专利名称：：百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明提供一种百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，用吸附无细胞百白破联合疫苗、AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，预防脑脊髓膜炎、肺炎、百日咳、白喉及破伤风等重要疫病，属于疫苗生产制备
技术领域：
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背景技术：
：流行性脑脊髓膜炎(流脑)主要发病人群是婴幼儿，A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗主要用于婴幼儿预防使用。二十世纪八十年代，随着流脑多糖疫苗开发成功和纳入计划免疫，全球范围内接种人数逐年上升，发病率逐年下降。我国的流脑发病以A群为主，因此开发的疫苗均为A群多糖或A+C群双价多糖疫苗，但是2000年在贵州、2004年在河北分别爆发了流脑，造成当地的恐慌，经流行病学调査证明，引起流行的是C群菌株，这就引起了疾病控制部门的重视。现行A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗安全，有效，保护率可达80-90%。但该疫苗对2岁以下婴幼儿免疫效果差，接种一剂不能达到抗体保护水平，且抗体很快消失。因该疫苗与其它多糖疫苗一样，属T细胞非依赖性抗原，2岁以下婴幼儿免疫系统尚未发育成熟.，对大多数荚膜多糖的抗体应答反应较弱，仅产生低水平的特异性抗体，多糖结合物可刺激婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合成，并可加强应答，与非结合物疫苗相比还提高了免疫球蛋白(IgG)的抗体比例。b型流感嗜血杆菌(Hib)通过飞沫传播感染，引起五岁以下儿童鼻咽炎、会咽炎等原发性疾病；细菌从局部进入血液或通过血脑屏障，引起肺炎、化脓性脑膜炎、关节炎、骨髓炎、心包炎和败血症等严重的侵袭性疾病。WHO指出全世界每年有300万例的Hib感染，其中死亡6万例(2%)，在发达国家以脑膜炎为主，在发展中国家以肺炎为主。鉴于A、C群脑膜炎球菌和b型流感嗜血杆菌引起疾病的严重性和疫苗的有效性，研发该疫苗具有极其重要的意义。在目前已使用Hib疫苗的38个国家中，其免疫程序遵照的原则是l)在出生后2-6月龄之间完成基础免疫程序，每剂注射间隔至少l个月；2)出生后12-24个月之间可以进行一次加强免疫。遵照这一原则，用吸附无细胞百白破联合疫苗、AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，于出生后2-6月龄之间完成基础免疫，12-24个月之间完成加强免疫。按该免疫程序可同时预防A、C群的疾病、百日咳、白喉和破伤风，同时减少儿童免疫次数。
发明内容本发明提供一种百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，采用A、C群脑膜炎奈瑟氏双球菌、b型流感嗜血杆菌培养液，分别提取荚膜多糖，经过纯化、活化后，与破伤风类毒素结合，然后将A、C群脑膜炎多糖结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液与无细胞百白破原液按一定比例混合，获得一针多种免疫的效果。本发明联合疫苗含以下组分及含量A群脑膜炎球菌多糖10ygC群脑膜炎球菌多糖10ugb型流感嗜血杆菌多糖乳糖2.53.0mg无细胞百日咳原液18ygPN/ml白喉类毒素-25Lf/ml破伤风类毒素7Lf/ml氢氧化铝含量1.01.5mg/ml本发明联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤1.菌种的的选用选用A、C群脑膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血杆菌菌种，用于A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备。2.生产用种子启开工作种子批菌种，经适当传代，经检定合格后，接种改良半综合培养基或其他适宜培养基，制备数量适宜的生产用种子。3.生产用培养基采用改良半综合培养基或经批准的其他适宜培养基。培养基不应含有与十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。4.培养采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检査，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。5.收获和杀菌于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醒溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。6.去核酸将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六垸基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8。C静置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。7.沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%,充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一20。C以下，待纯化。8.多糖纯化将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15'C以下进行9.多糖活化、衍化与破伤风类毒素结合将理化检定合格的多糖经溴化氰活化，加入适宜比例的ADH(1、6—己二酰肼)反应过夜，然后用超虑或其他适宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH,过滤除菌，-2(TC保存。取样进行检定，检定合格后，将适宜浓度的多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等量混合，然后加入EDAC(碳二亚胺)，混合物2-8。C保持一定时间，用0.2MNaCl溶液透析过夜，将反应物用S印haroseCL-4B柱层析纯化，收集V。部分洗脱液，用NaOH调pH至中性，除菌过滤，既为结合物原液，2-8t:保存。10.半成品配制及分装将检定合格的A、C群脑膜炎球菌多糖结合苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液与无细胞百日咳原液按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，放2-8。C库待检。11.成品检定根据拟订的《AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制检暂行规程》及现行的《吸附无细胞百白破联合疫苗制造及检定规程》的相关要求进行全面检定。本发明优点在于1.无细胞百白破联合疫苗中含有氢氧化铝，作为佐剂成分，有如下特点1)吸附率高，第一针注射后即可达到快、高和持续久的免疫效果；2)适量的铝佐剂可逐步释放抗原，较长时间刺激免疫细胞；3)刺激体液免疫，产生更高滴度的IgG、IgE，激活Th2细胞。本发明巧妙利用佐剂氢氧化铝，制成百白破+八(:群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，接种人体后，不仅增强百白破免疫效果，还能增强A、C群脑膜炎球菌-Hib结合疫苗免疫效果。2.接种一针就可以预防流行性脑脊髓膜炎、Hib导致的疾病、百日咳、白喉和破伤风；3.提高疫苗覆盖率和接种率，减少儿童多次注射疫苗所带来的的痛苦，降低接种和管理上的费用，减少家长、儿童和医生的不便和工作量。具体实施例方式实施例1:200901批百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制备1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、b型流感嗜血杆菌58534菌株，接种于适宜琼脂培养基，于35—37'C二氧化碳的环境中培养16—20小时，涂片做革兰氏染色镜检，接种发酵罐培养。2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。3、将巳杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%,2_8°C静置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一20。C以下，待纯化。4.将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.lraol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15'C以下进行。5.将理化检定合格的多糖经溴化氰活化，加入适宜比例的ADH(1、6—己二酰肼)反应过夜，然后用超虑或其他适宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH，过滤除菌，冻干(或-2(TC)保存。取样进行检定，检定合格后，将适宜浓度的多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等量混合，然后加入EDAC(碳二亚胺)，混合物2-8'C保持一定时间，用0.2MNaCl溶液透析过夜，将反应物用S印haroseCL-4B柱层析纯化，收集V。部分洗脱液，用NaOH调pH至中性，除菌过滤，既为结合物原液，2-8'C保存。6.半成品配制及分装将检定合格的AC群脑膜炎球菌多糖结合苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液与无细胞百日咳原液按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量O.5mL/瓶，放2-8°C库待检。7.成品检定根据拟订的《AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制检暂行规程》及现行的《吸附无细胞百白破联合疫苗制造及检定规程》的相关要求进行全面检定。实施例2:200902批百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制备1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、b型流感嗜血杆菌58534菌株，接种于适宜琼脂培养基，于35—37。C二氧化碳的环境中培养16—20小时，涂片做革兰氏染色镜检，接种发酵罐培养。2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检査，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。3、将己杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8'C静置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一20。C以下，待纯化。4.将粗制品溶解于1/IO饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15。C以下进行。5.将理化检定合格的多糖经溴化氰活化，加入适宜比例的ADH(1、6—己二酰肼)反应过夜，然后用超虑或其他适宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH，过滤除菌，冻干(或-20'C)保存。取样进行检定，检定合格后，将适宜浓度的多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等量混合，然后加入EDAC(碳二亚胺)，混合物2-8r保持一定时间，用0.2MNaCl溶液透析过夜，将反应物用S印haroseCL-4B柱层析纯化，收集V。部分洗脱液，用NaOH调pH至中性，除菌过滤,既为结合物原液，2-8'C保存。6.半成品配制及分装将检定合格的AC群脑膜炎球菌多糖结合苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液与无细胞百日咳原液按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，放2-8'C库待检。7.成品检定根据拟订的《AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制检暂行规程》及现行的《吸附无细胞百白破联合疫苗制造及检定规程》的相关要求进行全面检定。实施例3:200903批百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制备1.取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、b型流感嗜血杆菌58534菌株，接种于适宜琼脂培养基，于35—37'C二氧化碳的环境中培养16—20小时，涂片做革兰氏染色镜检，接种发酵罐培养。2.采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检査，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。3.将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8。C静置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一20。C以下，待纯化。4.将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取敎次，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15'C以下进行。5.将理化检定合格的多糖经溴化氰活化，加入适宜比例的ADH(l、6—己二酰肼)反应过夜，然后用超虑或其他适宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH，过滤除菌，冻干(或-20°C)保存。取样进行检定，检定合格后，将适宜浓度的多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等量混合，然后加入EDAC(碳二亚胺)，混合物2-8。C保持一定时间，用0.2MNaCl溶液透析过夜，将反应物用S印haroseCL-4B柱层析纯化，收集V。部分洗脱液，用Na0H调pH至中性，除菌过滤，既为结合物原液，2-8'C保存。6.半成品配制及分装将检定合格的A、C群脑膜炎球菌多糖结合苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液与无细胞百日咳原液按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，放2-8°C库待检。7.成品检定根据拟订的《AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制检暂行规程》及现行的《吸附无细胞百白破联合疫苗制造及检定规程》的相关要求进行全面检定。试验例1:根据拟订的《AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制检暂行规程》和现行的《吸附无细胞百白破联合疫苗制造及检定规程》的要求对百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗进行全面检定，结果表一百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗效力试验<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表二百白破+AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗效力试验<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>试验结果表明，百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗是安全的、有效的，完全符合拟订的《AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗制检暂行规程》和现行的《吸附无细胞百白破联合疫苗制造及检定规程》的要求。权利要求1、一种百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，每支成品含以下组分及含量A群脑膜炎球菌多糖10μgC群脑膜炎球菌多糖10μgb型流感嗜血杆菌多糖10μg乳糖2.5～3.0mg无细胞百日咳原液18μgPN/ml白喉类毒素25Lf/ml破伤风类毒素7Lf/ml氢氧化铝含量1.0～1.5mg/ml。2、权利要求1所述联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤1)菌种的的选用选用A、C群脑膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血杆菌菌种，用于A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备；2)生产用种子启开工作种子批菌种，经适当传代，经检定合格后，接种改良半综合培养基或其他适宜培养基，制备数量适宜的生产用种子；3)生产用培养基采用改良半综合培养基或经批准的其他适宜培养基。培养基不应含有与十六垸基三甲基溴化铵形成沉淀的成分；4)培养采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃；5)收获和杀菌于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌，以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜；6)去核酸将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8t:静置l一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液；7)沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一20。C以下，待纯化；8)多糖纯化将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20呢/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液；提取过程应在15"C以下进行；9)多糖活化、衍化与破伤风类毒素结合将理化检定合格的多糖经溴化氰活化，加入适宜比例的ADH(1、6—己二酰肼)反应过夜，然后用超虑或其他适宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH，过滤除菌，-20。C保存；取样进行检定，检定合格后，将适宜浓度的多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等量混合，然后加入EDAC(碳二亚胺)，混合物2-8r;保持一定时间，用0.2MNaCl溶液透析过夜，将反应物用S印haroseCL-4B柱层析纯化，收集V0部分洗脱液，用NaOH调pH至中性，除菌过滤，既为结合物原液，2-8。C保存；10)半成品配制及分装将检定合格的A、C群脑膜炎球菌多糖结合苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液与无细胞百日咳原液按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，放2-8'C库待检。全文摘要本发明提供一种百白破、A+C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，采用A、C群脑膜炎奈瑟氏双球菌、b型流感嗜血杆菌培养液，分别提取荚膜多糖，经过纯化、活化后，与破伤风类毒素结合，然后将A、C群脑膜炎多糖结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液与无细胞百白破原液按一定比例混合，获得一针多种免疫的效果。文档编号A61K39/095GK101590225SQ20091006715公开日2009年12月2日申请日期2009年6月19日优先权日2009年6月19日发明者孙惠军,爽巨,冲李,杨宗辉,梁艳婷,牟盈盈申请人:长春长生生物科技股份有限公司