专利名称：：用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn及其提纯方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn及其提纯方法和用途。主要采用一种来源于舟山眼镜蛇(NajaatraCantor)毒的细胞毒素，适用于替代阿片类毒品戒毒特效药的制药新用途。属于生物制药
技术领域：
。
背景技术：
：目前，药物滥用(drug-abuse)是国内外突出的社会和医学问题。二十世纪九十年代以来，我国毒品问题日趋严重，毒品滥用者剧增。目前在我国滥用的主要毒品是鸦片、吗啡、海洛因、大麻、可卡因、安非他命等，还有一些人工合成的毒品，包括冰毒、摇头丸等。吸毒可严重摧残身心健康，一旦吸毒成瘾，会导致记忆力衰退、营养严重不足、抵抗力下降、多种疾病传播如艾滋病等。吸毒不仅给自身带来了极大的危害，而且还造成家破人亡，亲人为仇，乃至败坏社会风气，危害社会治安，弓I发刑事犯罪。目前我国用于戒毒的中草药复方制剂虽有多种，但在控制吸毒和复吸方面的实际效果并不理想。从河豚鱼中发现的剧毒物质TTX虽有一定的戒毒作用，但因产量低、价格昂贵，毒性大，难以规模化开发利用。还有些戒毒药物(如美沙酮)，虽然可以有效地控制戒断症状，但其自身属于麻醉品，有较强的成瘾性，因此，在应用方面受到严格限制。近年来，将蛇毒中的NT用于戒毒已取得了可喜的进展。蛇毒NT能明显改善海洛因成瘾和成瘾复吸大鼠脑神经元的病理损害。昆明动物研究所将含有蛇毒NT组分的制剂-复方克痛宁进行戒毒治疗，对海洛因依赖戒断症状的控制效果较好，与美沙酮的疗效相近，但无成瘾性、无呼吸抑制、不产生欣快效应及无便秘等副作用，是一个在脱毒治疗和康复方面具有较好应用前景的戒毒药物。毒蛇可以规模化养殖，质控标准容易控制，所生产的蛇毒原料可完全满足药品大规模生产之需要。因此，蛇毒研制的戒毒药价格较廉，易于被患者接受和推广。与NT相比，由于CTX的毒性更低、临床应用更安全，因此其潜在的戒毒药用开发价值更大。自1993年，HungChin-Chun首次(Hungetal，1993)从台湾台东地区产舟山眼镜蛇毒中分离出一种新的CTX，并命名为CTXn。该毒素是一种强碱性多肽(pI10.13)，相对分子质量为6699Da，有60个氨基酸残基。进一步研究发现台湾台西地区所产的舟山眼镜蛇毒中并不含此毒素(Chenetal，2005)。中国大陆其他地区的舟山眼镜蛇毒中是否有CTXn，以及其是否有戒毒的功能，至今未见相关报道。
发明内容本发明的第一个目的，是为了提供低毒性、用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn。本发明的第二个目的，是为了提供用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn的提纯方法。本发明的第三个目的，是为了提供用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn的用途。本发明的第一个目的可以通过采取如下技术措施达到用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn，其特征是1)所述CTXn的分子量为6697.429Da;2)所述CTXn的氨基酸序列如序列表SEQIDN2:1所述。本发明的第二个目的可以通过采取如下技术措施达到用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn的提纯方法，其特征在于包括如下步骤1)外采集舟山眼镜蛇毒样本；2)对前述舟山眼镜蛇毒样本进行CTXn的分离、纯化，(1)首先进行凝胶过滤采用S印hacrylS-100HR填料，将舟山眼镜蛇毒样本通过AKTAexplorer100快速纯化工艺开拓系统进行分子筛过滤，获得I、II及III个毒性组分，分别用G-50预装柱HiPr印26/10Desalting脱盐，冻干，备用；(2)通过初筛，选取组分III进行下一步"离子交换";(3)离子交换采用CMS印haroseFF填料，组分III通过AKTAexplorer100快速纯化工艺开拓系统进行离子交换，获得单一毒性多肽CTXn(图1)，分别用G-50预装柱脱盐，冻干，备用；3)测定CTXn的分子量及其氨基酸序列，测定CTXn的分子量为6697.429Da;测定CTXn的氨基酸序列如序列表SEQIDN2:1所述。本发明的第二个目的还可以通过采取如下技术措施达到实现本发明第二个目的的一种实施方案是第1)步采集舟山眼镜蛇毒样本来自中国大陆舟山眼镜蛇自然野生分布优势区域之一的江西宜春地区野外。实现本发明第二个目的的一种实施方案是凍2)步所用的AKTAe邓lorerIOO快速纯化工艺开拓系统为制备型高效液相色谱仪。实现本发明第二个目的的一种实施方案是第3)步采用质谱分析法(MALDI-TOF)测定CTXn的分子量；用埃德曼降解法Edmandegradation测定CTXn的氨基酸序列。用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn的用途，其特征在于1)筛选吗啡成瘾大鼠，取符合要求的大鼠，第一天确定伴药箱及非伴药侧箱后，随机分为吗啡组和生理盐水组，第二天至第九天隔板封闭黑白灰三箱的通，吗啡组大鼠用吗啡进行条件性训练，每天训练两次受试动物，注射吗啡10mg/kg和注射生理盐水的时间交替在上午8:00和下午16:00进行，每只大鼠注射吗啡后随即关入位置偏爱实验箱的白箱，注射生理盐水后关入另一侧，均历时50分钟，连续训练8天，生理盐水组上、下午同样时间皆注射生理盐水，处理方式同吗啡组；第十天拉开隔板，在不给任何药物的条件下，将各组大鼠分别放人箱中，让其自由跑动，启动计算机程序，记录15min内大鼠分别在黑、白两箱的停留时间，筛选出吗啡成瘾大鼠供进一步实验用；或者2)对吗啡成瘾大鼠给予CTXn的方法，将吗啡成瘾大鼠随机分为五组CTXn三个剂量组，即2.Omg/kg组、1.Omg/kg组和0.5m/kg组，连续8天上午8.00腹腔注射蛇毒，下午16.00腹腔注射0.9%NS，吗啡成瘾对照组在同时间皮下注射0.9%NS，训练程序及测试同条件位置偏爱模型的建立；每天记录大鼠的体重、测量CPP、观察其精神状态、活动情况并记录；第十八天腹腔注射纳洛酮5mg/kg观察戒断症状并评分；停药4天后的第二十二天测试；或者53)测试不同剂量CTXn对吗啡诱导的条件性位置偏爱的影响，各组大鼠给予吗啡前在白箱的逗留时间无明显差异，吗啡组与CTXn各剂量组在连续八天吗啡训练后大鼠在白箱停留的时间显著延长，与给药前相比有显著性差异，与0.9%NS组比较亦差异明显，大鼠在对吗啡产生稳定的CPP后，连续给予CTXn2mg/kg组、lmg/kg组、0.5mg/kg组剂量各八天，第十天CTXn2mg/kg和CTXnlmg/kg剂量组与吗啡对照组和给CTXn前比较有显著性差异；连续八天给予CTXn处理后，各CTXn剂量组大鼠对伴药箱偏爱的现象消失甚至产生厌恶，该结果表明蛇毒CTXn能抑制大鼠由吗啡诱导形成的CPP，抑制吗啡成瘾后动物的奖赏效应和渴药行为，有显著的戒毒功效；或者4)测试不同剂量CTXn对成瘾大鼠体重的影响，经连续八天吗啡条件位置偏爱训练后，大鼠体重较NS组有明显减轻；而大鼠成瘾后再连续给予CTXn八天0.5-2mg/kg，蛇毒组大鼠的体重增长都有不同程度的改善，其中CTXnlmg/kg、CTXn2mg/kg剂量组体重增长比CTXn0.5mg/kg显著，分别达到125.7±2.4%及130.5±1.6%，与吗啡组比较差异显著，该结果表明CTXn可促进吗啡依赖大鼠的体重恢复，且有一定的剂量效应关系。本发明具有如下突出的有益效果1、不同剂量CTXn对吗啡诱导的条件性位置偏爱(CPP)的影响大鼠在对吗啡产生稳定的CPP后，连续给予不同剂量CTXn(0.5mg/kg、lmg/kg、2mg/kg)各8天，各CTXn剂量组大鼠对伴药箱偏爱的现象均消失甚至产生厌恶。该结果表明蛇毒CTXn能抑制大鼠由吗啡诱导形成的CPP，抑制吗啡成瘾后动物的奖赏效应和渴药行为，有显著的戒毒功效。2、不同剂量CTXn对成瘾大鼠体重的影响经连续8天吗啡条件位置偏爱训练后，大鼠体重较NS组有明显减轻；而大鼠成瘾后再连续给予CTXn8天(0.5-2mg)，蛇毒组大鼠的体重增长都有不同程度的改善。该结果表明CTXn可促进吗啡依赖大鼠的体重恢复，且有一定的剂量效应关系。3、上述结果表明CTXn有良好的戒毒作用，能较好的消除成瘾大鼠对吗啡的渴药行为和戒断症状，可明显增加体重从而恢复正常生理获活动。CTXn氨基酸序列清楚，成分单一，药效显著，质量标准可控，毒、副作用小，利于大规模的生产，对于有效戒毒，防止毒品对社会个人的危害有极大的社会意义和经济价值。图1是CTXn在CMS印haroseFF离子交换色谱图上的洗脱部位示意图。图2是用质谱分析法(MALDI-TOF)测定CTXn的分子量为6697.429Da的示意图。具体实施例方式以下的实施例均以CTXn对吗啡成瘾大鼠的戒毒作用为例对本发明进行具体阐述，但是本发明的保护范围并不局限于此，本
技术领域：
的普通技术人员通过以上内容也能实现本发明的目的。具体实施例1:筛选吗啡成瘾鼠(吗啡诱导的条件性位置偏爱模型，CPP)1)外采集舟山眼镜蛇毒样本；2)对前述舟山眼镜蛇毒样本进行CTXn的分离、纯化，(1)首先进行凝胶过滤采用S印hacrylS-100HR填料，将舟山眼镜蛇毒样本通过AKTAe邓lorer100快速纯化工艺开拓系统进行分子筛过滤，获得I、II及III个毒性组分，分别用G-50预装柱HiPr印26/lODesalting脱盐，冻干，备用；(2)通过初筛，选取组分III进行下一步"离子交换"；(3)离子交换采用CMS印haroseFF填料，组分III通过AKTAexplorer100快速纯化工艺开拓系统进行离子交换，获得单一毒性多肽CTXn(图1)，分别用G-50预装柱脱盐，冻干，备用；3)测定CTXn的分子量及其氨基酸序列，测定CTXn的分子量为6697.429Da;测定CTXn的氨基酸序列为LKCNQLIPPFYKTCAAGKNLCYKMFMVAAPKVPVKRGCIDVCPKSSLLVKYVCCNTDRCN其中第1)步采集舟山眼镜蛇毒样本来自中国大陆舟山眼镜蛇自然野生分布优势区域之一的江西宜春地区野外。第2)步所用的AKTAe邓lorerIOO快速纯化工艺开拓系统为制备型高效液相色谱仪。第3)步采用质谱分析法(MALDI-TOF)测定CTXn的分子量；用埃德曼降解法Edmandegradation测定CTXn的氨基酸序列。取符合要求的大鼠，dl天确定伴药箱及非伴药侧箱后，随机分为吗啡组和生理盐水组，d2-d9天隔板封闭黑白灰三箱的通道。吗啡组大鼠用吗啡进行条件性训练，每天训练两次受试动物，注射吗啡(10mg/kg)和注射生理盐水的时间交替在上午8:00和下午16:00进行。每只大鼠注射吗啡后随即关入位置偏爱实验箱的白箱，注射生理盐水后关入另一侧，均历时50分钟。连续训练8天。生理盐水组上、下午同样时间皆注射生理盐水，处理方式同吗啡组。d10天拉开隔板，在不给任何药物的条件下，将各组大鼠分别放人箱中，让其自由跑动，启动计算机程序，记录15min内大鼠分别在黑、白两箱的停留时间，筛选出吗啡成瘾大鼠供进一步实验用。具体实施例2:吗啡成瘾大鼠给予CTXn的方法将吗啡成瘾大鼠随机分为5组CTXn3个剂量组(2.Omg/kg，1.Omg/kg，0.5m/kg)连续8天上午8.00腹腔注射蛇毒，下午16.00腹腔注射0.9%;NS、吗啡成瘾对照组在同时间皮下注射O.9%NS，训练程序及测试同条件位置偏爱模型的建立。每天记录大鼠的体重、测量CPP、观察其精神状态、活动情况并记录。d18天腹腔注射纳洛酮5mg/kg观察戒断症状并评分。停药4天，d22测试。具体实施例3:不同剂量CTXn对吗啡诱导的条件性位置偏爱(CPP)的影响各组大鼠给予吗啡前在白箱的逗留时间无明显差异(PX).05)，吗啡组与CTXn各剂量组在连续8天吗啡训练后大鼠在白箱停留的时间显著延长，与给药前相比有显著性差异(P<0.01)，与0.9%NS组比较亦差异明显(P<0.01)。大鼠在对吗啡产生稳定的CPP后，连续给予CTXn2mg/kg、lmg/kg、0.5mg/kg剂量各8天，dlO天CTXn2mg/kg禾PCTXnlmg/kg剂量组与吗啡对照组和给CTXn前比较有显著性差异(P<0.01);连续8天给予CTXn处理后，各CTXn剂量组大鼠对伴药箱偏爱的现象消失甚至产生厌恶。该结果表明蛇毒CTXn能抑制大鼠由吗啡诱导形成的CPP(表1)，抑制吗啡成瘾后动物的奖赏效应和渴药行为，有显著的戒毒功效。表1不同剂量CTXn对吗啡成瘾大鼠CPP的影响G±s，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>#p<0.05vsN.Sgroup※p<0.01p<0.001▲p<0.05vsM0Rg丽p具体实施例4:不同剂量CTXn对成瘾大鼠体重的影响经连续8天吗啡条件位置偏爱训练后，大鼠体重较NS组有明显减轻；而大鼠成瘾后再连续给予CTXn8天(0.5-2mg/kg)，蛇毒组大鼠的体重增长都有不同程度的改善，其中CTXnlmg/kg、CTXn2mg/kg剂量组体重增长比CTXn0.5mg/kg显著，分别达到125.7±2.4%及130.5±1.6%，与吗啡组比较差异显著(p<0.01)。该结果表明CTXn可促进吗啡依赖大鼠的体重恢复，且有一定的剂量效应关系(表2)。表2CTXn处理对成瘾大鼠体重的影响(x±s，n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>※p<0.01，#p<0.05vsM0RGroup蛇毒是一个巨大的生物资源宝库。自1968年英国科学家首先研制成功了治疗血管闭塞性疾病的蛇毒制剂-ARIN，投放市场后不久即获得了巨大的经济回报。近十年来，随着多达数十种蛇毒药品的面世，并且取得了不俗的临床疗效和销售业绩，从蛇毒中开发出价廉、物美的特效药正在成为各国生物学家、药学家及制药企业争相追逐的新热点。研究发现，舟山眼镜蛇(NajaatraCantor)，以颈部背面有白色眼镜架状斑纹为其最明显的特征，体长可达2米。主要分布于我国长江以南诸省及台湾等地。舟山眼镜蛇所分泌的蛇毒液中含有多种神经毒素(neurotoxin,NT)及细胞毒素(Cytotoxin，CTX)。由于CTX对多种组织细胞膜均有较强的生物活性，尤其对心肌细胞更为显著，故又称为膜毒素(Membranetoxin)或心脏毒素(cardiotoxin)。从中国大陆及中国台湾产舟山眼镜蛇毒中至少已分离出了57种不同的CTX，均由6063个氨基酸残基组成，相对分子质量为60007000Da。序列表〈110〉广州医学院〈120〉用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn及其提纯方法和用途〈160>1〈210>1〈211>720〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉用于替代阿片类毒品戒毒特效药的制药新用途〈400〉1LKCNQLIPPFYKTCAAGKNLCYKMFMVAAPKVPVKRGCIDVCPKSSLLVKYVCCNTDRCN权利要求用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn，其特征是1)所述CTXn的分子量为6697.429Da；2)所述CTXn的氨基酸序列如序列表SEQID№1所述。2.用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn的提纯方法，其特征在于包括如下步骤1)外采集舟山眼镜蛇毒样本；2)对前述舟山眼镜蛇毒样本进行CTXn的分离、纯化，(1)首先进行凝胶过滤采用S印hacrylS-100HR填料，将舟山眼镜蛇毒样本通过AKTAexplorer100快速纯化工艺开拓系统进行分子筛过滤，获得I、II及III个毒性组分，分别用G-50预装柱HiPr印26/10Desalting脱盐，冻干，备用；(2)通过初筛，选取组分III进行下一步"离子交换";(3)离子交换采用CMS印haroseFF填料，组分III通过AKTAexplorer100快速纯化工艺开拓系统进行离子交换，获得单一毒性多肽CTXn(图1)，分别用G-50预装柱脱盐，冻干，备用；3)测定CTXn的分子量及其氨基酸序列，测定CTXn的分子量为6697.429Da;测定CTXn的氨基酸序列如序列表SEQIDN2:1所述。3.如权利要求2所述的用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn的提纯方法，其特征在于第1)步采集舟山眼镜蛇毒样本来自中国大陆舟山眼镜蛇自然野生分布优势区域之一的江西宜春地区野外。4.如权利要求2所述的用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn的提纯方法，其特征在于第2)步所用的AKTAe邓lorer100快速纯化工艺开拓系统为制备型高效液相色谱仪。5.如权利要求2所述的用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn的提纯方法，其特征在于第3)步采用质谱分析法(MALDI-TOF)测定CTXn的分子量；用埃德曼降解法Edmandegradation测定CTXn的氨基酸序列。6.用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn的用途，其特征在于1)筛选吗啡成瘾大鼠，取符合要求的大鼠，第一天确定伴药箱及非伴药侧箱后，随机分为吗啡组和生理盐水组，第二天至第九天隔板封闭黑白灰三箱的通，吗啡组大鼠用吗啡进行条件性训练，每天训练两次受试动物，注射吗啡10mg/kg和注射生理盐水的时间交替在上午8:00和下午16:00进行，每只大鼠注射吗啡后随即关入位置偏爱实验箱的白箱，注射生理盐水后关入另一侧，均历时50分钟，连续训练8天，生理盐水组上、下午同样时间皆注射生理盐水，处理方式同吗啡组；第十天拉开隔板，在不给任何药物的条件下，将各组大鼠分别放人箱中，让其自由跑动，启动计算机程序，记录15min内大鼠分别在黑、白两箱的停留时间，筛选出吗啡成瘾大鼠供进一步实验用；或者2)对吗啡成瘾大鼠给予CTXn的方法，将吗啡成瘾大鼠随机分为五组CTXn三个剂量组，即2.0mg/kg组、1.0mg/kg组和0.5m/kg组，连续8天上午8.00腹腔注射蛇毒，下午16.00腹腔注射0.9%NS，吗啡成瘾对照组在同时间皮下注射0.9%NS，训练程序及测试同条件位置偏爱模型的建立；每天记录大鼠的体重、测量CPP、观察其精神状态、活动情况并记录；第十八天腹腔注射纳洛酮5mg/kg观察戒断症状并评分；停药4天后的第二十二天测试；或者3)测试不同剂量CTXn对吗啡诱导的条件性位置偏爱的影响，各组大鼠给予吗啡前在白箱的逗留时间无明显差异，吗啡组与CTXn各剂量组在连续八天吗啡训练后大鼠在白箱停留的时间显著延长，与给药前相比有显著性差异，与0.9%NS组比较亦差异明显，大鼠在对吗啡产生稳定的CPP后，连续给予CTXn2mg/kg组、lmg/kg组、0.5mg/kg组剂量各八天，第十天CTXn2mg/kg和CTXnlmg/kg剂量组与吗啡对照组和给CTXn前比较有显著性差异；连续八天给予CTXn处理后，各CTXn剂量组大鼠对伴药箱偏爱的现象消失甚至产生厌恶，该结果表明蛇毒CTXn能抑制大鼠由吗啡诱导形成的CPP，抑制吗啡成瘾后动物的奖赏效应和渴药行为，有显著的戒毒功效；或者4)测试不同剂量CTXn对成瘾大鼠体重的影响，经连续八天吗啡条件位置偏爱训练后，大鼠体重较NS组有明显减轻；而大鼠成瘾后再连续给予CTXn八天O.5-2mg/kg，蛇毒组大鼠的体重增长都有不同程度的改善，其中CTXnlmg/kg、CTXn2mg/kg剂量组体重增长比CTXn0.5mg/kg显著，分别达到125.7±2.4%及130.5±1.6%，与吗啡组比较差异显著，该结果表明CTXn可促进吗啡依赖大鼠的体重恢复，且有一定的剂量效应关系。全文摘要本发明涉及用于戒毒的蛇毒来源的细胞毒素CTXn及其提纯方法和用途，其特征是1)所述CTXn的分子量为6697.429Da；2)所述CTXn的氨基酸序列为LKCNQLIPPFYKTCAAGKNLCYKMFMVAAPKVPVKRGCIDVCPKSSLLVKYVCCNTDRCN。制备方法如下外采集舟山眼镜蛇毒样本；对舟山眼镜蛇毒样本进行CTXn的分离、纯化，首先进行凝胶过滤，其次通过初筛，选取组分III进行下一步“离子交换”，第三进行离子交换，即采用快速纯化工艺开拓系统进行离子交换，获得单一毒性多肽CTXn，用G-50预装柱脱盐，冻干，备用；测定CTXn的分子量及其氨基酸序列和分子量。本发明能消除成瘾大鼠对吗啡的渴药行为和戒断症状，具有药效显著，毒、副作用小，利于大规模的生产的特点，对防止毒品的危害有极大的社会意义和经济价值。文档编号A61K38/17GK101717439SQ20091021360公开日2010年6月2日申请日期2009年12月4日优先权日2009年12月4日发明者仲维高,信文君,刘先国,唐娅,孔天翰,崔超伟,崔跃,董伟华,黄绍申请人:广州医学院