专利名称：与层粘连蛋白结合的神经生长因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与层粘连蛋白结合的神经生长因子及其编码基因与应用。
背景技术：
神经生长因子(NerveGrowth Factor, NGF)分子量为 140kDa 左右，由 α、β、 Y 3种亚基借非共价键构成，其组合比例为α2β y 2 (Greene and Shooter, 1980) 0其中 β亚基是由两条相同的单链以非共价健连接而成的同源二聚体，其单链含有118个氨基 酸残基。β亚基的三维空间结构单元是由三对反向平行的β折叠构成的一种立体构型， 含有四个环区。环区具有识别不同受体的特征，是NGF与受体结合产生信号转导的关键区 域(Greene LA, Shooter EM(1980)The nerve growth factor :biochemistry, synthesis, and mechanism of action. Annu Rev Neurosci3 :353_402.)。它是唯一具有 NGF 生物活 性的片段，可以完全表现NGF的功能效应(BaxB，Blundell TL, Murray-Rust J, McDonald NQ (1997) Structure of mouse 7S NGF -.a complex of nerve growth factor with four binding proteins. Structure5 :1275-1285.)。在生理情况下NGF可以调控交感和感觉神 经元的生长发育及分化。周围神经损伤后，NGF可保护神经元并促进轴突再生。因此NGF对 于神经系统疾病的治疗起着重要的作用(Sofroniew MV, Howe CL, Mobley WC(2001)Nerve growth factor signaling,neuroprotection, and neural repair. Annu Rev Neurosci24 1217-1281.)。临床应用证实，局部用药可以使神经直接得到营养，利于神经的轴浆流动，促使神 经再生。目前NGF治疗神经损伤的用药方式主要有①在损伤局部直接给药；②局部通过微 渗透泵缓慢释放；③通过转基因技术将表达NGF的细胞移植到损伤局部。然而在实际应用 中，由于体液的快速扩散作用，一次性在损伤局部直接给药无法使NGF长时间保留在神经 损伤部位，并保持有效的生物浓度，这造成了治疗的低效率。因此需要间隔性的多次给药， 这种方式需要的药物量很大，治疗费用非常昂贵，而且由于过量的使用NGF，会引起炎症反 应，带来副作用。微渗透泵存在有排斥反应和体内吸收问题；基因治疗的载体选择和安全性 问题较难解决，这些方法都难以在临床推广应用。层粘连蛋白是神经元细胞外基质的主要成分之一，它与其他细胞外基质共同构 成了神经元生长的空间支架(Yurchenco PD, Smirnov S, Mathus T(2002)Analysis of basement membrane self-assembly and cellular interactions with native and recombinant glycoproteins. Methods Cell Biol 69:111-144·)。当周围神经受到损伤 时，损伤部位的施旺细胞会大量分泌层粘连蛋白(Fu SY,Gordon T(1997)The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobioll4 :67_116.)。
发明内容
本发明的目的是提供一种与层粘连蛋白结合的神经生长因子及其编码基因与应用。
本发明提供的与层粘连蛋白结合的神经生长因子(LBD-NGF)，它自氨基末端至羧 基末端依次包括层粘连蛋白结合区和神经生长因子β亚基片段；所述层粘连蛋白结合区(LBD)如序列表的1所示。所述与神经生长因子β亚基片段为神经生长因子β亚基(GenBank Accession Number :AAA59931)自氨基末端第122-239位氨基酸残基；LBD是一个基本核心，在其前后加十个左右的氨基酸都不会影响其功能。即 XXXXXXXXXX “LBD”YYYYYYYYYY，其中X和Y为任意氨基酸残基。所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子中还可包括组氨酸标签序列；所述与层粘 连蛋白结合的神经生长因子自氨基末端至羧基末端依次包括所述组氨酸标签序列、所述 层粘连蛋白结合区和所述神经生长因子β亚基片段。所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子具体可为如下(a)或(b)或(C)的蛋白 质(a)由序列表中序列3自氨基末端第22至287位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将(a)或(b)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与神经损伤修复相关的由其衍生的蛋白质。为了使(a)或(b)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列 组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
权利要求
一种与层粘连蛋白结合的神经生长因子，它自氨基末端至羧基末端依次包括层粘连蛋白结合区和神经生长因子β亚基片段；所述层粘连蛋白结合区如序列表的序列1所示；所述神经生长因子β亚基片段为神经生长因子β亚基(GenBank Accession NumberAAA59931)自氨基末端第122 239位氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的神经生长因子，其特征在于所述层粘连蛋白结合的神经生长 因子中还包括组氨酸标签序列；所述层粘连蛋白结合的神经生长因子自氨基末端至羧基末 端依次包括组氨酸标签序列、层粘连蛋白结合区和神经生长因子β亚基片段。
3.如权利要求1或2所述的神经生长因子，其特征在于所述层粘连蛋白结合的神经 生长因子为如下(a)或(b)或(c)的蛋白质(a)由序列表中序列3自氨基末端第22至287位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将(a)或(b)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且与神经损伤修复相关的由其衍生的蛋白质。
4.权利要求1至3中任一所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子的编码基因。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述蛋白的编码基因为如下1)或2)或 3)或4)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列4自5'末端第64至861位核苷酸所示的DNA分子；2)其编码序列是序列表中序列4所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子。
6.含有权利要求4或5所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为将含有序 列表的序列4自5'末端第64至861位核苷酸的DNA片段导入pET28a得到的重组质粒。
8.权利要求1至3中任一所述与层粘连蛋白结合的神经生长因子、权利要求4或5中 任一所述与层粘连蛋白特异结合的神经生长因子的编码基因、权利要求6或7所述重组表 达载体中的任意一种在制备神经损伤修复药物中的应用。
9.一种神经损伤修复药物，它的活性成分为权利要求1至3中任一所述与层粘连蛋白 特异结合的神经生长因子、权利要求4或5中任一所述与层粘连蛋白特异结合的神经生长 因子的编码基因、权利要求6或7所述重组表达载体中的至少一种。
10.如权利要求9所述的药物，其特征在于所述神经损伤为周围神经损伤，具体为坐 骨神经损伤。
全文摘要
本发明公开了一种与层粘连蛋白结合的神经生长因子及其编码基因与应用。本发明提供的与层粘连蛋白结合的神经生长因子，它自氨基末端至羧基末端依次包括层粘连蛋白结合区和神经生长因子β亚基片段；所述层粘连蛋白结合区的GenBankAccession Number为NM205527；所述神经生长因子β亚基片段为神经生长因子β亚基(GenBank Accession NumberAAA59931)自氨基末端第122-239位氨基酸残基。本发明实现了在保持神经生长因子活性的同时，大大减少其用量，减少用量过大造成的风险，其方法可同时适用于所有促进神经损伤修复的因子以及富含层粘连蛋白的组织修复，具有重大意义。
文档编号A61P25/02GK101955543SQ20091008971
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者孙文杰, 戴建武, 肖志峰, 陈冰 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所