ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制作方法

专利名称：：ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明提供了一种ACYWu5群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，用于脑脊髓膜炎重要疫病的免疫预防，属于疫苗生产制备
技术领域：
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背景技术：
：流行性脑脊髓膜炎(流脑)主要发病人群是婴幼儿，ACYWb5群胞膜炎球菌多糖疫苗主要用于儿童尤其是婴幼儿预防使用，二十世纪八十年代，随着流脑多糖疫苗开发成功和纳入计划免疫，全球范围内接种人数逐年上升。我国的流脑发病以A群为主，因此开发的疫苗均为A群或A+C群双价疫苗，但是2000年在贵州、2004年在河北分别爆发了流脑，引起当地的恐慌，经流行病学调査证明，引起流行的是C群菌株，而在部分地区曾经分离到Ww群和Y群，尽管尚未引起流行，但也引起了疾病控制部门的重视。b型流感嗜血杆菌(Hib)通过飞沫传播感染，引起五岁以下儿童鼻咽炎、会咽炎等原发性疾病；细菌从局部进入血液或通过血脑屏障，引起肺炎、化脓性脑膜炎、关节炎、骨髓炎、心包炎和败血症等严重的侵袭性疾病。鉴于ACYW^群脑膜炎球和b型流感嗜血杆菌引起疾病的严重性和疫苗的有效性，研发该疫苗具有极其重要的意义。在目前己使用Hib疫苗的38个国家中，其免疫程序遵照的原则是l)在出生后2-6月龄之间完成基础免疫程序，每剂注射间隔至少l个月；2)出生后12-24个月之间可以进行一次加强免疫。遵照这一原则，ACYWus群脑膜炎球菌多糖-Hib联合疫苗可用于流脑多糖、Hib结合苗免疫后的加强免疫。接种该疫苗可同时预防ACYWm群引起的流行性脑脊髓膜炎及Hib导致的疾病。本发明的目标是开发一种能提高疫苗覆盖率、减少儿童免疫次数及保护效果更佳的联合疫苗。
发明内容本发明提供一种ACYW,35群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，具有一针多种免疫的功能。本发明还提供了上述疫苗的生产工艺。本发明的ACYWu5群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，每支成品(复溶后体积0.5ml)含以下组分及含量A群脑膜炎球菌多糖疫苗50WgC群脑膜炎球菌多糖疫苗50UgY群脑膜炎球菌多糖疫苗50UgW135群脑膜炎球菌多糖疫苗50"gb型流感嗜血杆菌结合疫苗10乳糖2.53.Omg。本发明联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤1.菌种的选用选用ACYW135群脑膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血杆菌菌种，用于冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备。2.生产用种子启开工作种子批菌种，经传代检定合格后，接种于综合培养基或其他适宜培养基，制备生产用种子。3.生产用培养基采用综合培养基，培养基不应含有与十六垸基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。4.培养采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。5.收获和杀菌于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检査，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。6.去核酸将己杀菌的培养液离心后收集上清液，加入十六垸基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六垸基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8t:静置l一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。7.沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一20。C以下，待纯化。8.多糖纯化将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15'C以下进行。9.内毒素去除取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2iim滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。10.半成品配制及分装将检定合格的ACYWw群脑膜炎球菌多糖原液，b型流感嗜血杆菌结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放28'C库待检。11.冻干将ACYW^群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为-35°(:预冻2小时，制品-40。C冷冻45小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，30'C以下恒温真空千燥56小时，全过程累计2024小时，制备出冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。12.成品检定根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。本发明的培养基不含有马血清或其他致敏物质；不含有能与cetavlon形成沉淀的成分或有害物质；培养基适于脑膜炎球菌繁殖生长，并适于产生丰厚的荚膜多糖物质；常用酸水解酪蛋白做基础液，加入酵母透析液、硫酸镁、葡萄糖等制成半综合培养基。美国则采用Frantz培养基，pH7.47.6。本发明与WHO规程有几点不同①细菌培养时间不通，冊0规程培养10-12h，国内只培养6-8h;②WHO规程对中间产品进行冻干，国内则放低温(-20°C)保存；我国ACYW135群流脑多糖疫苗质量控制指标与WHO规程比较见表41-5:表41-5:本发明疫苗规程质控指标与WHO规程比较质控指标冊0规程我国规程蛋白残量<1%<1%核酸残量<1%<10/0磷含量》8%>80/0Kd值<0.4<0.4Kd值〈0.4回收率>65%>65%濕^T廣范房^^^[^90.025iigAg0.025ygAg本发明采用ACYWm群脑膜炎奈瑟氏双球菌、b型流感嗜血杆菌培养液，分别提取荚膜多糖，经过纯化后，将ACYWu5群脑膜炎多糖原液与b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按一定比例混合，再加入适宜稳定剂冻干制成，用于预防ACY^,5群引起的流行性脑脊髓膜炎及Hib导致的疾病。本发明的积极效果在于运用超速离心法除去内毒素技术制备冻干ACYW135脑膜炎球菌多糖疫苗，从而确保ACYW^群脑膜炎球菌多糖原液的内毒素含量较离心前大大降低。使用本发明疫苗对患者来说一针就可以预防流脑的疾病传染，达到并超过以前打五针才能达到的预防效果，减少了患者的痛苦，降低了预防成本。具体实施例方式实施例1:200901批ACYWn5群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫的制备1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、Wns群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10%羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25。C不生长。于35—37。C二氧化碳的环境中培养16—20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检査，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或釆用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。3、将己杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六垸基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8。C静置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一2CTC以下，待纯化。4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/nil;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15。C以下进行。5、内毒素去除取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2ym滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。6、半成品配制及分装将检定合格的ACYWu5群脑膜炎球菌多糖原液-b型流感嗜血杆结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放28'C库待检。7、冻干将ACYWu5群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫半成品进行冷冻干燥，步骤为-35。C预冻2小时，制品-4(TC冷冻45小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，30'C以下恒温真空干燥56小时，全过程累计2024小时，制备出冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。实施例2:200902批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫的制备1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、W!35群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10%羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25'C不生长。于35—37"二氧化碳的环境中培养16—20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检査，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8。C静置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一20。C以下，待纯化。4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15'C以下进行。5、内毒素去除取AC5YWu群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2um滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。6、半成品配制及分装将检定合格的ACYWi35群脑膜炎球菌多糖原液-b型流感嗜血杆结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放28'C库待检。7、冻干将ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为-35匸预冻2小时，制品-4(TC冷冻4~5小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，30°C以下恒温真空干燥5~6小时，全过程累计20~24小时，制备出冻干ACYWI35群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。实施例3:200卯3批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫的制备1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、Wu5群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10%羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25'C不生长。于35—37'C二氧化碳的环境中培养16—20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检査，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六垸基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六垸基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8'C静置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一2(TC以下，待纯化。4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15'C以下进行。5、内毒素去除取ACsYW!3群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2um滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。6、半成品配制及分装将检定合格的ACYW^群脑膜炎球菌多糖原液-b型流感嗜血杆结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放28'C库待检。7、冻干将ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为-35'C预冻2小时，制品-40'C冷冻4~5小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，30'C以下恒温真空干燥5~6小时，全过程累计20~24小时，制备出冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。试验例11、按《中华人民共和国药典》2005版三部对A群脑膜炎球菌多糖疫苗制品的要求，我们对ACYW^群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗进行检定，以保证制品的安全性。ACYWu5群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗质量标准根据WHO《生物制品规程》<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2、按《中华人民共和国药典》2005版三部对A群脑膜炎球菌多糖疫苗制品的要求，我们对ACYWw群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗进行异常毒性试验，以保证制品的安全性。试验方法根据《中华人民共和国药典》2005版三部A群脑膜炎球菌多糖疫苗制造及检定3.4.3项要求，将三批ACYWn5群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗每批取样各100支，每批注射体重1822g小白鼠5只、每只腹腔注射(0.5ml/支)，250350g豚鼠2只，每只腹腔注射(5ml/支)，于注射后第7天进行观察，动物应健康存活，到期体重比注射前增加。结果按上述方法三批制品分别注射健康豚鼠二只、小白鼠五只,观察结果见表l、表2。表1三批四价脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗豚鼠异常毒性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2三批四价脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗小白鼠异常毒性试验结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>试验结果显示，动物健康存活，到期动物体重比注射前增加，表明三批ACYW群脑膜炎球菌多糖疫苗-b型流感嗜血杆结合疫苗是安全的，完全符合药典要求。权利要求1、一种ACYW135群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，每支成品含以下组分及含量A群脑膜炎球菌多糖疫苗50μgC群脑膜炎球菌多糖疫苗50μgY群脑膜炎球菌多糖疫苗50μgW135群脑膜炎球菌多糖疫苗50μgb型流感嗜血杆菌结合疫苗10μg乳糖2.5～3.0mg。2、权利要求1所述联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤1)菌种的的选用选用ACYW135群脑膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血杆菌菌种，用于冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备；2)生产用种子启开工作种子批菌种，经传代检定合格后，接种于综合培养基或其他适宜培养基，制备生产用种子；3)生产用培养基采用综合培养基或经批准的其他适宜培养基，培养基不应含有与十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分；4)培养采用培养罐液体培养；在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃；5)收获和杀菌于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养；取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌；以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜；6)去核酸将已杀菌的培养液离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8。C静置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液；7)沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一2(TC以下，待纯化；8)多糖纯化将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10一20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液；提取过程应在15。C以下进行；9)内毒素去除取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2um滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含10)半成品配制及分装将检定合格的ACYW135群脑膜炎球菌多糖原液，b型流感嗜血杆菌结合疫苗与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放28匸库待检；11)冻干将ACYWns群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为-35"C预冻2小时，制品-4(TC冷冻45小时，逐渐升温真空干燥1012小时，30°C以下恒温真空干燥5~6小时，全过程累计20~24小时，制备出冻干ACYW^群脑膜炎球菌多糖疫苗成品。全文摘要本发明提供一种ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-b型流感嗜血杆菌结合疫苗，运用超速离心法除去内毒素技术制备冻干ACYW₁₃₅脑膜炎球菌多糖疫苗，从而确保ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖原液的内毒素含量较离心前大大降低。使用本发明疫苗对患者来说一针就可以预防流脑的疾病传染，达到并超过以前打五针才能达到的预防效果，减少了患者的痛苦，降低了预防成本。文档编号A61P31/04GK101590226SQ20091006715公开日2009年12月2日申请日期2009年6月19日优先权日2009年6月19日发明者孙惠军,爽巨,冲李,杨宗辉,梁艳婷,牟盈盈申请人:长春长生生物科技股份有限公司