GTTATTTCCAATGACGTGTGTGCGCAAGTTCACCCTCAGAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGTGCTGGACGCTGGAC AGGGGGCAAAAGCACCTGCTCGGGTGATTCTGGGGGCCCACTTGTCTGTAATGGTGTGCTTCAAGGTATCACGTCAT GGGGCAGTGAACCATGTGCCCTGCCCGAAAGGCCTTCCCTGTACACCAAGGTGGTGCATTACCGGAAGTGGATCAAG GACACCATCGTGGCCAACCCCTGA(SEQ ID NO 1)人PSA的氨基酸序列为MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCS⑶SGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO :3)。人PAP cDNA 序列(与 GenBank 序列 M34840. 1 具有 100% 同一性) ATGAGAGCTGCACCCCTCCTCCTGGCCAGGGCAGCAAGCCTTAGCCTTGGCTTCTTGTTTCTGCTTTTT TTCTGGCTAGACCGAAGTGTACTAGCCAAGGAGTTGAAGTTTGTGACTTTGGTGTTTCGGCATGGAGACCGAAGTCC CATTGACACCTTTCCCACTGACCCCATAAAGGAATCCTCATGGCCACAAGGATTTGGCCAACTCACCCAGCTGGGCA TGGAGCAGCATTATGAACTTGGAGAGTATATAAGAAAGAGATATAGAAAATTCTTGAATGAGTCCTATAAACATGAA CAGGTTTATATTCGAAGCACAGACGTTGACCGGACTTTGATGAGTGCTATGACAAACCTGGCAGCCCTGTTTCCCCCAGAAGGTGTCAGCATCTGGAATCCTATCCTACTCTGGCAGCCCATCCCGGTGCACACAGTTCCTCTTTCTGAAGATC AGTTGCTATACCTGCCTTTCAGGAACTGCCCTCGTTTTCAAGAACTTGAGAGTGAGACTTTGAAATCAGAGGAATTC CAGAAGAGGCTGCACCCTTATAAGGATTTTATAGCTACCTTGGGAAAACTTTCAGGATTACATGGCCAGGACCTTTT TGGAATTTGGAGTAAAGTCTACGACCCTTTATATTGTGAGAGTGTTCACAATTTCACTTTACCCTCCTGGGCCACTG AGGACACCATGACTAAGTTGAGAGAATTGTCAGAATTGTCCCTCCTGTCCCTCTATGGAATTCACAAGCAGAAAGAG AAATCTAGGCTCCAAGGGGGTGTCCTGGTCAATGAAATCCTCAATCACATGAAGAGAGCAACTCAGATACCAAGCTA CAAAAAACTTATCATGTATTCTGCGCATGACACTACTGTGAGTGGCCTACAGATGGCGCTAGATGTTTACAACGGAC TCCTTCCTCCCTATGCTTCTTGCCACTTGACGGAATTGTACTTTGAGAAGGGGGAGTACTTTGTGGAGATGTACTAT CGGAATGAGACGCAGCACGAGCCGTATCCCCTCATGCTACCTGGCTGCAGCCCTAGCTGTCCTCTGGAGAGGTTTGC TGAGCTGGTTGGCCCTGTGATCCCTCAAGACTGGTCCACGGAGTGTATGACCACAAACAGCCATCAAGGTACTGAGG ACAGTACAGATTAG(SEQ ID NO:2)人PAP的氨基酸序列为MRAAPLLLARAASLSLGFLFLLFFWLDRSVLAKELKFVTLVFRHGDRSPIDTFPTDPIKESSWPQGFGQLTQLGMEQHYELGEYIRKRYRKFLNESYKHEQVYIRSTDVDRTLMSAMTNLAALFPPEGVSIffNPILLffQPIPVHTVPLSEDQLLYLPFRNCPRFQELESETLKSEEFQKRLHPYKDFIATLGKLSGLHGQDLFGIWSKVYDPLYCESV HNFTLPSWATEDTMTKLRELSELSLLSLYGIHKQKEKSRLQGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMYSAHDTTVSGLQMALDVYNGLLPPYASCHLTELYFEKGEYFVEMYYRNETQHEPYPLMLPGCSPSCPLERFAELVGPVIPQDWSTECMTTNSHQGTEDSTD(SEQ ID NO 4) 启动子的起源牛痘病毒的A型包涵体启动子(ATI)，一种晚期启动子(下文所示)，以合成方式 在pBluescript KS+质粒(Stratagene)中生成，切出并插入在PAP序列和PSA序列两种的 前面。因此，PSA和PAP蛋白质应当与其它晚期基因一起表达，在DNA复制之后。ATI启动子的序列5' -GTTTTGAATAAAATTTTTTTATAATAAATC(SEQ ID NO 5)PSA/PAP-MVA-BN重组质粒的构建为了将外来基因插入MVA-BN 基因组中，可以使用靶向MVA-BMgS因组的 特定区域，即删除位点或基因间(非编码)区的中间重组质粒。中间pBNX128质粒含有来自014L和015L可读框(ORF)之间基因间(非编码)区 (IGR)的侧翼区域的MVA DNA序列。可以将序列(例如PSA和PAPcDNA)插入在这些侧翼序 列之间。然后，当质粒和MVA-BN 两者在同一CEF细胞中存在时，014L/015L侧翼序列介 导同源重组，介导质粒序列插入到MVA-BN 基因组的014L/015L基因间区中(图1A-B)。所插入序列中选择盒的存在容许对重组MVA-BN 病毒的正选择。MVA-BN-PRO 的牛成同时感染和转染培养物容许在病毒基因组和重组质粒之间发生同源重组。在选择 性条件下的多次噬斑纯化后获得了含有PSA和PAP编码区和选择盒的重组痘苗载体，命名 为MVA-mBm06A。在扩增和非选择性条件下进一步噬斑纯化后，分离缺少选择盒的重组痘苗 病毒 MVA-BN-PRO。制备缺少选择盒的经噬斑纯化的病毒MVA-BN-PR0。此类制备涉及十二(12)次传 代，包括四(4)次噬斑纯化。通过DNA测序和PCR分析来验证MVA-BN-PRO原种中启动子-PSA-启动子-PAP序 列的存在和亲本MVA-BN 病毒的缺失，并施用嵌套PCR来验证选择盒(gpt和RFP基因) 的缺失。图2显示了 MVA-BN-PRO基因组的简化示意图。实施例2 用MVA-BN-PRO处理的细胞中的PSA和PAP共表达在体外与MVA-BN-PRO —起温育的细胞中证明了由MVA_BN_PR0编码的两种前列腺 特异性抗原(即人PSA和人PAP)的同时表达。将CT26，一种化学诱发的BALB/c小鼠结肠直 肠癌(Brattain et al. ,Cancer Research 40,2142-2146(1980))的培养物与 MVA-BN-PRO 一起温育，并对上清液分析重组PSA和PAP的存在。使用基于ELISA的PSA诊断试剂盒测量 PSA,该试剂盒例行用于筛选人血清样品(人PSA ELISA试剂盒，Anogen, Ontario, Canada ； PSA检测范围2-80ng/mL)。使用磷酸盐活性的比色测定法(酸性磷酸酶测定法；PAP检 测浓度4-40ng/mL)经由其酶特性直接测量PAP。在以范围1-100的感染复数(MOI)添加 MVA-BN-PRO后24小时收集的同一培养物上清液的等分试样中评估PSA和PAP。如图3所示，这两种抗原都能在与MVA-BN-PRO —起温育的细胞的上清液中检测 到。培养物中生成的重组PSA和PAP的量取决于实验中所使用的MVA-BN-PRO的量(MOI) 和细胞的数目。相反，在单独的培养基中或与MOI匹配的MVA-BN —起温育的对照培养 物的上清液中检测不到PSA或指示PAP的磷酸酶活性。使用每种测定法的参照标准图计算的PSA和PAP滴度揭示了与MVA-BN-PRO —起 温育的细胞生成相似量的这两种抗原。事实上，当以IX IO5个细胞每孔接种CT26并以MOI 10与MVA-BN-PRO —起温育48小时时，在培养物上清液中测量到1043ng/mL PSA和209ng/ mL PAP。PSA和PAP序列插入MVA-BN 基因组的同一区域中，而且它们的表达是由位于 每种序列上游的ATI启动子独立驱动的。这种插入物构造表现出赋予这两种重组抗原的最 佳表达以适当的环境。总之，这些数据显示了MVA-BN 代表了用于多种转基因抗原(像 PSA和PAP)的优良平衡的和伴随的表达的适当递送媒介。实施例3 用MVA-BN-PRO处理的小鼠中对抗PAP和抗PSA免疫应答的诱导在BALB/c小鼠中评估用MVA_BN_PR0处理后对抗PSA和抗PAP免疫应答的诱导。 在这些研究中，评估了范围为2X106至5X107TCID50的多种剂量的MVA-BN-PRO。在每次 处理前一天和最后一次处理后两周收集血液样品，并通过ELISA分析体液应答。最后一次 处理后收集脾细胞，并通过ELISpot分析细胞应答。对抗PSA和抗PAP抗体应答的诱导在第1天、第15天和第29天(q2周x3)用5X 107TCID50的MVA_BN_PR0皮下处 理BALB/c小鼠(每组5只动物)。用MVA-BN 或配制缓冲液(TBS)处理对照动物。在
21处理前、第14天、第28天、和第42天收集血液样品。然后合并来自每个测试组小鼠的血 清，并通过ELISA来分析。使用商品化的纯化的蛋白质(Meridian Life Sciences, Inc., Saco, ΜΕ)作为包被到微量滴定板的孔上的靶抗原来评估对抗PSA和抗PAP抗体应答的诱 导。如图4A和4B所示，在用MVA-BN-PRO处理的小鼠中检测到抗PSA和抗PAP抗体应答。 检测到抗PSA抗体滴度要求施用至少两次，而且滴度在第三次MVA-BN-PRO处理后升高。一 般而言，针对PAP的抗体应答是更加适度的，因为滴度总是低于那些针对PSA所诱导的。所 观察到的针对PAP的低抗体应答可能是由于此蛋白质的弱B细胞抗原性特性。对抗PSA和抗PAP T细胞应答的诱导在第1 天、第 15 天、第 31 天(q2 周 x3)用对照(TBS)、2X IO6 或 5X 107TCID50 的 MVA-BN-PRO皮下处理BALB/c小鼠(每组5只动物)。在最后一次免疫接种后5天收集脾， 并合并来自每个测试组的细胞悬浮液供分析用。通过测量体外抗原特异性再刺激后IFNy 生成的ELISpot来评估对T细胞应答的诱导。分开使用覆盖全长PSA或PAP氨基酸序列的 和有11聚物交叠(OPL)的15聚物肽的文库来进行再刺激。如图5所示，在用PAP和PSA 两种OPL再刺激后来自MVA-BN-PRO处理组的脾细胞中检测到抗原特异性T细胞应答，然而 自人HER-2ecd序列衍生的对照OPL没有效果(图5A)。当用PSA、PAP或HER-20PL再刺激 细胞时，在用MVA-BN (数据未显示)或TBS处理的组(图5)的小鼠中没有检测到T 细胞应答。这些数据指示MVA-BN-PRO是有力的T细胞诱导物，因为无需离体扩增就能在脾 细胞中直接检测到显著数目的抗原特异性T细胞。在体外再刺激脾细胞之前消减T细胞子集群体后，检查CD4辅助T细胞和CD8细 胞毒性T细胞对小鼠中用MVA-BN-PRO处理后诱导的抗PAP和PSA T细胞应答的贡献。如 图6所示，在用PSA或PAP OPL再刺激后在消减了⑶4和消减了⑶8的这两种T细胞子集 中都检测到T细胞应答。总之，这些研究显示了用MVA-BN-PRO重复处理小鼠诱导宽的针对两种TAA的抗原 特异性适应性免疫应答，其涉及抗体及⑶4和⑶8 二者效应器细胞亚型。正如所预期的，抗 体应答主要针对PSA，而PAP (已知的弱B细胞免疫原)只触发适度的抗体应答。因为PSA 和PAP本质上以抗原呈递分子/肽复合物的形式作为T细胞靶物呈现在肿瘤细胞表面上， 所以对免疫系统的细胞成分的激活是MVA-BN-PRO效能的一项关键要求。在用所有所测试 的MVA-BN-PRO剂量处理的动物中诱导了针对这两种TAA的强⑶4和⑶8 T细胞应答。因 此，MVA-BN-PRO具有介导对在其表面上呈递PSA和/或PAP肽的肿瘤细胞的消除的潜力。实施例4 用MVA-BN-PRO处理的小鼠中的抗肿瘤活性在预防性以及治疗性癌症肿瘤模型中评估了 MVA-BN-PRO影响小鼠中PSA阳性肿 瘤细胞生长的能力。数据显示了 MVA-BN-PRO在这两种设置中都能抑制肿瘤生长。还有， MVA-BN-PRO能够在治疗性癌症肿瘤模型中抑制小鼠中PAP阳性肿瘤细胞生长。用MVA-BN-PRO处理后对保护性抗原特异性适应性免疫力的诱导(预防性设置)使用移植的E5细胞作为前列腺癌模型来评估MVA-BN-PRO预防肿瘤生长的能 力。E5 是 RM11，即一种鼠前列腺肿瘤细胞系(Elzey et al.，Int. J Cancerl5 ；94(6) 842-9(2001))的亚克隆，是用编码人PSA基因的重组DNA转染RMll后获得的。在此效 能研究中，如上所述用MVA-BN-PRO免疫小鼠，即用TBS、MVA-BN (5 X IO7TCID50)或 MVA-BN-PR0(2X 106、1X IO7或5X IO7TCID50)以3周时间间隔免疫三次。然后通过在最后一次处理后六周皮内注射IXlO5个E5细胞来用肿瘤考验小鼠。此后每周两次观察肿瘤生 长，并测量生长中的实体瘤的大小。如图7C至7E所示，用所有剂量的MVA-BN-PRO预处理的动物中的肿瘤生长比TBS 对照组的肿瘤(图7A)慢，而且在研究结束时(第29天)对于所有所测试的剂量，>50% 的小鼠仍然没有肿瘤。相反，早在肿瘤攻击后第12天在TBS对照组中100%的小鼠中检测 到可测量的肿瘤。在那天，在来自所有MVA-BN-PRO处理组的仅20%的小鼠中检测到可测量 的肿瘤。在所有MVA-BN-PRO处理组和TBS对照组之间在自第12天起、贯穿整个研究的所 有时间点，肿瘤大小均值的差异是统计学显著的(图7F)。与TBS对照组相似，早在肿瘤考验前第12天在几乎每一只用MVA-BN 处理的 小鼠(90% )中检测到可测量的肿瘤(图7B)。然而，在研究结束时，MVA-BN 处理组中 的2只小鼠(20%)没有肿瘤(第29天；一只小鼠贯穿整个研究仍然没有肿瘤，而且在其它 小鼠中发生肿瘤消退)。还有，直到第22天，MVA-BN 处理组中的肿瘤生长比TBS对照 组的肿瘤慢，而且这两组之间肿瘤大小均值在两个时间点达到统计学显著差异(第19天， P = 0. 034和第22天，P = 0. 019)。用MVA-BN 处理的小鼠中肿瘤生长的迟滞只是暂时 的，因为在所有其它时间点在用TBS和MVA-BN 处理的小鼠中观察到相似的肿瘤大小均 值(图7F)。在重复实验中证实了上文所述由MVA-BN-PRO介导的抗肿瘤活性，其中用以2周时 间间隔2X IO6TCID5tl的MVA-BN-PRO处理小鼠，然后在处理后两周用肿瘤细胞攻击。图8显 示了肿瘤植入后第29天的数据，以及来自图7的、植入后同一天的匹配数据。在这两项实 验中在用MVA-BN-PRO处理的小鼠中观察到可比的肿瘤生长迟滞。此外，在MVA-BN-PRO和 TBS处理组之间以及在MVA-BN-PRO和MVA-BN 处理组之间达到肿瘤大小均值的统计学 显著差异(分别为ρ = 0. 03和ρ = 0. 021)。在重复实验(数据未显示)中没有检测到图 7中早期时间点时观察到的MVA-BN 的暂时效果。这些数据显示了用MVA-BN-PRO处理 小鼠诱导抗原特异性适应性免疫应答和免疫记忆建立。当随后两至六周后用肿瘤细胞攻击 小鼠时，唤起免疫记忆，并抑制肿瘤细胞生长。用MVA-BN-PRO处理后对肿瘤的遏制(治疗性设置)使用移植的E6细胞作为前列腺癌模型来评估MVA-BN-PRO遏制已建立肿瘤的能 力。E6是RM11，即一种鼠前列腺肿瘤细胞系(Elzey et al. ,2001)的亚克隆，是用编码人 PSA基因的重组DNA转染RMll后获得的。E6是比上文所述预防性设置中所使用的E5低的 PSA生成者。通过皮内注射1 X IO5个E6细胞并在同一天、然后在第8天和第15天用TBS、 MVA-BN 或MVA-BN-PR0(5X IO6或5X IO7TCID5tl)处理来用肿瘤攻击小鼠。此后每周两 次观察肿瘤生长，并测量皮肤下的实体瘤大小。如图9所示，用MVA-BN-PRO处理的动物中的肿瘤(图9C和9D)生长显著比用 MVA-BN (图9A和9B)或TBS (图9E)处理的动物中的肿瘤慢。在这两个MVA-BN-PRO 处理组中，在50%的动物中观察到肿瘤大小稳定或消退。图9F显示了组间肿瘤大小均值的 差异。用5X IO6TCID5(1MVA-BN-PRO处理的动物和TBS或MVA-BN 处理对照组之间平均肿 瘤体积有统计学显著差异(分别为ρ = 0. 014和P = 0. 032)，而5 X 107TCID50MVA-BN-PR0处 理组和TBS对照组之间没有达到统计学显著性(ρ = 0. 07)。这些数据显示了用MVA-BN-PRO处理小鼠在治疗性背景中抑制小鼠中前列腺肿瘤生长。使用稳定表达人PAP的CT26细胞在实验性肺转移模型中评估MVA_BN_PR0还遏制 已建立的、表达PAP的肿瘤的能力。CT26是化学诱发的BALB/c小鼠的结肠直肠癌(Brattain et al.，1980)。在此模型中，将CT26-PAP细胞静脉内注射入BALB/c小鼠中，并在肿瘤结生 长之处的肺中评估肿瘤负荷。在第1天用静脉内注射的CT26-PAP(5X105)细胞攻击小鼠， 并在第 4 天用单次注射 TBS、MVA-BN(5 X IO7TCID50)或 MVA-BN-PR0 (2 X IO6 和 5 X IO7TCID50) 腹膜内处理。然后在第14天处死小鼠，并对它们的肺称重。如图10所示，用5X IO7TCID5tl 的MVA-BN-PRO处理的小鼠中的肿瘤负荷显著低于对照小鼠中的(ρ < 0. 024)；这种抗肿瘤 活性是剂量依赖性的，因为较低剂量的MVA-BN-PRO没有效果。此外，这种抗肿瘤活性最有 可能是由PAP特异性免疫应答介导的，因为对照和MVA-BN处理组的小鼠中的肿瘤负荷没有 变化。这些数据证明了用MVA-BN-PRO处理小鼠抑制小鼠中已建立的PAP阳性肿瘤生长。 如此，由MVA-BN-PRO编码的PSA和PAP这两种前列腺抗原对能够遏制PSA或PAP阳性肿瘤 生长的保护性免疫应答的诱导有贡献。实施例5 =MVA-BN-PRO跨越单元型限制的免疫原性免疫应答源自抗原衍生表位与免疫感受态细胞上多态性抗原呈递分子的相互作 用。MVA-BN-PRO中有两种肿瘤抗原的一个好处在于它们潜在增加能与各种单元型的抗原呈 递分子相互作用的肿瘤抗原衍生表位的数目。因此，预期MVA-BN-PRO在比含有单一抗原的 疫苗更宽的单元型范围的个体中会是有免疫原性的。在临床前模型中使用具有不同单元型 的动物评估了这种可能性。在此实施例中，改良实施例1中所描述的载体，将ATI启动子用 早期/晚期合成启动子替换(Ps ;Chakrabarti S,Sisler JR，和Moss B,BioTechniques23 1094-1097 (1997年12月))。因此，PSA和PAP蛋白质应当与其它早期和晚期基因一起贯 穿整个MVA感染期表达。Ps启动子的序列5' -AAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAAT (SEQ ID NO 6)在第1天、第15天、和第29天用5 X IO7TCID50的MVA-BN-PRO免疫雄性BALB/c和 C57BL/6小鼠(每组5只动物)。在第42天收集血液样品，并如实施例3所述通过ELISA 对合并血清的连续稀释液分析抗PSA或抗PAP IgG的存在。如图11所示，只在来自BALB/ c小鼠的血清中检测到高滴度的抗PSA抗体。相反，虽然在来自这两种小鼠品系的血清中都 测量到抗PAP抗体滴度，但是在来自C57BL/6小鼠的血清中检测到更高的抗PAP抗体滴度。 此数据强调了针对特异性抗原的免疫应答的单元型联系且支持MVA-BN-PRO中有多种肿瘤 抗原应当在具有不同单元型的更宽范围的个体中提供有效免疫力的想法。实施例6 =MVA-BN-PRO在人中的安全性和免疫原性当前正在研究MVA-BN-PRO对前列腺癌患者的治疗。在本申请的时候，4名患者接 受1-3次1E8TCID50的MVA-BN-PRO处理，没有报告不良反应。通过比较处理前后针对PSA 和PAP的T细胞应答，评估了 MVA-BN-PRO在这些患者之一中的免疫原性。使用ELISpot测 定法测定患者外周血单个核细胞(PBMC)中抗原特异性伽马干扰素(IFN-γ)分泌T细胞的 存在。在处理前(基础)和第三次用IO8TCID5tl的MVA-BN-PRO皮下疫苗接种(TC3)后2周 测定应答。将MATIS-10%培养基(RPMI，Click氏培养基，10%人AB血清、0. 5M 2-β-巯基乙醇、和2%青霉素/链霉素)中的患者PBMC(2X IO5)转移至用10 μ g/mL抗人IFN-γ捕 捉抗体(Mabtech，克隆MAb 1D1K，产品目录编号3420-3)预包被的Multiscreen 96孔PVDF 板(Millipore，产品目录编号 MSIPS4510)的水合孔。随后，用 PSA(5 μ g/mL) (Biodesign 产品目录编号A86878H)、自PSA全长序列衍生的63种15聚物肽的11聚物交叠文库(OPL) (63 μ M，每种肽 1 μ Μ)、ΡΑΡ(1 μ g/mL) (Biodesign 产品目录编号 A81277H)、自 PAP 全长序 列衍生的94种15聚物肽的11聚物0PL(94y M，每种肽1 μ M)、自10种前列腺癌肿瘤相 关抗原(TAA)衍生的44种MHC I型肽的集合(44 μ Μ,每种肽1 μ Μ)、自5种前列腺癌TAA 衍生的15种15种MHC II型肽的集合(15 μ Μ,每种肽1 μ Μ)、或MVA(Bavarian Nordic, MVA-BN-PR0D05A06-C)(感染复数(MOI)为 10)刺激 PBMC。63种PSA OPL肽的序列
MWVPVVFLTLSVTWI(SEQIDNO3的氨基_H-15)
VVFLTLSVTffIGAAP(SEQIDNO3的氨基_I δ-L9)
TLSVTffIGAAPLILS(SEQIDNO3的氨基_ι 9-⑶
TffIGAAPLILSRIVG(SEQIDNO3的氨基_I 13--27)
AAPLILSRIVGGffEC(SEQIDNO3的氨基_I 17--31)
ILSRIVGGffECEKHS(SEQIDNO3的氨基_121--35)
IVGGffECEKHSQPffQ(SEQIDNO3的氨基_125--39)
WECEKHSQPffQVLVA(SEQIDNO3的氨基_129--43)
KHSQPffQVLVASRGR(SEQIDNO3的氨基_133--47)
PffQVLVASRGRAVCG(SEQIDNO3的氨基_137--51)
LVASRGRAVCGGVLV(SEQIDNO3的氨基_141--55)
RGRAVCGGVLVHPQff(SEQIDNO3的氨基_145--59)
VCGGVLVHPQffVLTA(SEQIDNO3的氨基_149--63)
VLVHPQffVLTAAHCI(SEQIDNO3的氨基_153--67)
PQffVLTAAHCIRNKS(SEQIDNO3的氨基_157--71)
LTAAHCIRNKSVILL(SEQIDNO3的氨基_161--75)
HCIRNKSVILLGRHS(SEQIDNO3的氨基_|65--79)
NKSVILLGRHSLFHP(SEQIDNO3的氨基_169--83)
ILLGRHSLFHPEDTG(SEQIDNO3的氨基_173--87)
RHSLFHPEDTGQVFQ(SEQIDNO3的氨基_177--91)
FHPEDTGQVFQVSHS(SEQIDNO3的氨基_181--95)
DTGQVFQVSHSFPHP(SEQIDNO3的氨基_185--99)
VFQVSHSFPHPLYDM(SEQIDNO3的氨基_189--103)
SHSFPHPLYDMSLLK(SEQIDNO3的氨基_193--107)
PHPLYDMSLLKNRFL(SEQIDNO3的氨基_197--111)
YDMSLLKNRFLRP⑶(SEQIDNO3的氨基_I 101-115)
LLKNRFLRPO)DSSH(SEQIDNO3的氨基_I 105-119)
RFLRPGDDSSHDLML(SEQIDNO3的氨基_I 109-123)
PGDDSSHDLMLLRLS(SEQIDNO3的氨基_I 113-127)
GFLFLLFFffLDRSVLSEQIDNO 4的氨基画g17-31)
LLFFffLDRSVLAKELSEQIDNO 4的氨基画g21-35)
WLDRSVLAKELKFVTSEQIDNO 4的氨基画g25-39)
SVLAKELKFVTLVFRSEQIDNO 4的氨基画g29-43)
KELKFVTLVFRHGDRSEQIDNO 4的氨基画g33-47)
FVTLVFRHGDRSPIDSEQIDNO 4的氨基画137-51)
VFRHGDRSPIDTFPTSEQIDNO 4的氨基画141-55)
GDRSPIDTFPTDPIKSEQIDNO 4的氨基画g45-59)
PIDTFPTDPIKESSffSEQIDNO 4的氨基画g49-63)
FPTDPIKESSffPQGFSEQIDNO 4的氨基画g53-67)
PIKESSffPQGFGQLTSEQIDNO 4的氨基画157-71)
SSffPQGFGQLTQLGMSEQIDNO 4的氨基画161-75)
QGFGQLTQLGMEQHYSEQIDNO 4的氨基画g65-79)
QLTQLGMEQHYELGESEQIDNO 4的氨基画g69-83)
LGMEQHYELGEYIRKSEQIDNO 4的氨基画g74-87)
QHYELGEYIRKRYRKSEQIDNO 4的氨基画177-91)
LGEYIRKRYRKFLNESEQIDNO 4的氨基画181-95)
IRKRYRKFLNESYKHSEQIDNO 4的氨基画g85-99)
YRKFLNESYKHEQVYSEQIDNO 4的氨基画189-103)
LNESYKHEQVYIRSTSEQIDNO 4的氨基画193-107)
YKHEQVYIRSTDVDRSEQIDNO 4的氨基画197-111)
QVYIRSTDVDRTLMSSEQIDNO 4的氨基画g101-115)
RSTDVDRTLMSAMTNSEQIDNO 4的氨基画g105-119)
VDRTLMSAMTNLAALSEQIDNO 4的氨基画g109-123)
LMSAMTNLAALFPPESEQIDNO 4的氨基画g113-127)
MTNLAALFPPEGVSISEQIDNO 4的氨基画g117-131)
AALFPPEGVSIffNPISEQIDNO 4的氨基画g121-135)
PPEGVSIffNPILLffQSEQIDNO 4的氨基画g125-139)
VSIWNPILLWQPIPVSEQIDNO 4的氨基画g129-143)
NPILLWQPIPVHTVPSEQIDNO 4的氨基画g133-147)
LWQPIPVHTVPLSEDSEQIDNO 4的氨基画g137-151)
IPVHTVPLSEDQLLYSEQIDNO 4的氨基画g141-155)
TVPLSEDQLLYLPFRSEQIDNO 4的氨基画g145-159)
SEDQLLYLPFRNCPRSEQIDNO 4的氨基画g149-163)
LLYLPFRNCPRFQELSEQIDNO 4的氨基画g153-167)
PFRNCPRFQELESETSEQIDNO 4的氨基画g157-171)
CPRFQELESETLKSESEQIDNO 4的氨基画g161-175)
QELESETLKSEEFQKSEQIDNO 4的氨基画g165-179)
SETLKSEEFQKRLHPSEQIDNO 4的氨基画g169-183)
KSEEFQKRLHPYKDFSEQIDNO 4的氨基画g 173--187)
FQKRLHPYKDFIATLSEQIDNO 4的氨基画g 177--191)
LHPYKDFIATLGKLSSEQIDNO 4的氨基画g 181--195)
KDFIATLGKLSGLHGSEQIDNO 4的氨基画g 185--199)
ATLGKLSGLHGQDLFSEQIDNO 4的氨基画g 189--203)
KLSGLHGQDLFGIffSSEQIDNO 4的氨基画g 193--207)
LHGQDLFGIffSKVYDSEQIDNO 4的氨基画g 197--211)
DLFGIffSKVYDPLYCSEQIDNO 4的氨基画1201--215)
IffSKVYDPLYCESVHSEQIDNO 4的氨基画g 205--219)
VYDPLYCESVHNFTLSEQIDNO 4的氨基画g 209--223)
LYCESVHNFTLPSffASEQIDNO 4的氨基画1213--227)
SVHNFTLPSffATEDTSEQIDNO 4的氨基画1217--231)
FTLPSffATEDTMTKLSEQIDNO 4的氨基画1221--235)
SffATEDTMTKLRELSSEQIDNO 4的氨基画g 225--239)
EDTMTKLRELSELSLSEQIDNO 4的氨基画g 229--243)
TKLRELSELSLLSLYSEQIDNO 4的氨基画1 234--247)
ELSELSLLSLYGIHKSEQIDNO 4的氨基画1 237--251)
LSLLSLYGIHKQKEKSEQIDNO 4的氨基画1241--255)
SLYGIHKQKEKSRLQSEQIDNO 4的氨基画g 245--259)
IHKQKEKSRLQGGVLSEQIDNO 4的氨基画g 249--263)
KEKSRLQGGVLVNEISEQIDNO 4的氨基画g 253--267)
RLQGGVLVNEILNHMSEQIDNO 4的氨基画1 257--271)
GVLVNEILNHMKRATSEQIDNO 4的氨基画1261--275)
NEILNHMKRATQIPSSEQIDNO 4的氨基画g 265--279)
NHMKRATQIPSYKKLSEQIDNO 4的氨基画g 269--283)
RATQIPSYKKLIMYSSEQIDNO 4的氨基画1 274--287)
IPSYKKLIMYSAHDTSEQIDNO 4的氨基画1 277--291)
KKLIMYSAHDTTVSGSEQIDNO 4的氨基画1281--295)
MYSAHDTTVSGLQMASEQIDNO 4的氨基画g 285--299)
HDTTVSGLQMALDVYSEQIDNO 4的氨基画g 289--303)
VSGLQMALDVYNGLLSEQIDNO 4的氨基画g 293--307)
QMALDVYNGLLPPYASEQIDNO 4的氨基画1 297--311)
DVYNGLLPPYASCHLSEQIDNO 4的氨基画1301--315)
GLLPPYASCHLTELYSEQIDNO 4的氨基画g 305--319)
PYASCHLTELYFEKGSEQIDNO 4的氨基画g 309--323)
CHLTELYFEKGEYFVSEQIDNO 4的氨基画1313--327)
ELYFEKGEYFVEMYYSEQIDNO 4的氨基画1317--331)
EKGEYFVEMYYRNETSEQIDNO 4的氨基画1321--335)
YFVEMYYRNETQHEPSEQIDNO 4的氨基画g 325--339)
76-84DYYVGKKNI(SEQ ID NO8的氨基酸76-84)
108-116ALLPALGLL(SEQ ID NO8的氨基酸108-116)
109-117LLPALGLLL(SEQ ID NO8的氨基酸109-117)
115-123LLLffGPGQ(SEQ ID NO 8的氨基酸115-123)
STEAPl
86-94FLYTLLREV (SEQ ID NO 9 的氨基酸86-94)
102-116HQQYFYKIPILVINK(SEQ ID NO 9 的氨基酸 102-
262-270LLLGTIHAL(SEQ ID NO 9 的氨基酸262-270)
292-300MIAVFLPIV(SEQ ID NO 9 的氨基酸292-300)
PTHrp
42-51QLLHDKGKS(SEQ ID NO10的氨基_142-51)
59-68FLHHLIAEIH(SEQ ID NO10的氨基酸 59-68)
59-65FLHHLIA (SEQ ID NO 10 的氨基酸 59-65)
165-173TSTTSLELD(SEQ ID NO10的氨基_I 165-173)
TARP
4-13FPPSPLFFFL(SEQ ID NO11的氨基酸4-13)
27-35FVFLRNFSL(SEQ ID NO11的氨基_I 27-35)
29-37FLRNFSLML(SEQ ID NO11的氨基_I 29-37)
Prostein
31-39CLAAGITYV(SEQ ID NO12)
Eph
58-66IMNDMPIYM(SEQ ID NO13)
550-558VLAGVGFFI(SEQ ID NO14)
存活素
96-104LTLGEFLKL(SEQ ID NO15)
hTERT
973-981KLFGVLRLK(SEQ ID NO 16)
HER2
665-673WLGWFGI (SEQ ID NO 17)
15种TAA MHC II型的序列及相应的TAA和在TAA序列中的位置
激肽释放酶4
125-139SVSESDTIRSISIAS(SEQ ID NO 18)
155-169LLANGRMPTVLQCVN(SEQ ID NO 19)
160-174RMPTVLQCVNVSVVS(SEQ ID NO 20)
组蛋白H4
14-28GAKRHRKVLRDNIQG (SEQ ID NO 21 的氨基酸 14-28)
KRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLAR(SEQ ID NO21的氨
16-39基酸16-39)
31-45TKPAIRRLARRGGVK (SEQ ID NO 21 的氨基酸 31-45)
49-63LIYEETRGVLKVFLE (SEQ ID NO :21 的氨基酸 49-63)TYTEHAKRKTVTAMDVVYALKRQG (SEQ ID NO 21 的氨71-94基酸 71-94)TARP1-14MQMFPPSPLFFFLQ (SEQ ID N0:11)14-27QLLKQSSRRLEHTF(SEQIDN0:11)ENAH(bMena)502-510TMNGSKSPV(SEQ ID NO 22)PSMATGNFSTQKVKMHIHS (SEQ ID NO -J 的氨基酸334-348334-348)NYTLRVDCTPLMYSL (SEQ ID NO -J 的氨基酸459-473459-473)YRHVIYAPSSHNKYA (SEQ ID NO -J 的氨基酸687-701687-701)RQIYVAAFTVQAAAE (SEQ ID NO -J 的氨基酸730-744730-744)于37°C、5% CO2温育40小时后，用1 μ g/mL生物素化抗人IFN- γ抗体(Mabtech，
克隆MAb 7-B6-1，产品目录编号3420-6)，接着添加1/5000稀释的链霉亲合素-碱性磷 酸酶(BD Pharmingen，产品目录编号554065)来检测IFN-γ分泌。用Vector Blue底 物(Vector Lab Inc.，产品目录编号SK-5300)对ELISpot板显色，并用自动斑点阅读仪 (Cellular Technology Ltd. ImmunoSpot S3B 分析仪和 CTL ImmunoSpot 4. 0 专业软件) 对斑点计数。如图12所示，在患者J-D-1001中在MVA-BN-PRO处理前检测到先前存在的针 对PSA的T细胞应答。抗PSA T细胞在处理后显著增加，而抗PAP T细胞只在处理后检测 到。此数据指示MVA-BN-PRO在人中是有免疫原性的，而且同时诱导抗PSA和抗PAP这两种 应答是能实现的。MVA-BN-PRO处理还导致针对载体MVA-BN的强T细胞应答。最重要的是， MVA-BN-PRO处理还导致针对其它肿瘤抗原的T细胞应答的扩散，正如用TAA MHC I和II肽 集合刺激的T细胞生成IFN- γ所例证的。这指示由MVA-BN-PRO诱导的免疫应答导致对肿 瘤细胞的杀伤，接着是针对其它肿瘤抗原的抗肿瘤应答的放大。抗原扩散是对抗肿瘤保护 性免疫力的诱导中的重要事件，因为它防止肿瘤逃避由疫苗诱导的应答。因此，MVA-BN-PRO 在人中介导针对两种肿瘤抗原的免疫应答的能力是提供有效免疫疗法的特性。
权利要求
一种用于治疗人类癌症患者的方法，包括对患者施用一种重组MVA，其编码包含人前列腺特异性抗原(PSA)抗原的多肽和包含人前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原的多肽。
2.权利要求1的方法，其中所述MVA是MVA-BN。
3.权利要求1的方法，其中所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQID NO :1和SEQ ID NO2。
4.权利要求1的方法，其中所述PSA抗原和所述PAP抗原插入在MVA基因间区 014L/015L 中。
5.权利要求1的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
6.权利要求1的方法，其中所述癌症是前列腺癌转移。
7.权利要求1的方法，其中所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷之前施用的。
8.权利要求1的方法，其中所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷的同时施用的。
9.权利要求1的方法，其中所述重组MVA是在破坏肿瘤剂量的紫杉烷之后施用的。
10.权利要求7的方法，其中所述紫杉烷是多西他塞或帕利他塞。
11.权利要求9的方法，其中所述紫杉烷是多西他塞或帕利他塞。
12.一种用于预防前列腺癌的试剂盒，包括(a)一种重组MVA，其编码包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及(b)在检测到前列腺癌之前施用所述重组MVA的指令。
13.一种用于治疗前列腺癌的试剂盒，包括(a)一种重组MVA，其编码包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及(b)对前列腺癌患者施用所述重组MVA的指令。
14.一种用于治疗癌症患者的试剂盒，包括(a)一种重组MVA，其编码包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽；及(b)在用破坏肿瘤剂量的紫杉烷处理之前、同时、或之后施用所述重组MVA的指令。
15.一种重组MVA病毒，其表达包含人PAP抗原的多肽。
16.权利要求15的重组MVA病毒，其中所述MVA病毒包含SEQID NO :2。
17.权利要求15的重组MVA病毒，其中所述MVA是MVA-BN。
18.一种重组MVA病毒，其表达包含人PSA抗原的多肽和包含人PAP抗原的多肽。
19.权利要求18的重组MVA病毒，其中所述MVA病毒包含核苷酸序列SEQIDNO :1。
20.权利要求18的重组MVA病毒，其中所述MVA病毒包含SEQID NO :2。
21.权利要求18的重组MVA病毒，其中所述MVA是MVA-BN。
22.一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PAP抗原的多肽，其中 所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PAP的B细胞和T细胞免疫应答。
23.一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PAP抗原的多肽，其中 所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PAP的抗体。
24.权利要求23的重组MVA病毒，其中所述MVA病毒包含SEQID NO :2。
25.一种免疫原性组合物，包含一种重组MVA病毒，其编码包含人PSA抗原的多肽和包 含人PAP抗原的多肽，其中所述免疫原性组合物在对宿主施用时诱导针对PSA和PAP的B 细胞和T细胞免疫应答。
26.一种用于诱导针对PAP的B细胞和T细胞免疫应答的方法，包括对患者施用引发剂量的重组MVA，该重组MVA编码包含人前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原的多肽，及施用一个或 多个强化剂量的重组MVA，该重组MVA编码包含PAP抗原的多肽。
27.权利要求26的方法，其中对患者施用IXIO8TCID5ci的引发剂量及2XIO8和 4 X IO8TCID50的两个强化剂量。
28.权利要求27的方法，其中所述强化剂量是在所述引发剂量之后四周和八周时给予的。
全文摘要
本发明涉及用于使用编码肿瘤相关抗原(诸如PSA和PAP)的重组MVA病毒来预防和治疗癌症的组合物、试剂盒、和方法。重组MVA病毒能诱导B和T细胞应答。所述重组MVA病毒可以在紫杉烷之前、同时、或之后施用。
文档编号A61K39/00GK101888853SQ200880119351
公开日2010年11月17日 申请日期2008年10月16日 优先权日2007年10月18日
发明者斯蒂法尼·曼德尔, 法特玛·勒格兰德, 瑞安·B·朗特里, 阿兰·德尔凯尔, 雷纳·劳斯 申请人:Bn免疫疗法股份有限公司