专利名称：天然2β,3α,7β,19α-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸的用途及其组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药及功能食品领域，涉及一种防治重金属中毒的天 然提取物及其应用。
背景技术：
重金属污染主要是指由于铅、汞、砷等重金属及其化合物引起的污染。 随着工业、交通运输业的迅速发展，重金属及其化合物的用量大增，重金 属及其化合物不能降解，当它们扩散到大气、水体、土壤等环境中，就造 成环境的污染；部分学习用品、食品、药物和日用品中也含有重金属及其 化合物；人们避免不了与重金属元素接触，在不知不觉中，重金属元素通 过呼吸道、消化道和皮肤三种途径进入人体，随血液循环而被全身各组织 迅速吸收。
重金属元素对人体的危害很大铅对神经、免疫、造血、消化、生长 等系统器官严重损害，尤其是对正处于发育阶段的儿童认知和神经行为等 脑功能危害更大，严重影响其生长和智力发育。铅可通过胎盘对胎儿造成 危害，影响胎儿发育，造成胎儿畸形；汞具有急毒性，成年人的致死量为 O.l克，汞对中枢神经直接损害，具有生殖毒性，对肝脏、肺等器官有毒性， 汞与铅一样可通过胎盘对胎儿造成危害；砷和汞一样，也具有急毒性，人 体摄入0.1克的三氧化二砷会中毒身亡，砷是国际肿瘤机构(IARC)确认的人
4类致癌物之一，可引起皮肤癌，肺癌，膀胱癌和肾癌，砷对人体的心血管 系统、肺和皮肤的损害都非常大。可见，重金属严重危害人类及其后代健 康。
受到重金属严重危害的人群还有冶炼业、铅矿的开采、油漆染料的生 产和使用、蓄电池厂及交通警察等人群以及环境中重金属含量偏高地区的 人群。由于部分日用品、药品和食品中含有重金属，使得重金属的应用更 为广泛，对人类的毒害也随着传播。
重金属在人体内排泄极慢，如骨铅生物半衰期约20年，皮质骨内铅生 物半衰期更长。并且，即使环境铅浓度降至允许值以下，长期少量重金属 吸收所引起累积性损害也难以避免。如汞、砷等重金属危害更为严重，如 不及时从人体内排出，对人体毒害很大，仅靠降低环境铅预防重金属中毒 对人体损害尚嫌不足，急需使用药物或制剂对重金属进行预防和治疗。
据何凤生著作(何凤生主编.中华职业医学.北京人民卫生出版社.1
999.225.)及梁萍(梁萍，依地酸钙钠治疗铅中毒患者的护理[J],中华护理杂 志，2005,40(2):105-106.)等研究报导，临床治疗重金属中毒药物主要是二巯基 丁二酸钠(Na-DMS)、 二巯基丙磺酸钠(DMPS)及二巯基丁二酸(DMSA)和依 地酸f丐。该螯合剂驱铅药物对肾脏具有一系列毒性作用，并且具有发烧、 皮肤疹、肝功能异常、头晕、低血压等副作用；有的驱重金属药物并没有 说明铅能排出体外，很有可能降低某些器官的铅含量，而升高其它器官的 铅含量；此外，该类药物不具有预防重金属中毒的功效。
目前，市场上已经有不少治疗重金属中毒的药物，但是预防重金属中 毒的制剂很少。因此，急需研制出一种既能预防重金属中毒，防止重金属对人体危害的制剂，又能治疗重金属中毒的制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种天然2卩，3a， 7卩，19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸的新用途，以及由其构成的组合物，它可以大幅度降低人体内各器官 的重金属含量，既能预防重金属中毒，又能治疗重金属中毒，具有安全无 毒、无副作用的特点。
本发明提供的天然邻，3a， 7p， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸能够在 制备预防和治疗重金属中毒的病症的药物和保健食品中的应用。
本发明提供的预防和治疗重金属中毒的组合物，其特征是含有有效量 的天然2P， 3cx， 7p， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸，以及一种或一种以上 的食品或药学上能够授受的载体。组合物的剂型可以是为片剂，胶囊剂， 颗粒剂，咀嚼片或口服液。
上述组合物的优选的组合及质量百分比2P， 3a， 7(3， 19a-四羟基乌 苏-12-烯-28-羧酸为:1%國98.5%;没食子酸0.5-20%;山奈酚0.5-20%; 杨梅素0.5-59°/。。
上述组合物的进一步优选的组合及质量百分比为2P， 3a， 7|3， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸为10%-60%;没食子酸8%-17°/。；山奈酚 8%-21%;杨梅素24%-52%。
2P， 3a， 7P， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸是从包括火棘果、金樱子、 沙梨、刺梨在内的蔷薇科植物的果实中提取的。2P， 3ct， 7P， 19cc-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸的提取过程依次为 (l)提取将蔷薇科植物的果实破碎，加入5-12倍量柱体积的0%-95% 乙醇，超声提取l-5小时，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓縮，得到浓 縮浸膏；HPLC检测2(3， 3a， 7(3, 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸含量为
1-20%;
(2) 富集浓縮浸膏过大孔吸附树脂，用蒸馏水洗至柱流液无色，以
3-10倍量柱体积的15%-30%乙醇洗脱杂质，再以3-10倍量柱体积的 50%-90%乙醇梯度洗脱；收集50%-90%的组分，减压浓縮，得到的浸膏冷 冻干燥；
(3) 纯化将冷冻干燥的样品，上硅胶柱，用氯仿-甲醇洗脱，高效液相 跟踪检测，合并相同组分，反复重结晶，可得到含量为30%-98.5%的2P， 3a， 7(3， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸。
本发明克服了现有的排重金属药物药效低，对人体器官有毒副作用等 不足，是一种安全无毒、无副作用、大大降低人体内各器官的重金属含量， 高效将重金属离子排出体外的纯天然制剂，该制剂既能预防重金属中毒， 又能治疗重金属中毒。下面举例说明本发明对铅、砷和汞中毒的预防和治 疗功效。
本组合物小鼠排铅实验结果(见表l)表明，其排铅效果无论是血铅、 脑铅、肝铅、股骨铅都低至模型组的一半以下，与文献报道的小鼠排铅实 验(李俊鹏等，QQL排铅口服液促进排铅功能研究[J]，中华医学研究杂 志.2006,6 (8): 865-866;张久红等，沙棘果粉促进排铅作用的实验研究[J], 沙棘.2005,18(3): 25-26;卢建中等，排铅咀嚼片对染铅小鼠促排铅作用的研究[J]，中药材.2005， 28 (1) : 46-47)等相比，效果更佳。粪便铅检测 结果据表明，本组合物能把铅排出体外。
本组合物小鼠排砷实验结果(见表2)表明，其排砷效果无论是血砷、 脑砷、肝砷都低至模型组的一半以下，与文献报道的小鼠排砷实验(蔡威 黔等，强化SOD刺梨汁对砷中毒大鼠、小鼠的治疗研究[J]，中国药学杂志， 2001， 36 (12): 817-822)相比，效果更佳。粪便砷检测结果表明，本组合 物能将砷排出体外。
本组合物小鼠排汞实验结果(见表3)表明，其排汞效果无论是血汞、 脑汞、肝汞都低至模型组的一半以下，与文献报道的小鼠排汞实验(刘起 展等，剌梨利康饮对汞中毒大鼠汞铜锌含量的影响[J]，广东微量元素科 学.1999,6(8):14-16;)相比，效果更佳。粪便汞检测结果表明，本组合物能 把汞排出体外。
综上所述，本发明提及的组合物在防治重金属积蓄上，具有独特疗效。
具体实施例方式
以下是本发明的实施例，本发明给出的实施例是为了进一步说明本发 明的具体实施例方案，而不是用来限制本发明的保护范围。 具体实施例l
称取刺梨干果20千克，破碎，加入12倍量的50%乙醇，超声提取5 小时，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓縮；浓縮物上大孔吸附树脂柱， 用蒸馏水洗至柱流液无色，以8倍量柱体积的30%乙醇洗脱杂质，再以10 倍量柱体积的75%乙醇梯度洗脱；收集75%的组分，浓縮，冷冻干燥；将冷冻干燥的样品，上硅胶柱，用氯仿-甲醇(100:0-80:20)洗脱，高效液相 跟踪检测，合并相同组分，反复重结晶，可得到产品A205g(HPLC检测2P， 3a， 7(3， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸含量为85%);取产品A20g与没食 子酸1.8g、山奈酚1.8g、杨梅素6.4g组合，得到含56.67% 2卩，3a， 7卩，19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸的组合物。
具体实施例2
称取火棘果鲜果10千克，破碎，加入8倍量的95%乙醇，超声提取l 小时，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓縮；浓縮物上大孔吸附树脂柱， 用蒸馏水洗至柱流液无色，以10倍量柱体积的25%乙醇洗脱杂质，再以4 倍量柱体积的90%乙醇梯度洗脱；收集90%的组分，浓縮，冷冻干燥；将 冷冻干燥的样品，上硅胶柱，用氯仿-甲醇(100:0—80:20)洗脱，高效液相 跟踪检测，合并相同组分，反复重结晶，可得到产品A283g(HPLC检测2P， 3a， 7卩，19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸含量为65%);取产品A10g与没 食子酸lg、山奈酚lg、杨梅素3g组合，得到含43.3% 2(3， 3a， 7(3， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸的组合物。
具体实施例3
称取金樱子干果10千克，破碎，加入5倍量的水，超声提取3小时， 过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓縮；浓縮物过大孔吸附树脂，用蒸馏 水洗至柱流液无色，以6倍量柱体积的20%乙醇，再以9倍量柱体积的60% 乙醇洗脱；收集60%的组分，浓縮，冷冻干燥；将冷冻干燥的样品，上硅胶柱，用氯仿-甲醇洗脱，高效液相跟踪检测，合并相同组分，反复重结晶，
可得到产品A241g (HPLC检测2(3， 3a, 7p, 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧 酸含量为58%);取产品A10g与没食子酸1.6g、山奈酚1.8g、杨梅素6.6 g组合，得到含29%2卩，3a， 7卩，19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸的组合物。
具体实施例4
称取火棘果鲜果10千克，破碎，加入12倍量的水，超声提取4小时， 过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓縮；浓縮物上大孔吸附树脂柱，用蒸 馏水洗至柱流液无色，以IO倍量柱体积的15%乙醇洗脱杂质，再以7倍量 柱体积的80%乙醇洗脱；收集80%的组分，浓縮，冷冻干燥；将冷冻干燥 的样品，上硅胶柱，用氯仿-甲醇(100:0—80:20)洗脱，高效液相跟踪检测， 合并相同组分，反复重结晶，可得到产品A175g (HPLC检测2P， 3a， 7(3， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸含量为40。/。);取产品A25g与没食子酸llg、 山奈酚15g、杨梅素49g组合，得到含10%20， 3a， 7p， 19a-四羟基乌苏 -12-烯-28-羧酸的组合物。
具体实施例5
称取刺梨鲜果15千克，破碎，加入7倍量的95%乙醇，超声提取1.5 小时，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓縮；浓縮物上大孔吸附树脂柱， 用蒸馏水洗至柱流液无色，以10倍量柱体积的22%乙醇洗脱杂质，再以7 倍量柱体积的95%乙醇洗脱；收集95°/。的组分，浓縮，冷冻干燥；将冷冻 干燥的样品，上硅胶柱，用二氯甲垸-甲醇(100:0—80:20)洗脱，高效液相复重结晶，可得到产品A22g(HPLC检测2(3， 3a， 7p， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸含量为85%);取产品A7g与没食 子酸0.8g、山奈酚0.8g、杨梅素1.4g组合，得到含60% 2J3， 3a， 7|3， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸的组合物。
具体实施例6
称取金樱子鲜果20千克，破碎，加入12倍量的95%乙醇，超声提取5 小时，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓縮；浓縮物上大孔吸附树脂柱， 用蒸馏水洗至柱流液无色，以10倍量柱体积的30%乙醇洗脱杂质，再以9 倍量柱体积的95%乙醇洗脱；收集95%的组分，浓縮，冷冻干燥；将冷冻 干燥的样品，上硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇(100:0—80:20)洗脱，高效液相 跟踪检测，合并相同组分，反复重结晶，可得到产品A4.5g(HPLC检测213， 3a， 7(3， 1901-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸含量为98.5%)。
动物实验
取具体实施例1中含56.67 % 2(3， 3a， 7p， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸的组合物20g， 0.2g微晶纤维素，阿拉伯胶0.2g，硬脂酸镁0.2g， 9.4g 淀粉，过筛，压片，制成70粒片剂。
将该片剂用1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成400mg/L， 200mg/L， 100mg/L高、中、低三种剂量的悬浊液，冰箱储存备用，进行排砷、排铅、 排汞实验。
取具体实施例1中的产品A用1。/。 CMC-Na配成400mg/L的悬浊液，冰箱储存备用，进行排砷、排铅、排汞实验。
动物实验l-排砷实验
取20士2g昆明小鼠54只，雌雄各半，按体重随机分成9组，每组6 只。组I为正常组；组II为三氧化二砷模型组；组III、组IV、组V为预防
组；组vi、组vn、组vm为治疗组；组IX为产品A。
正常组I饮用去离子水；组lI一组IX的饮用水中含浓度为75mg七"三氧化 二砷；组m—组V以及组IX从实验开始第一天每天按20ml《g"小鼠体重灌 服前述的三个剂量的混悬液；组VI—组VIII在20天后每天按20 ml'Kg"小鼠 体重灌服前述的三个剂量的混悬液；组IX从实验开始第一天每天按20 ml-Kg"小鼠体重灌服前述的产品A剂量的混悬液;所有动物在第25天和31天 分别放入代谢笼中收集粪便，第32天摘眼球取血，处死，取脑、肝等样品， 微波消解，原子吸收分光光度计测定砷的含量，所有数据处理使用SPSS 13.0 统计软件处理。试验结果见表l。
表l片剂排砷实验小鼠血液、组织、粪便中的砷含量(M士SZ))
组别 I血砷(Hg/ml) 0屈0±0.002346**脑砷(ng/g) 0.102±0.0249**肝砷(ng/g) 0.884±0.269**粪便砷(pg/g) 0.304±0.317**
II0.2796±0.簡1.532±0.2662.435±0.362.152±1.443
III0.2714±0.03991.444±0.1722,152±0.6762.473±0.664
IV0.1985±0.0241*0.903随116*1.644±0.442*4.604±0.718**
V0.1366±0.0102**0.7181士0.141"1.291±0.359**6.583±0.887**
VI0.2736±0.02681.494±0.2932.244±0.4362.551±0.548
VII0.2377±0.0197*1.141±0.302*1.887±0.2713.556±0.773*
VIII0.1684±0.0244**0.8631±0.224*1.424±0.305*6.082±0.958**IX 0.1487±0,0203** 0.977U0.304* 1.597±0.285* 5.776±0.821**
注:模型组II比较，*P<0.05; **P<0.01
由表1可知，本实验结果表明模型对照组血砷、脑砷、肝砷、粪便砷含 量都显著高于空白对照组，提示小鼠体内已有一定水平的砷负荷，造模成 功。实验组各剂量的血砷、脑砷、肝砷含量比模型组明显降低。表明本制 剂能有效降低小鼠血砷、脑砷、肝砷浓度。粪便中砷含量与血砷、脑砷、 肝砷的浓度相反，粪便砷含量高的组其血砷、脑砷、肝砷含量相当较低， 由此可见，不仅是单一的产品A组IX，还是产品A的组合物组ni-组vm都能
有效降低小鼠体内各器官的砷含量，并将体内的砷排出体外，排砷效果都 很显著。
综上所述，本制剂具有很好的排砷效果。
动物实验2-排铅试验
取20士2g昆明小鼠54只，雌雄各半，按体重随机分成9组，每组6 只组I为正常组；组II为醋酸铅模型组；组III、组IV、组V为预防组；
组vi、组vn、组vm为治疗组；组ix为产品A。
正常组I饮用去离子水；组II-组IX的饮用水中含浓度为0.336 g'U1醋 酸铅；组in组-V组以及组IX从实验开始第一天每天按20ml《g"小鼠体 重灌服前述的三个剂量的混悬液；组VI -组VIII在20天后每天按20 ml《g" 小鼠体重灌服前述的三个剂量的混悬液；所有动物在第25天和31天分别 放入代谢笼中收集粪便，第32天摘眼球取血，处死取脑、肝和股骨等样品， 经用微波消解采用原子吸收分光光度计测定铅的含量。所有数据处理使用SPSS13.0统计软件处理，试验结果见表2。
表2排铅实验小鼠血液、组织、粪便中的铅含量(M±5D)
组别血铅(照/ml)脑铅(將/g) 肝铅(吗/g) 股骨铅(叫/g) 粪便铅(吗/g)
I0.05±0.01 **0.737±0.124**4.96±0.68**9.149±0.286 **6.723±0.858 *'
II2.1±0.1515.67±1.52533.41±3.639106.6±8.34317.44±1.773
III1.71±0.213.856±0.69 **15.716±1.748**15.23±2.54 **55.09±4.387**
IV0.97±0.16 *6.291±1.03 **16.793士1.403"36.45±3.217**48.38±4.012**
V0.29±0.28 **5.717±0.95 **19.294±1.83**47.15±3.841**43.55±3.034**
VI1.93±0.23.662±0.78 **8.438士1.06"54.69±7.043**41.71±3.789**
VII1.04±0.18**3.54±0.816**15.482±1.632**62.45±4.27 **36.42±2.982**
vm0.56±0.15 **2.394±0.414 **16.878±1.873"95.37±7.48423.15±2.175
IX0.9925±0.27 **5.876±0.114**16.338±1.472**65.97±8.21 **42.19±5.015**
注:模型组II比较，*P<0.05; **P<0.01
由表2可知，本实验结果表明模型对照组血铅、脑铅、肝铅、股骨铅、 粪便铅含量都显著高于空白对照组，提示小鼠体内已有一定水平的铅负荷， 造模达到良好效果。供试剂量中有血铅、脑铅、股骨铅、肝铅含量比阳性 组对应项含量明显降低，甚至都低至模型组的一半以下。表明本制剂能有 效降低小鼠血铅、脑铅、股骨铅、肝铅浓度。粪便中铅含量与血铅、脑铅、 股骨铅、肝铅的浓度相反，粪便铅含量高的组其血铅、脑铅、股骨铅、肝 铅含量相当较低，由此可见，不仅是单一的产品A组IX，还是产品A的组合
物组ni-组vm都能有效降低小鼠体内各器官的铅含量，并将体内的铅排出
体外，排铅效果都很显著。
综上所述，本制剂具有很好的排铅效果。
动物实验3-排汞试验取20士2g昆明小鼠54只，雌雄各半，按体重随机分成9组，每组6 只组I为正常组；组II为氯化汞模型组；组III、组IV、组V为预防组；
组vi、组vn、组vm为治疗组；组ix为产品A。
正常组I饮用去离子水；组II-组IX的饮用水中含浓度为O.l g丄"氯化汞； 组ni组-V组以及组IX从实验开始第一天每天按20 ml'Kg—'小鼠体重灌服前 述的三个剂量的混悬液；组VI -组￥111在20天后每天按20 ml《g"小鼠体重灌 服前述的三个剂量的混悬液；所有动物在第25天和31天分别放入代谢笼中 收集粪便，第32天摘眼球取血，处死取脑、肝等样品，经用微波消解采用 原子吸收分光光度计测定汞的含量。所有数据处理使用SPSS 13.0统计软件 处理。试验结果见表3。
表3排汞实验小鼠血液、组织、粪便中的汞含量(M士5D)
组别血汞(Hg/ml)脑汞(ng/g)肝汞(ng/g)粪便汞(Hg/g)
I0.021±0扁8**0.0199±0.0033**0扁5土0扁32"0.134±0.0241**
II0.12±0.00910.4418±0.09380.4796±0.01332.556±1.48
III0.099±0.00130.3861±0.05640.3868±0.0571*4.874±0.663**
IV0.083±0.021*0.288肚0.4431*0.3491±0.0667*6.405±1.008**
V0.057±0.0011**0.1922±0.0411**0.2404±0.157**9.116±1.141**
VI0.031土0.0027"0.3982±0.05350.408±0.05593.334±0.874*
VII0.108±0.00680.2548±0.0438**0.281±0,0131**7.545±1.203*
VIII0.0872±0.0087*0.3066±0.0298*0.328±0.0447*5.973±1.302**
IX0.08522±0.0093*0.3347±0.0319*0.3485±0.03043*5.569±1.129**
注:模型组II比较，*P<0.05; **P<0.01
由表3可知，本实验结果表明模型对照组血汞、脑汞、肝汞、粪便汞含 量都显著高于空白对照组，提示小鼠体内己有一定水平的汞负荷，造模达
15到良好效果。供试剂量中有血汞、脑汞、肝汞含量比阳性组对应项含量明 显降低，甚至都低至模型组的一半以下。表明本制剂能有效降低小鼠血汞、 脑汞、肝汞浓度。粪便中汞含量与血汞、脑汞、肝汞的浓度相反，粪便汞 含量高的组其血汞、脑汞、肝汞含量相当较低，由此可见，不仅是单一的
产品A组IX，还是产品A的组合物组m-组vm都能有效降低小鼠体内各器官
的汞含量，并将体内的汞排出体外，排汞效果都显著。 综上所述，本制剂具有很好的排汞效果。
动物实验4-安全性实验
取实施例2中组合物用于安全性实验。
1. 小鼠急性毒性试验
采用最大耐受剂量法。取昆明小鼠各20只，体重分别为18-22g，雌雄 各半。受试物为实施例2中的组合物，以iy。CMC-Na配成浓度为500 mg / ml， 按0.2ml/10g体重经口灌胃，24小时内共灌胃3次，观察动物2周，并记录 中毒和死亡情况。 结果
小鼠急性毒性试验动物观察2周未出现中毒反应和死亡，雌性和雄性小 鼠最大耐受剂量(MTD)均大于30.0 g / kg体重。按急性毒性分级标准判定， 该受试物属无毒级。
2. 外周血微核实验
选昆明小鼠30只(25-30g)，随机分为6组，雌雄各半。设IO、 5、 2.5 g / kg体重3个组合物剂量组、阴性对照组(双蒸水)及阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg体重)。灌胃给药2次(灌胃容量0.2m1/10g体重)，间隔24h，于末次 给药后6h处死动物，将小鼠剪尾后弃去第l滴血，取第2滴血按常规方法制 作血涂片，晾干，甲醇固定，取出晾干然后用新配制的10。/。Giemsa染液染色 15min，冲洗后晾干，油镜下计数1000个嗜多染红细胞(PCE),记录微核 数。
表4外周血嗜多染红细胞(PCE)微核率(％。， n=6， m士sz))
组别剂量(g/kg)观察细胞数(个)微核率(％。)
阳性对照组0.040600022.7±3.84
正常组双蒸水60002.37±0.69*
高剂量组1060001.75±0.52*
中剂量组5.060002.11±0.77*
低剂量组2.560002.08±0.81*
注:与阳性对照组比较，*尸<0.05 3.小鼠骨髓细胞微核试验
取昆明种小鼠30只，体重25-30g，将动物随机分为5个组，每组6只， 雌雄各半，设IO.O、 5.0、 2.5g/kg体重3个组合物剂量组，l个阳性对照组(环 磷酰胺40mg/kg体重)和l个正常组(双蒸水)，间隔24h第二次灌胃，第二次 给药后6h处死动物，取双侧股骨骨髓制片，显微镜下每只动物镜检l OOO个 嗜多染红细胞(PCE)，微核发生率以含微核的PCE千分率计，进行统计处理 (X2检验)。
表5给片剂后24h骨髓微核率(％。， m±ot) 组别 剂量(g/kg) 观察细胞数(个)微核率(％。)阳性对照组 正常组 高剂量组 中剂量组 低剂量组
0.04 双蒸水 10 5.0 2.5
6000 6000 6000 6000 6000
29.3±2.97 2.84±0.73# 3.11士0.77#* 3.45士0.81#* 3.28±0.84#*
*:与阴性对照组比较，尸>0.05;#:与阳性对照组比较，尸<0.05 4.小鼠精子畸形实验
采用连续五天经口灌吸法进行试验，用体重25-35克雄性昆明小白鼠 30只，按体重随机分为6组，每组5只，以40mg / kg体重剂量的环境磷 酰胺为阳性对照(GP)，双蒸水为阴性对照组，取组合物lO.Og、 5.0g、 2.50g 分别加水至20ml，以0.4ml/20g体重灌胃，末次灌胃后30天(第35天)处 死动物，取两侧附睾制片，伊红染色，每组计数6只动物，每只动物计数 6000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率，并进行统计处理。 表6给片剂后第35天精子畸变率(％。， M士幼)
组别剂量(g/kg)细胞数(个:>畸形数(个:) 畸形率(o/00)
阳性对照组0.040600028547.5±6.23
阴性对照组双蒸水60006911.5±1.326
高剂量组1060007512.5±1.481*#
中剂量组5.060008814.67±1.875*#
低剂量组2.560008313.83±1.467*#
*:与阴性对照组比较，尸>0.05; #:与阳性对照组比较，尸<0.05 5.Ames试验
18选用鼠伤寒沙门氏菌TA97、 TA98、 TA100、 TA102试验菌株进行实验， 釆用渗入法和点试法，在两种方法中均分别加(+)或不加(-)体外活化系统(S9 混合液)对受试物进行测试。共设5个组合物剂量组，剂量设计分别为O.OOl、 0.005、 0.050、 0.500、 5.000 mg/皿，阴性对照组、阳性对照组，每个剂量 做三块平皿，试验重复一次。 结果
该受试物各剂量回变菌落数均未超过阴性对照菌落数两倍，也无剂量-反应关系，对鼠伤寒沙门菌落TA97、 TA98、 TAIOO、 TA102等试验菌株在 加与不加S卯寸，均不呈遗传毒性。 6.—般观察
用体重70g左右清洁级断乳大鼠48只，雌雄各半，随机分为4组，即对 照和3个受试物组。受试物以2.0、 1.0、 0.5g/kg组合物剂量经口给予各剂 量组大鼠，对照组给基础词料。连续30天单笼喂养，自由饮食。做血常规 及生化指标测定，计算肝、肾和脾重量，同时做病理学检查。
表7片剂对大鼠脏体比的影响(g， M±SD)
性别剂量(g/kg)肝/体(％)脾/体(％)肾/体(％)睾丸(卵巢)/体(％)
雄24.85±0.570.37±0.0470.98±0.331.18±0.23
14.73±0.440.33±0.0540.89±0.191.07±0.18
0.54.79±0.510.34±0.0320.95±0.21U4±0.22
04.76±0.490.35±0.0520.92±0.181.11±0.16
雌24.51±0.420.27±0扁0.98±0.220.07±0.01
14.67±0.530.32±0,371.05±0.310.09±0.02
0.54.63±0.390.30±0.0451.02±0.180.08±0.02
04.55±0.460.28±0.0310.99±0.230.08±0.03
各剂量组脏体比与对照组比较，无差异显著性(尸>0.05)。对肝、肾、 心、胃和十二指肠病理组织学检查，病理变化不大。
利用具体实施例2-6所得到组合物采用相同的方式进行上述动物实验，可以得到基本相同的结果。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于上述实 施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或 修改，都落入本发明保护的范围。
权利要求
1、一种天然2β，3α，7β，19α-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸在制备预防和治疗重金属中毒的病症的药物和保健食品中的应用。
2、 一种预防和治疗重金属中毒的组合物，其特征是含有有效量的天然 邻，3a， 7(3， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸，以及一种或一种以上的食品 或药学上能够授受的载体。
3、 根据权利要求2所述的组合物，其特征是其优选的组合及质量百分比2卩，3a， 7卩，19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸为1%-98.5%; 没食子酸0.5-20%; 山奈酚0,5-20%; 杨梅素0.5-59%。
4、 根据权利要求2所述的组合物，其特征是其进一步优选的组合及质 量百分比为2P, 3a， 7卩，19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸为10%-60%;没食子酸8%-17%; 山奈酚8%-21%; 杨梅素24%-52%。
5、 根据权利要求2、 3或4所述的组合物，其特征是2(3， 3a， 7(3， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸是从包括火棘果、金樱子、沙梨、刺梨在内 的蔷薇科植物的果实中提取的。
6、 根据权利要求5所述的组合物，其特征是2P， 3a, 7(3， 19a-四羟 基乌苏-12-烯-28-羧酸的提取过程依次为(l)提取将蔷薇科植物的果实破碎，加入5-12倍量柱体积的0%-95% 乙醇，超声提取l-5小时，过滤，重复3次，合并滤液，滤液浓縮，得到浓 縮浸膏；HPLC检测2(3， 3a， 7P， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸含量为1-20%;(2) 富集浓縮浸膏过大孔吸附树脂，用蒸馏水洗至柱流液无色，以3-10倍量柱体积的15%-30%乙醇洗脱杂质，再以3-10倍量柱体积的 50%-90%乙醇梯度洗脱；收集50%-90%的组分，减压浓縮，得到的浸膏冷 冻干燥；(3) 纯化将冷冻干燥的样品，上硅胶柱，用氯仿-甲醇洗脱，高效液相 跟踪检测，合并相同组分，反复重结晶，可得到含量为30%-98.5%的2p， 3a， 7p， 19a-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸。
7、根据权利要求2、 3或4所述的组合物，其特征是其剂型为片剂， 胶囊剂，颗粒剂，咀嚼片或口服液。
全文摘要
本发明公开了一种防治重金属蓄积的天然化合物或其组合物的应用，该化合物是2β，3α，7β，19α-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸，组合物的优选的组合及质量百分比2β，3α，7β，19α-四羟基乌苏-12-烯-28-羧酸为1％-98.5％；没食子酸0.5-20％；山奈酚0.5-20％；杨梅素0.5-59％。该物质本身或其与没食子酸、山奈酚、杨梅素组合的组合物，都是从植物中分离纯化得到的天然产物，并且都能防治重金属中毒，促进人体内重金属离子的快速排出。
文档编号A61K31/56GK101455670SQ200910060449
公开日2009年6月17日 申请日期2009年1月5日 优先权日2009年1月5日
发明者余龙江, 吴江英, 娜 廖, 敖明章, 月 石, 马素燕 申请人:华中科技大学