用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液及制备方法

专利名称：：用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液及制备方法。
背景技术：
：青光眼是世界上第二大致盲性疾病，可引起不可逆的视网膜神经节细胞(RetinalganglioncellsRGCs)凋亡和视神经萎縮，最终导致失明。视神经损伤也是临床常见的外伤类型和致盲原因，其它眼部多种疾病如视神经炎，缺血性视神经病变、视网膜血管阻塞、视网膜变性性疾病均可累及视神经导致视神经萎縮最终失明。目前青光眼的主要治疗手段是用药物或手术降低眼压；然而，即使去除高眼压等诱因，视网膜神经节细胞的丢失和视神经萎縮仍然继续，常规的降眼压治疗无法阻止或预防这种继发性的损害。研究发现，高眼压和视神经损伤后神经元缺乏轴突远端及神经元局部营养因子的支持导致视网膜神经节细胞的进行性丢失及其神经纤维的变性。大量的研究证实给予外源性的神经营养因子如脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)，胶质细胞源性神经营养因子(glialcelline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)可有效的促进损伤后视网膜节细胞的存活和轴突生长，但时间较短。通过眼内注射的方法易引起眼部感染，对青光眼及其它视网膜变性性疾病不是终生用药的途径。Bakalash(2003)应用感光细胞间维生素A类结合蛋白(interphotorec印torretinoid-bindingprotein,IRBP)对高眼压大鼠进行眼内接种后发现，视网膜神经节细胞的高眼压性损伤得到遏制。故Bakalash认为，对于神经变性损伤而言，损伤部位内源性抗原激活特异性T淋巴细胞介导的神经免疫保护是有效的治疗策略。研究发现，视网膜神经节细胞受损后存活或再生困难的一个主要原因是由于髓磷脂蛋白的存在，抑制因子Nogo是其中重要成员之一，Nogo在正常中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)、视神经及视网膜少量表达。中枢神经受损后Nogo因子释放增加、表达增强，不仅抑制神经纤维再生，而且可启动神经元凋亡过程，导致神经元死亡。Schwab等制备出Nogo的单克隆抗体IN-1，并进行大量在体试验，证实IN-1可促进脊髓和脑损伤后轴突长距离的再生长。Liebscher等切断2_6周龄大鼠皮质脊髓束后将IN_1单抗杂交瘤细胞移入脑内，在损伤处见到神经轴突明显的侧向发芽生长。Hauben等用髓磷脂抗原或被动转移髓磷脂活化T细胞均可减少外伤性脊髓和视神经损伤引起的神经退化，并提高功能恢复。众多研究表明，主动免疫或被动免疫阻遏Nogo或髓磷脂均能够促进CNS再生。视神经是CNS的一部分，相同的手段是否也能促进视神经损伤后的再生呢？Nogo有66个氨基酸残基在胞膜外形成拓扑结构，即Nogo66，是Nogo的活性区域，介导了Nogo的神经抑制活性。我们在前期利用基因重组技术原核表达和纯化了Nogo66蛋白，并制备成Nogo66福氏佐剂疫苗，接种于慢性高眼压大鼠四肢躯干皮下，可诱导大鼠机体产生特异性IgG抗体和T淋巴细胞增殖，并证实对慢性高眼压大鼠RGCs的数量和功能有一定保护作用。青光眼是一种需要终身治疗的疾病，而Nogo66蛋白疫苗通过传统途径接种后产生的免疫效应持续时间较短，需要不断加强免疫才能维持一定的抗体滴度和活化T细胞数量，患者必须经常到医院就诊接受皮下注射接种疫苗，对于行动不便或边远地区的患者，以及不太理解注射疫苗意义的患者，很难做到按时到医院就诊，难以维持有效的免疫效应，不能达到应有的治疗效果。另外，Nogo66是一个分子量为7.53461kD的小分子蛋白，小剂量皮下接种很难完全激活机体免疫系统，在眼球视网膜这样的免疫特赦器官获得较好的免疫效应。如果增加剂量，则有致实验性自身免疫性脑脊髓炎(e邓erimentalautoimmuneenc印halomyelitis，EAE)的风险。因此，通过眼局部结膜淋巴途径或角膜途径直接接种，可减少疫苗中蛋白的使用剂量，提高局部免疫能力，并且患者可以将疫苗拿回家，按照医嘱自行点眼接种，使用方便等优点。不仅可治疗青光眼，主动保护受损的RGCs，减少其凋亡，增加其数量，对青光眼的进一步发展也起到预防的作用。
发明内容本发明的目的是提供一种用于治疗和预防青光眼视网膜视神经损伤的疫苗滴眼液及制备方法，本发明所述疫苗滴眼液用于青光眼所致的视网膜神经节细胞凋亡或外伤引起的视神经损伤，能有效地提高视网膜视神经自身免疫保护能力改善受损神经元的微环境，促使神经元的修复与再生，使用安全，并且具有价格低廉，接种方便的优点。本发明的技术方案是用于青光眼的疫苗滴眼液，包括Nogo66蛋白和壳聚糖，其中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1:1，Nogo66蛋白的浓度为0.1-1.5mg/ml，壳聚糖的浓度为H5mg/ml。较好的技术方案是所述滴眼液中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1:1，Nogo66蛋白的浓度为1-1.5mg/ml，壳聚糖的浓度为10-15mg/ml。最好的技术方案是所述滴眼液中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1:1，Nogo66蛋白的浓度为lmg/ml，壳聚糖的浓度为10mg/ml。所述疫苗中壳聚糖包裹Nogo66蛋白。制备用于青光眼的疫苗滴眼液的方法，其特征在于有以下步骤1)取Nogo66蛋白溶液加入双蒸水配成0.1-1.5mg/mlNogo66蛋白；2)取壳聚糖，加入双蒸水，滴加醋酸，使其胶溶，配制l-15mg/ml壳聚糖溶液；3)步骤1)、2)所得溶液分别过滤3-5次，除菌；4)将步骤3)所得的两溶液等体积混合，充分搅匀；5)将步骤4)所得溶液中滴加1.0mol/L氢氧化钠，调整其ra值为6.0-8.0，即用于青光眼的疫苗滴眼液。步骤3)中所述的过滤，采用0.22iim无菌微孔滤器过滤。我们在前期实验中纯化表达了Nogo66蛋白，检验其N末端氨基酸序列证实为目的蛋白，并检测了蛋白浓度、纯度，均达到了制备疫苗的标准。并应用ProPredwebinterface程序，ProPredMHCClass-IIBindingP印tidePredictionServer抗原表位分析软件进行Nogo-66抗原表位分析，证明Nogo-66有明确的T淋巴细胞抗原表位，能够被抗原提呈细胞识别，引起Nogo-66抗原特异性T淋巴细胞活化。证明了重组Nogo-66蛋白具有免疫原性，能够提高中枢神经系统和视网膜T淋巴细胞介导的免疫保护反应，达到对受损的RGC或神经元的保护作用。在此基础上，我们制备了Nogo66蛋白-壳聚糖疫苗滴眼液(Nogo66-CS疫苗滴眼液)并考察其ra值、渗透压等一般性质，在确定其符合眼用制剂药物的标准后，于正常实验动物进行了眼剌激性试验和毒性试验，证明其安全性。给予实验动物Nogo66-CS疫苗滴眼液试验性点眼，发现其可激活实验动物粘膜免疫系统和视网膜小胶质细胞活化；并行Nogo66-CS疫苗滴眼液体外剌激培养小胶质细胞，发现亦可使其活化，证实Nogo66-CS疫苗滴眼液具有免疫原性。在慢性高眼压模型大鼠及视神经钳夹伤模型大鼠点用Nogo66-CS疫苗滴眼液后，血清及泪液中可检测出特异性IgG抗体，视网膜表达大量神经营养因子GDNF、BDNF和神经再生标志蛋白GAP-43，视网膜RGCs数量较未点用疫苗的模型对照组有所增加，证实Nogo66-CS疫苗滴眼液可促使神经元的修复与再生，并有效的改善受损神经元的微环境，在治疗高眼压或视神经损伤的同时，对继发性神经损伤起到了预防的作用。眼结膜血管分布密集，血液供应非常丰富，存在浅层和深层两个网状淋巴系统，在眼睑结膜皱褶中，存在大量免疫细胞、免疫分子，弥散在粘膜上皮内或粘膜下固有层，即淋巴组织。Nogo66-CS疫苗滴眼液通过点眼途径接种能够产生免疫效应，对受损的神经细胞具有保护作用，其原因如下1、Nogo66-CS疫苗滴眼液接种大鼠结膜后可剌激产生免疫反应。接种方法于0、21、35天各接种1次，每次1滴(0.05ml)。发现大鼠结膜有淋巴细胞浸润，泪液中产生了抗原特异性IgG抗体，表明疫苗激活了结膜淋巴系统，产生了结膜相关的免疫反应；视网膜小胶质细胞CDllb和MHC-II表达，表明疫苗在佐剂壳聚糖的辅助下可能穿透角膜到达眼内，被视网膜小胶质细胞识别，使小胶质细胞活化并行使抗原递呈细胞的功能，产生了视网膜相关的免疫反应；视网膜未见iN0S、TNF-a表达。证明无小胶质细胞激活的副反应。另外血液中产生低度的抗原特异性IgG抗体，表明疫苗亦可一定程度激活全身免疫系统但反应轻微，可避免全身免疫的并发症；血液中产生了抗原特异性IgG抗体，表明疫苗亦可一定程度激活全身免疫系统。这种接种方法的优点通过点眼接种，简单便捷；接种间隔时间2-3周，频率低；每次1滴，给药量少；可主要通过结膜淋巴细胞和视网膜小胶质细胞两个途径激活大鼠机体免疫系统，产生免疫效应。2、Nogo66-CS疫苗滴眼液对青光眼和视神经损伤有神经保护作用。慢性高眼压模型是我们前期为研究青光眼而制备的大鼠模型，经检验制备方法简单有效，可很好的模拟青光眼疾病过程和视神经损伤特点。在慢性高眼压大鼠和视神经钳夹伤大鼠接种疫苗后，发现视网膜RGCs数量均增多，说明疫苗可延长青光眼和视神经外伤时受损神经元的存活；视网膜有GAP43大量表达，GAP43即生长相关蛋白_43，是细胞再生的标志性蛋白，其大量表达，表明接种疫苗后视网膜RGCs再生活跃。Nogo66-CS疫苗滴眼液不仅可增加受损神经元的存活，还可促进神经元的再生，有明确的神经保护作用。成熟个体神经元已丧失了有丝分裂的能力，一旦死亡则不可再生，所以RGCs存活数量的提高意义重大，它可以大大增加轴突的数量，轴突数量的增加使得轴浆运输的能力增强，从而縮短轴突再生时间，并使更多的神经纤维修复，最大限度地恢复视功3、Nogo66-CS疫苗滴眼液可增加视网膜神经营养因子表达。慢性高眼压大鼠和视神经钳夹伤大鼠接种疫苗后视网膜大量表达脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)禾口胶质细胞源性神经营养因子(glialcelline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)，二者是神经营养因子(腦rotrophicfactors，NTF)的重要成员。神经营养因子是指机体产生的能够促进神经细胞存活、生长、分化的一类蛋白质因子。具有支持运动神经元存活，阻止成年神经元损伤后神经元的死亡、减少神经变性，促进感觉和运动神经元轴突生长、调节突触可塑性、促进再生等多种功能。但BDNF，GDNF等神经生长因子均为蛋白质，在正常情况下不能通过血脑屏障及脊髓屏障，限制了其在临床的实际应用。有很多研究通过移植可分泌神经营养因子的成纤维细胞、腺病毒转染神经营养因子RNA后移植入脑内或直接颅内注射神经营养因子的方法增加CNS受损部位神经营养因子，来促进受损神经元再生，结果证实外源性BDNF、GDNF等神经营养因子的确可以促进神经元存活、再生和功能恢复，然而这些方法均很复杂，且需要多次治疗，距临床使用有一定距离。利用Nogo66疫苗滴眼液，简单有效的间接诱导增加内源性神经营养因子分泌，很好的克服了血视网膜屏障的阻碍。本疫苗接种后可增加视网膜CD3阳性细胞，CD3是T细胞的标志物，表明视网膜有T细胞浸润。视网膜存在血视网膜屏障，一般情况下血液中的大分子物质无法穿过，而活化的T细胞可以进入视网膜。活化的T细胞可分泌多种神经营养因子。活化的小胶质细胞亦可分泌多种神经营养因子，我们的实验证实Nogo66-CS疫苗滴眼液可激活大鼠视网膜小胶质细胞。因此，Nogo66-CS疫苗滴眼液促使活化的T细胞浸润视网膜和视网膜小胶质细胞活化，二者分泌了多种神经营养因子，对视网膜受损的神经元起到了保护作用。通过追加点眼即可加强免疫保护作用，维持T细胞和小胶质细胞的活化，不断维持视网膜神经营养因子的表达，促进神经元再生和视功能恢复。视神经损伤后在受损部位有少量的内源性T细胞聚集，这种自身免疫性T细胞可拯救濒危神经元，减轻损伤引起的继发性损害；移植髓磷脂反应性T细胞可减轻视神经继发性退行性变，提高视神经节细胞的存活率和视神经的传导程度。在中枢神经系统受损部位聚集的自身反应性T细胞，可能通过诱导受损神经元处于静止状态来发挥神经保护作用，这种静止状态的诱导，减少了能量和葡萄糖的需求，可以增加神经元存活。采用Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后浸入视网膜的活性T细胞，其本身可能对视网膜受损的神经元起到了保护作用。4、Nogc)66-CS疫苗滴眼液安全无剌激。通过眼剌激性实验证实了高频率(1次/10minX6次+l次/周X8次)点眼接种后，Nogo66-CS疫苗滴眼液对大鼠眼部无剌激，不会导致眼部不适和损害，不会使眼分泌物增加；对大鼠视网膜和各主要器官无病理损害。本发明所述疫苗滴眼液，有如下优点1.疫苗抗原成分是机体自身髓磷脂蛋白Nogo的66个氨基酸成份，Nogo66-CS疫苗滴眼液能够直接剌激眼结膜相关的淋巴细胞对其识别、呈递，并产生免疫效应；2.所述疫苗滴眼液可剌激视网膜小胶质细胞等抗原递呈细胞，产生自身保护性免疫效应；对高眼压和视神经钳夹伤所致的视网膜神经节细胞有促进存活和再生的效果。3.通过点眼途径接种，无痛、无创、便利，易于被患者接受；无全身和眼局部的副作用。64.所述疫苗滴眼液成本较低，易于推广。综上，本发明所述疫苗滴眼液，通过眼局部结膜淋巴途径或角膜途径直接接种，可减少疫苗中蛋白的使用剂量，提高局部免疫能力，并且患者可以按照医嘱自行点眼接种，使用方便的优点。不仅可治疗青光眼，主动保护受损的RGCs，减少其凋亡，增加其数量，对青光眼的进一步发展也起到预防的作用。图1为Nogo66-CS剌激体外培养小胶质细胞CDllb表达；图2为Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后大鼠结膜抗原特异性IgG型浆细胞增殖(A、B、C、D分别表示不同浓度组)；图3为Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后大鼠结膜淋巴细胞浸润(A、B、C、D分别表示不同浓度组)；图4为Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后视网膜小胶质细胞CDllb表达；图5为Nogo66-CS疫苗滴眼液接种模型大鼠后RGCs逆行染色；图6为Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后慢性高眼压和视神经钳夹伤模型大鼠视网膜GAP-43表达；图7为Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后慢性高眼压和视神经钳夹伤模型大鼠视网膜GDNF、BDNF表达；图8为Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后视网膜病理切片图9为Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后各主要器官病理切片(A肺、B肝、C睾丸、D肾、E脑、F心)图10为Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后视网膜小胶质细胞TNF-a、iN0S表达。具体实施例方式主要仪器设备及试剂1.Zeiss光学手术显微镜Zeiss，德国2.532-二极管激光Alcon公司，美国3.光学生物显微镜0L预PUSCH20，日本4.电子微量天平DT100常熟市衡器厂，中国5.恒温水浴箱北京长凤仪器仪表公司，中国6.超净工作台SPEG，杭州，中国7.磁力搅拌器79-1型，江苏江阴科研器械厂，中国8.721型分光光度计上海光学仪器厂，中国9.标准型pH测试笔pHScanlTPI，美国10.冷藏、冷冻两用冰箱Haier，中国11.微量移液器Beckman，美国12.ND-1型勃氏粘度测试仪天津市国铭医药设备有限公司，中国13.FM-8P-FM-8P冰点渗透压仪上海隆拓仪器设备有限公司，中国14.DU-640分光光度计美国贝克曼库尔特有限公司15.0.22iim无菌微孔滤器16.Tono-PenXL眼压计17.倒置荧光显微镜18.电子微量天平19.恒温水浴箱20.全光谱激光共聚焦显微镜21.台式水平离心机22.低温高速离心机23.恒冷冰冻切片机24.眼科显微手术器械25.电泳仪26.凝胶成像系统27.水平脱色摇床(py-120)28.超声仪29.转膜槽30.PVDF膜31.电转仪32.洁瑞无菌注射器(带针)33.晶牌载玻片34.0.4%倍诺喜眼液35.微量移液器36.壳聚糖粉剂37.Nogo66蛋白38.氢氧化钠39.醋酸40.双蒸水41.牛血清白蛋白42.二喹啉甲酸43.0.Olmol/LPBS44.戊巴比妥钠45.0.OIM枸橼酸盐PH6.046.Rabbitanti-ratGAP4347.Rabbitanti-ratCD348.Sheepanti_ratBDNF49.Rabbitanti-ratGDNF50.FITCGoatAntiRabbitIgG51.FITCRabbitAntiGoatIgG52.CY3GoatAntiRabbitIgG美国密理博MILLIP0RE公司MedtronicSALON公司，美国ECLIPSETE2000-U型，日本DT100常熟市衡器厂，中国北京长凤仪器仪表公司，中国Nikon，日本BECKMANCS-15R，美国J2-21M，美国LeicaCM1900，德国苏州医疗设备仪器厂，中国天能公司，中国Bio-Rad鼎国科研器械公司，中国基因公司Bio-RadMILLIPORE天能公司，中国山东威高医用高分子制品股份有限公司江苏世泰实验器材有限公司，中国日本参天株氏会社，日本Beckman，美国浙江金壳生物化学有限公司，中国(生产批号YK090408113)本实验室表达纯化重庆北碚化学试剂有限公司，中国重庆北碚化学试剂有限公司，中国本实验室制备上海伯奥生物科技有限公司，中国上海伯奥生物科技有限公司，中国北京中杉生物技术有限公司，中国SIGMA，美国北京中杉生物技术有限公司ABCAM，美国ABCAM，美国ABCAM，美国SANTACRUZBiotechnology,美国SANTACRUZBiotechnology,美国SANTACRUZBiotechnology,美国SANTACRUZBiotechnology,美国0101]53.DAPI(C-1005)上海碧云天生物技术有限公司，中国0102]54.抗荧光淬灭封片剂上海碧云天生物技术有限公司，中国0103]55.甘油乙烯醇水溶性封片剂北京中杉生物技术有限公司，中国0104]56.考马斯亮蓝北京天根公司，中国0105]57.荧光金(FG)SIGMA，美国0106]58.4%多聚甲醛(PFA)天津大茂化学试剂有限公司，中国0107]59.1%多聚赖氨酸武汉博士德生物工程有限公司，中国0108]60.0.01mol/LPBS北京中杉生物技术有限公司，中国0109]61.RPMI1640培养基上海生物工程有限公司，中国0110]62.胎牛血清上海生物工程有限公司，中国0111]63.0.25%胰酶溶液上海生物工程有限公司，中国0112]64.山羊抗大鼠CDllb抗体SANTACRUZBiotechnology,美国0113]65.苏木精重庆北碚化学试剂有限公司，中国0114]66.二甲苯重庆北碚化学试剂有限公司，中国0115]67.钾明砜重庆北碚化学试剂有限公司，中国0116]68.95%、100%乙醇重庆北碚化学试剂有限公司，中国0117]69.30%(V/V)过氧化氢重庆北碚化学试剂有限公司，中国0118]70.30%HCL重庆北碚化学试剂有限公司，中国0119]实施例1Nogo66-CS疫苗滴眼液的制备0120]无菌条件下，取1.5mg/mlNogo66蛋白溶液(谢琳，贺翔鸽，苏踊跃等，"Nogo-合蛋白的原核表达及鉴定"《免疫学杂志》，2005，21(3):251)0.lml、0.5ml、1.Oml、1.5ml，分另U力B入双蒸水1.4ml、lml、0.5ml、0ml，配成0.lmg/m1、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/mlNogo66蛋白溶液。另取壳聚糖10mg、50mg、100mg、150mg，分别加入10ml双蒸水，滴加适量醋酸，使其完全溶解，配制lmg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml壳聚糖溶液。将上述Nogo66蛋白溶液和壳聚糖溶液分别用0.22iim无菌微孔滤器过滤3-5次，除菌。将除菌后的上述O.lmg/mlNogo66蛋白溶液和lmg/ml壳聚糖溶液等体积混合，充分搅匀，用1.0mol/L氢氧化钠液调节ra值至6.0-8.0，即得本发明所述浓度为lmg/ml的用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，命名为Nogo66-CS疫苗滴眼液，表示为A。将除菌后的上述O.5mg/mlNogo66蛋白溶液和5mg/ml壳聚糖溶液等体积混合，充分搅匀，用1.0mol/L氢氧化钠液调节ra值至6.0-8.0，即得本发明所述浓度为5mg/ml的用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，命名为Nogo66-CS疫苗滴眼液，表示为B。将除菌后的上述lmg/mlNogo66蛋白溶液和10mg/ml壳聚糖溶液等体积混合，充分搅匀，用1.0mol/L氢氧化钠液调节ra值至6.0-8.0，即得本发明所述浓度为10mg/ml的用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，命名为Nogo66-CS疫苗滴眼液，表示为C。将除菌后的上述1.5mg/mlNogo66蛋白溶液和15mg/ml壳聚糖溶液等体积混合，充分搅匀，用1.0mol/L氢氧化钠液调节ra值至6.0-8.0，即得本发明所述浓度为15mg/ml的用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，命名为Nogo66-CS疫苗滴眼液，表示为D。分装后密封，4t:保存。壳聚糖具有良好的生物相容性和亲水性，可包裹Nogo66蛋白。实施例2—般检验1、性状为微黄色微粘澄明液体2、ra值用ra值检测仪测得A、B、C、DNogo66-CS疫苗滴眼液样品ffl值分别为7.014、7.127、7.046、7.068。3、渗透压取4个浓度的Nogo66-CS疫苗滴眼液样品各3份和3份0.9%NaCl溶液样品，分别检测渗透压。结果A、B、C、DNogo66-CS疫苗滴眼液样品平均渗透压分别为285mosm/L、286mosm/L、291mosm/L、299mosm/L，0.9%NaCl溶液样品平均渗透压为301mosm/L。A、B、C、DNogo66-CS疫苗滴眼液渗透压相当于0.95-0.99倍0.9%NaCl溶液渗透压，符合滴眼液制剂的要求。4、含量测定精密配制浓度分别为0.25、0.5、1、2、3、4、5mg/ml的牛血清白蛋白溶液，加入1.0mL二喹啉甲酸工作液混匀，6(TC恒温水浴30min，冷却至室温后于紫外分光光度计562nm处测定吸光值，得回归方程为Y=0.00468X+0.0038，r=0.9996。样品含量测定精密移取A、B、C、DNogo66-CS溶液各5份，每份100iiL，加入二喹啉甲酸工作液1000iiL，充分混匀，37t:恒温水浴30分钟，冷却至室温，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(Pg)，除以样品稀释液总体积(100i!L)，即为样品实际浓度(单位Pg/yL)，根据吸光值计算Nogo66蛋白含量平均值为49.624yg/mL。计算精密度RSD=1.22%，回收率=99.25%。实施例3Nogo66-CS疫苗眼液急性眼睛剌激性、腐蚀性试验选择双眼肉眼检查及角膜荧光素检查正常的健康成年SD大鼠10只。3%戊巴比妥钠以1.3ml/kg行大鼠腹腔注射麻醉，待麻醉完全后将动物头左倾，右眼侧向斜上方，轻轻提起双睑，将A、B、C、DNogo66-CS滴于右眼角膜0.05ml，1次/10min，持续lh共6次；同时左眼以相同的策略点生理盐水，为对照眼。于点药当时和点药后lh、24h、48h、72h和第4天、第7天观察流泪及分泌物情况、结膜充血水肿、结膜滤泡乳头、角膜水肿混浊、角膜点状上皮损伤、虹膜损伤情况。并按照眼剌激反应评分标准给予计分。表l眼剌激反应评分标准眼刺激反应分值角膜浑浊0-4虹膜0陽2结膜0-3水肺0-4分泌物0-3积分16认为积分在0-3范围表示无剌激性，积分在4-8范围表示轻度剌激性，积分在9-12范围表示中度剌激性，积分在13-16范围表示重度剌激性。Nogo66-CS疫苗滴眼液和生理盐水的眼剌激试验评分如下表表2Nogo66-CS疫苗滴眼液眼剌激性试验评分10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>T检验表明5组眼刺激性反应评分无显著差异(P〉0.05)，按照眼剌激性反应评分标准，可认为Nogo66-CS疫苗滴眼液和生理盐水对眼均无刺激性。整个试验观察期间各实验大鼠对两组实验药物适应性好，未见流泪、畏光等眼部刺激症状，未见角膜荧光素染色阳性，无中毒症状，无死亡发生。实验表明Nogo66-CS疫苗滴眼液是一种安全无刺激性的眼用制剂。实施例4Nogo66-CS疫苗眼液免疫原性研究—、Nogo66-CS对体外小胶质细胞的免疫原性研究1、复苏小胶质细胞株-7(TC冰箱取出小胶质细胞株(第三军医大学第一附属医院病理科提供)，37t:水浴溶解完全，无菌下取出细胞，1000rpm离心5-10min弃上液，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，移入培养瓶，在37t:5%C02培养箱孵育2-3天后，胰酶消化传代，待细胞生长稳定后，以105的密度接种于24孔培养板，37t:5%C02培养箱继续孵育。2、爬片细胞贴壁后，将预先消毒好的小玻片放入培养孔，改用不含胎牛血清的高糖DMEM培养基继续培养12h。3、Nogo66-CS处理小胶质细胞将小胶质细胞接种在玻片上，24孔培养板分成6组，分别加入1.Omg/mlNogo66蛋白，A、B、C、DNogo66-CS或lmg/mlCS各0.5ul，一式4孔，生长24h。4、细胞免疫化学法检测CDllb表达将6孔板从培养箱中取出，倒掉培养液。每孔加室温lXPBS液2-3ml，轻轻晃动培养板以清洗孔壁，倒掉。反复3次。吸水纸吸掉孔内多余液体。每孔加入2ml4%多聚甲醛固定2处。加入3XH202作用30min，0.3XTriton-100破膜处理30min，PBS洗板3次，每次5min;加入1:100被稀释的CDllb单克隆抗体，4t:湿盒过夜，PBS漂洗3次后加辣根过氧化物酶(HR)-链霉亲和素，室温孵育1小时，PBS漂洗3次，加入DAB显色剂，室温作用2-3min，倒置显微镜下观察，待细胞着色后PBS冲洗直至显色；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。激光共聚焦显微镜下观察结果如图l所示。图1中显示C、DNogo66-CS组小胶质细胞呈现很强的绿色荧光，表明才、C、D浓度的Nogo66-CS剌激后小胶质细胞大量表达CDllb;A、BNogo66-CS组、Nogo66组小胶质细胞呈现较弱的绿色荧光，表明A、B浓度的Nogo66-CS和Nogo66可剌激小胶质细胞表达一定量的CDllb;CS组呈现积弱的绿色荧光，表明CS可剌激小胶质细胞表达极少量的CDllb。结果表明Nogo66-CS可明显剌激小胶质细胞活化，具有被小胶质细胞识别的特性，即存在免疫原性，其中C、D浓度的Nogo66-CS可最佳程度的活化小胶质细胞。Nogo66和CS亦可一定程度的剌激小胶质细胞活化。二、Nogo66-CS疫苗滴眼液接种SD大鼠的免疫原性研究1、选择健康成年SD大鼠，随机分为实验组和对照组。实验组大鼠分别给予A、B、C、DNogo66-CS疫苗滴眼液眼液点眼。点眼策略右眼侧向斜上方，轻轻提起双睑，将Nogo66-CS疫苗滴眼液滴于右眼结膜囊，第21天和第35天各加强点眼1次，共3次。对照组大鼠给予lmg/ml壳聚糖溶液点右眼，点眼策略同实验组。2、第0、20、34、49天分别采尾静脉血，收集泪液。静脉血置5000rpm离心5min，分离收集血清。_201:保存。3、ELISA法检测血清及泪液中抗Nogo66特异性IgG抗体滴度以包被稀释液稀释Nogo66蛋白浓度为5ii1/ml，在96孔板中每孔加入100y1以包被酶联板，保鲜膜包裹后放入37t:孵箱2h。弃抗原，以洗涤液冲洗3-5遍，弃液，厚叠吸水纸吸干。加入封闭液50ii1/孔，37t:孵箱孵育l-2h。弃封闭液，以洗涤液冲洗3-5遍。取室温溶解的血清标本或泪液标本于抗体稀释液中稀释为i:500，并依次进行5倍比稀释，设立空白对照，iooia/孔，37t:孵育ih。弃标本液，洗涤后每孔各加入用抗体稀释液i:5000稀释酶标二抗(山羊抗大鼠IgG辣根过氧化物酶)100ii1，37。C孵育40min。洗涤，加入底物液100y1/L37。C避光显色10min，加入终止液50y1/孔。波长495nm处读取吸光度(0D)值。血清和泪液特异性IgG抗体滴度检测结果如下表12表3接种Nogo66-CS疫苗滴眼液后大鼠血清及泪液特异性IgG抗体滴度(0D值)时间(天)0203449A组血清0.5090.5930.6710.885泪液0.5250.7570.9461.573B组血清0.5220.6120.7030.947泪液0.5280.8641.3361,638C组血清0.5360.6510.8181.462泪液0.513l掘2.5473.093D组血清0.5150.6430.7761.034对照组泪液血清0.5100.5320.9850.5151.6480.5302.3600.556泪液0.5070.5460.6120.572结果显示A、B、C、D组血清IgG抗体滴度在第34天以前未见明显增高；第49天时血清IgG抗体滴度显著增高，均高于O天时，其中C组增高幅度最大，与其他各组比较有显著差异(P<0.05)。A、B、C、D组泪液IgG抗体均从第20天开始增高，第34天显著增高，均高于0天时(P<0.05)，第49天时达最高值，其中C组增高幅度最大，与其他各组比较有显著差异(P<0.05)。对照组血清和泪液中的IgG抗体滴度随接种时间的增加未见明显变化(P>0.05)。结果表明，不同浓度Nogo66-CS疫苗滴眼液均可诱导机体的粘膜免疫反应和体液免疫反应，其中C浓度组能够最佳程度的诱导免疫效应，D浓度组能够较好的诱导免疫效应。4、免疫组化法检测结膜淋巴细胞浸润及Nogo66特异性浆细胞增生于第49天结膜囊中滴加肾上腺素或去甲肾上腺素，取眼结膜组织，立即浸入10%中型缓冲福尔马林固定48h，石蜡包埋切片，行HE染色，和Nogo66特异性IgG型浆细胞染色，观察结膜淋巴细胞浸润、IgG型浆细胞增殖，参见图2、图3。图2显示经过Nogo66-CS疫苗滴眼液点眼接种后，大鼠结膜产生抗原特异性IgG型浆细胞，其中C、D浓度组IgG型阳性细胞较多。图3显示结膜组织有淋巴细胞浸润，其中C浓度组大量淋巴细胞浸润。表明Nogo66-CS疫苗滴眼液可被结膜相关淋巴组织识别，激活局部的眼结膜免疫组织，产生粘膜免疫反应，其中C、D浓度，尤其是C浓度能诱导更多淋巴细胞活化。5、免疫组化法检测视网膜小胶质细胞CDllb表达3%戊巴比妥钠以1.3ml/kg行大鼠腹腔麻醉。左心室-主动脉插管，结扎固定导管，剪开右心耳。将生理盐水从导管处注入，使血液从右心排出，直至排除透明的生理盐水为止。换4X多聚甲醛250ml灌注，致SD13大鼠肢体伸直僵硬。取左右眼球，浸入4%多聚甲醛固定48小时。将固定好的标本蒸馏水稍洗，修成大约2cmX2cmX0.2cm的组织块，脱水透明包埋70%乙醇4小时一80%乙醇4小时一95%乙醇2小时一95%乙醇2小时一无水乙醇1小时20分钟一无水乙醇2小时20分钟一二甲苯l:1无水乙醇10分钟一二甲苯30分钟一二甲苯30分钟一60度熔点石蜡10分钟一62度熔点石蜡15分钟一62度熔点石蜡1小时一包埋，蜡块自然冷却后，修掉标本周围多余的蜡，贴上标本对应的标签于蜡块正上方。蜡块稍冻，3-5微米切片，62度烤箱烘烤1小时。脱蜡至水；二甲苯IO分钟，二甲苯10分钟，100%乙醇2分钟，95%乙醇2分钟，80%乙醇2分钟，自来水洗1分钟，蒸馏水洗1分钟。将盛有0.OlM(p朋.0)柠檬盐溶液加热至沸腾(9810(TC)，切片放入进行抗原修复，其中继续加热10min。置室温下自然冷却20min。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl过氧化酶阻断剂，以阻断内源性过氧化物酶活性，室温孵育10min。5XBSA封闭15分钟，倾掉。滴加50ylCDllb第一抗体，4t:冰箱过夜。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl生物素标记的二抗，37。C温箱孵育10min。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，37。C温箱孵育10min。PBS洗5minX3次；每片滴加100y1新鲜配制的DAB+H202溶液，显色5min;流水冲洗，苏木素复染3分钟，自来水洗，O.6%盐酸酒精分化15秒，自来水冲洗15分钟。梯度酒精干燥脱水80%乙醇2分钟，95%乙醇2分钟，100%乙醇2分钟，100%乙醇2分钟。透明二甲苯10分钟，二甲苯10分钟。中性树胶封片。显微镜下观察实验结果。见图4。图4结果显示Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后，视网膜呈现棕色的CDllb阳性细胞，表明Nogo66-CS可剌激大鼠视网膜表达CDllb，其中C浓度组CDllb阳性细胞较其他浓度组密度高。结果表明Nogo66-CS疫苗滴眼液可剌激视网膜小胶质细胞活化，其中C浓度可最明显剌激视网膜小胶质细胞活化。表明Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后可被视网膜小胶质细胞识别，存在免疫原性，C浓度能最佳程度被小胶质细胞识别递呈。实施例5Nogo66-CS疫苗滴眼液的视神经损伤保护效应分别采用SD大鼠慢性高眼压模型和视神经钳夹伤模型检测Nogo66-CS疫苗滴眼液的视神经损伤免疫保护效应。—、慢性高眼压模型大鼠和视神经钳夹伤大鼠模型制备1、建立慢性高眼压大鼠模型532-二极管激光光凝SD大鼠小梁网及颞上、颞下巩膜浅层静脉血管，T0N0-PenXL眼压计检测试验动物眼压。2、建立视神经钳夹伤大鼠模型剪开右眼上眼睑及上方结膜、眼外肌，暴露视神经，在球后2mm处用动脉夹夹持视神经40秒，缝合伤口，结膜囊涂金霉素眼膏，肌注青霉素5万单位。二、Nogo66-CS疫苗滴眼液接种模型给予模型大鼠C浓度和D浓度Nogo66-CS疫苗滴眼液点眼接种右眼侧向斜上方，轻轻提起双睑，将Nogo66-CS疫苗滴眼液滴于右眼结膜囊，第21天和第35天各加强点眼1次，共3次。三、Nogo66-CS疫苗滴眼液对慢性高眼压模型大鼠和视神经钳夹伤模型大鼠的视神经损伤免疫保护效应1、荧光金逆行标记视网膜神经节细胞利用立体定位仪确定上丘及外侧膝状体的位置。在相对应位置，用牙科钻钻开颅骨，通过微量进样器向双侧上丘及外侧膝状体分别缓慢注入2XFGliU，2min内注射完。人工骨粉封闭骨孔，缝合皮肤。肌注青霉素10万单位。7天后左心室-主动脉插管，结扎固定导管，剪开右心耳。将生理盐水从导管处注入，使血液从右心排出，直至排除透明的生理盐水为止。换4X多聚甲醛250ml灌注，致SD大鼠肢体伸直僵硬。分别取出左右眼球。沿角巩膜缘剪去角膜，去除晶状体、玻璃体，再置于4%多聚甲醛液中固定过夜，仔细剥离视网膜，以玻璃体面朝上，将其平铺于多聚赖氨酸处理的载玻片上。75%甘油封片。在荧光显微镜下(激发波长323nm)观察视网膜神经节细胞并计数，参见图5。表4Nogo66-CS疫苗滴眼液接种慢性高眼压大鼠和视神经钳夹伤大鼠后RGCs计数(个/X400)(士SD，n=6)正常Nogo66-CS(C)Nogo66-CS(D)CS未接种憎j生高眼压视神经钳夹伤2248.10±36.422176.24±64.551930.00±61.631720.00±57.401875.42±73.451663.00±66.391841.50±65,261606.83±84.721741.50±49.251656.67±67.85结果显示慢性高眼压模型大鼠和视神经钳夹伤模型大鼠接种C、D两个浓度的Nogo66-CS疫苗滴眼液后RGCs较接种CS均有所增加，C组RGCs显著多于CS组和未接种组，表明C浓度Nogo66-CS疫苗滴眼液可更好的增加视网膜视神经损伤后RGCs的存活率，对视网膜视神经具有更佳的保护作用。2、免疫组化法检测视网膜GAP43表达3%戊巴比妥钠以1.3ml/kg行大鼠腹腔麻醉。左心室-主动脉插管，结扎固定导管，剪开右心耳。将生理盐水从导管处注入，使血液从右心排出，直至排除透明的生理盐水为止。换4X多聚甲醛250ml灌注，致SD大鼠肢体伸直僵硬。取左右眼球，浸入4%多聚甲醛固定48小时。将固定好的标本蒸馏水稍洗，修成大约2cmX2cmX0.2cm的组织块，脱水透明包埋70%乙醇4小时一80%乙醇4小时—95%乙醇2小时一95%乙醇2小时一无水乙醇1小时20分钟一无水乙醇2小时20分钟一二甲苯l:l无水乙醇10分钟一二甲苯30分钟一二甲苯30分钟一60度熔点石蜡10分钟一62度熔点石蜡15分钟一62度熔点石蜡1小时一包埋，蜡块自然冷却后，修掉标本周围多余的蜡，贴上标本对应的标签于蜡块正上方。蜡块稍冻，3-5微米切片，62度烤箱烘烤1小时。脱蜡至水；二甲苯10分钟，二甲苯10分钟，100%乙醇2分钟，95%乙醇2分钟，80%乙醇2分钟，自来水洗1分钟，蒸馏水洗1分钟。将盛有0.OlM(p朋.0)柠檬盐溶液加热至沸腾(98IO(TC)，切片放入进行抗原修复，其中继续加热10min。置室温下自然冷却20min。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl过氧化酶阻断剂，以阻断内源性过氧化物酶活性，室温孵育10min。5%BSA封闭15分钟，倾掉。滴加50ylGAP43第一抗体，4。C冰箱过夜。PBS洗5minX3次，每片滴加50ii1生物素标记的二抗，37t:温箱孵育10min。PBS洗5minX3次，每片滴加50y1链霉菌抗生物素蛋白_过氧化物酶溶液，37。C温箱孵育10min。PBS洗5minX3次；每片滴加100y1新鲜配制的DAB+H202溶液，显色5min;流水冲洗，苏木素复染3分钟，自来水洗，O.6%盐酸酒精分化15秒，自来水冲洗15分钟。梯度酒精干燥脱水80%乙醇2分钟，95%乙醇2分钟，100%乙醇2分钟，100%乙醇2分钟。透明二甲苯10分钟，二甲苯10分钟。中性树胶封片。显微镜下观察实验结果。参见图6。图6结果显示慢性高眼压模型大鼠和视神经钳夹伤模型大鼠接种C浓度的Nogo66-CS疫苗滴眼液后视网膜GAP-43均有大量表达，D浓度组有少量表达，CS对照组未见表达。表明Nogo66-CS疫苗滴眼液可剌激视网膜视神经损伤后视网膜神经元细胞再生，C浓度的Nogo66-CS疫苗滴眼液诱导神经元再生更明显。3、免疫组化法检测视网膜BDNF、GDNF表达3%戊巴比妥钠以1.3ml/kg行大鼠腹腔麻醉。左心室-主动脉插管，结扎固定导管，剪开右心耳。将生理盐水从导管处注入，使血液从右心排出，直至排除透明的生理盐水为止。换4X多聚甲醛250ml灌注，致SD大鼠肢体伸直僵硬。取左右眼球，浸入4%多聚甲醛固定48小时。将固定好的标本蒸馏水稍洗，修成大约2cmX2cmX0.2cm的组织块，脱水透明包埋70%乙醇4小时一80%乙醇4小时一95%乙醇2小时一95%乙醇2小时一无水乙醇1小时20分钟一无水乙醇2小时20分钟一二甲苯l:1无水乙醇10分钟一二甲苯30分钟一二甲苯30分钟一60度熔点石蜡10分钟一62度熔点石蜡15分钟一62度熔点石蜡1小时一包埋，蜡块自然冷却后，修掉标本周围多余的蜡，贴上标本对应的标签于蜡块正上方。蜡块稍冻，3-5微米切片，62度烤箱烘烤1小时。脱蜡至水；二甲苯10分钟，二甲苯10分钟，100%乙醇2分钟，95%乙醇2分钟，80%乙醇2分钟，自来水洗1分钟，蒸馏水洗1分钟。将盛有0.OlM(p朋.0)柠檬盐溶液加热至沸腾(9810(TC)，切片放入进行抗原修复，其中继续加热10min。置室温下自然冷却20min。PBS洗5minX3次，每片滴加50y1过氧化酶阻断剂，以阻断内源性过氧化物酶活性，室温孵育10min。5%BSA封闭15分钟，倾掉。滴加50iUBDNF、GDNF第一抗体，4"冰箱过夜。PBS洗5minX3次，每片滴加50ii1生物素标记的二抗，37。C温箱孵育10min。PBS洗5minX3次，每片滴加50y1链霉菌抗生物素蛋白_过氧化物酶溶液，37。C温箱孵育10min。PBS洗5minX3次；每片滴加100y1新鲜配制的DAB+H202溶液，显色5min;流水冲洗，苏木素复染3分钟，自来水洗，O.6%盐酸酒精分化15秒，自来水冲洗15分钟。梯度酒精干燥脱水80%乙醇2分钟，95%乙醇2分钟，100%乙醇2分钟，100%乙醇2分钟。透明二甲苯10分钟，二甲苯10分钟。中性树胶封片。显微镜下观察实验结果。参见图7。图7结果显示慢性高眼压模型大鼠和视神经钳夹伤模型大鼠接种C浓度Nogo66-CS疫苗滴眼液后视网膜均大量表达GDNF、BDNF，D浓度Nogo66-CS疫苗滴眼液后视网膜均中等量表达GDNF、BDNF，CS对照组视网膜仅见少量GDNF、BDNF表达。表明Nogo66-CS疫苗滴眼液可促进视网膜视神经损伤后视网膜神经营养因子的表达，改善损伤后视网膜微环境，促进神经元再生，C浓度效果最佳。实施例6Nogo66-CS疫苗滴眼液的安全性实验1，主要脏器的病理组织学观察选择8-10周龄正常健康成年SD大鼠5只。以右眼为实验组，左眼为空白对照。3%戊巴比妥钠以1.3ml/kg行大鼠腹腔注射麻醉，待麻醉完全后将动物头左倾，右眼侧向斜上方，轻轻提起双睑，将Nogo66-CS滴于右眼角膜0.05ml，1次/10min，持续lh共6次；1次/天，持续7天，共7次；接下来每周行Nogo66-CS点眼一次，持续8周，共8次。于末次点药后第5周，3%戊巴比妥钠溶液(1.3ml/kg)SD大鼠腹腔注射麻醉。开胸行左心室插管，4X多聚甲醛固定液400ml灌注，摘除眼球，取心、肝、肾、肺、脑、睾丸，立即置于4X多聚甲醛/PBS溶液中浸泡24h。脱水透明包埋，蜡块自然冷却后，稍冻，4ym切片，62度烤箱烘烤l小时。裱于1%多聚赖氨酸预处理的载玻片上。二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，苏木素染色5min，自来水冲洗。盐酸乙醇分化30s(提插数下)。自来水浸泡15min或温水(约50°C)5min。置伊红液2min。常规脱水，透明，封片，中性树脂封固。倒置相差显微镜下观察结果，参见图8、图9.162，视网膜iN0S，TNFa免疫组化反应另取已脱蜡的眼球切片抗原修复，置室温下自然冷却20min。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl过氧化酶阻断剂，以阻断内源性过氧化物酶活性，室温孵育10min。5%BSA封闭15分钟，倾掉。分别滴加50yliNOS、TNF-a一抗，4t:冰箱过夜。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl生物素标记的二抗，37。C温箱孵育10min。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，37。C温箱孵育10min。PBS洗5minX3次；每片滴加100y1新鲜配制的DAB+H202溶液，显色5min;流水冲洗，苏木素复染3分钟，自来水洗，0.6%盐酸酒精分化15秒，自来水冲洗15分钟。梯度酒精干燥脱水80%乙醇2分钟，95%乙醇2分钟，100%乙醇2分钟，100%乙醇2分钟。透明二甲苯10分钟，二甲苯10分钟。中性树胶封片。显微镜下观察实验结果，参见图IO。图8结果显示眼球视网膜病理检查视网膜结构未见明显异常，表明Nogo66-CS疫苗滴眼液不会引起视网膜的病理损害，对视网膜是安全的。图9结果显示心、肝、肾、肺、脑、睾丸病理检查未见明显异常，表明Nogo66-CS疫苗滴眼液不会引起各主要器官的病理损害，对机体是安全的。图10结果显示Nogo66-CS疫苗滴眼液接种后未见大鼠视网膜小胶质细胞表达iN0S、TNF-a，表明Nogo66-CS疫苗滴眼液在不会诱导视网膜炎症细胞因子的分泌，不会引起视网膜病理性炎症反应。结论Nogo66-CS疫苗滴眼液用于青光眼或外伤引起的视神经损伤，可有效地改善受损神经元的微环境，并促使神经元的修复与再生，有使用安全，接种方便的优点。权利要求一种用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴眼液包括Nogo66蛋白和壳聚糖，其中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1∶1，Nogo66蛋白的浓度为0.1-1.5mg/ml，壳聚糖的浓度为1-15mg/ml。2.根据权利要求1所述的用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴眼液中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1:1，Nogo66蛋白的浓度为1-1.5mg/ml，壳聚糖的浓度为10-15mg/ml。3.根据权利要求1所述的用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴眼液中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1:1，Nogo66蛋白的浓度为lmg/ml，壳聚糖的浓度为10mg/ml。4.根据权利要求l-3任一所述的治疗和预防用于青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述疫苗中壳聚糖包裹Nogo66蛋白。5.制备权利要求1-4中任一所述的用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液的方法，其特征在于有以下步骤1)取Nogo66蛋白溶液加入双蒸水配成0.1-1.5mg/mlNogo66蛋白；2)取壳聚糖，加入双蒸水，滴加醋酸，使其胶溶，配制l-15mg/ml壳聚糖溶液；3)步骤1)、2)所得溶液分别过滤3-5次，除菌；4)将步骤3)所得的两溶液等体积混合，充分搅匀；5)将步骤4)所得溶液中滴加1.0mol/L氢氧化钠，调整其ra值为6.0_8.0，即得用于青光眼视网膜视神经损伤的疫苗滴眼液。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤3)所述的过滤，采用0.22iim无菌微孔滤器过滤。全文摘要本发明涉及一种用于治疗和预防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴眼液包括Nogo66蛋白和壳聚糖，其中Nogo66蛋白与壳聚糖的体积比为1∶1，Nogo66蛋白的浓度为0.1-1.5mg/ml，壳聚糖的浓度为1-15mg/ml。本发明所述疫苗滴眼液用于青光眼所致的视网膜神经节细胞凋亡或外伤引起的视神经损伤，能有效地改善受损神经元的微环境，促使神经元的修复与再生，使用安全，并且具有价格低廉，接种方便的优点。文档编号A61K47/36GK101711863SQ20091019153公开日2010年5月26日申请日期2009年11月20日优先权日2009年11月20日发明者岳红云,程茗,谢琳,贺翔鸽申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院