专利名称：蛇毒来源的细胞毒素-ctx1在制备戒毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛇毒来源的细胞毒素-CTXi的应用，尤其涉及蛇毒来源的细胞毒 素-CTXl在制备戒毒药物中的应用。
背景技术：
蛇毒是一个巨大的生物资源宝库。自1968年英国科学家首先研制成功了治疗血 管闭塞性疾病的蛇毒制剂-ARIN，投放市场后不久即获得了巨大的经济回报。近十年来，随 着多达数十种蛇毒药品的面世，并且取得了不俗的临床疗效和销售业绩，从蛇毒中开发出 价廉、物美的特效药正在成为各国生物学家、药学家及制药企业争相追逐的新热点。舟山眼镜蛇(Naja atra Cantor)，以颈部背面有白色眼镜架状斑纹为其最明显的 特征，体长可达2米。主要分布于我国长江以南诸省及台湾等地。舟山眼镜蛇所分泌的蛇 毒液中含有多种神经毒素(neurotoxin，NT)及细胞毒素(Cytotoxin，CTX)。由于CTX对多 种组织细胞膜均有较强的生物活性，尤其对心肌细胞更为显著，故又称为膜毒素(Membrane toxin)或心脏毒素(cardiotoxin)。从我国大陆及台湾产舟山眼镜蛇毒中至少已分离出了 5 7种不同的CTX，均由60 63个氨基酸残基组成，相对分子质量为6000 7000kD。药物滥用(drug-abuse)是国内外突出的社会和医学问题。二十世纪九十年代以 来，我国毒品问题日趋严重，毒品滥用者剧增。目前在我国滥用的主要毒品是鸦片、吗啡、海 洛因、大麻、可卡因、安非他命、K粉，还有一些人工合成的毒品，包括冰毒、度冷丁、芬太尼、 摇头丸等。吸毒带来巨大的危害。青少年吸毒严重摧残身心健康，一旦吸毒成瘾，会导致记 忆力衰退、营养严重不足、抵抗力下降、多种疾病发生如传播艾滋病。青少年吸毒不仅给自 身带来了极大的危害，而且造成家破人亡，亲人为仇，乃至败坏社会风气，危害社会治安，引 发刑事犯罪。同时，青少年吸毒又会助长和刺激毒品犯罪，并且不断腐蚀其他无辜青少年陷 入吸毒、贩毒和其他违法犯罪的泥潭。目前我国用于戒毒的中草药复方制剂虽有多种，但在控制吸毒和复吸方面的实际 效果并不理想。从河豚鱼中发现的剧毒物质TTX虽有一定的戒毒作用，但因产量低、价格昂 贵，毒性大，难以规模化开发利用。还有些戒毒药物(如美沙酮)，虽然可以有效地控制戒断 症状，但其自身属于麻醉品，有较强的成瘾性，因此，在应用方面受到严格限制。近年来，将蛇毒中的NT用于戒毒已取得了可喜的进展。蛇毒NT能明显改善海洛因 成瘾和成瘾复吸大鼠脑神经元的病理损害。昆明动物研究所将含有蛇毒NT组分的制剂-复 方克痛宁制剂进行戒毒治疗，对海洛因依赖戒断症状的控制效果较好，与美沙酮的疗效相 近，但无成瘾性，副作用轻，无呼吸抑制，不产生欣快效应及缩瞳，便秘等，是一个在脱毒治 疗和康复方面具有较好研究前景的药物。毒蛇可以规模化养殖，质控标准容易控制，所生产 的蛇毒原料可完全满足药品大规模生产之需要。因此，蛇毒研制的戒毒药价格较廉，易于被 患者接受和推广。但鉴于NT的神经毒性较大，致死活性较强，其安全性一直有较大争议。1975 年，Hayashi 首次(Hayashi et al，1975)报道了从台湾眼镜蛇毒 (Naja najaatra)中纯化出一种CTX，是一种强碱性多肽毒素(pI9. 0)，相对分子质量为 6693kDa，有 60 个氨基酸残基(LKCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVKYVCCNTDRCN)，并命名为CTXl。进一步研究发现泰国眼镜蛇(Naja naja siamensis)毒中亦含此毒素(Ohkura et al，1988)。但CTXl是否有戒毒的功能，至今未见 相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供蛇毒来源的细胞毒素-CTXl在制备戒毒药物中的应用，即涉 及CTXl在制药方面的新用途。本发明的另一个目的是提供蛇毒来源的细胞毒素-CTXl在制备戒除吗啡类毒品 成瘾的药物中的应用。经实验证明，CTXl能较好的消除成瘾大鼠对吗啡的行为敏化，消除大鼠的渴药行 为和戒断症状，具有良好的戒毒效果。并且能够改善成瘾大鼠的功能状况和饮食和活动、明 显增加体重从而恢复正常生理获活动。而且CTXl氨基酸序列清楚，成分单一，药效显著，质 量标准可控，毒、副作用小，利于大规模的生产，对于有效戒毒，防止毒品对社会个人的危害 有极大的社会意义和经济价值。
图ICTXl在CM Sepharose FF离子交换色谱图上的洗脱部位；图2用质谱分析法(MALDI-T0F)测定CTXl的分子量为6697. 915kDa。
具体实施例方式以下的实施例均以CTXl对吗啡成瘾大鼠的戒毒作用为例对本发明进行具体阐 述，但是本发明的保护范围并不局限于此，本技术领域的普通技术人员通过以上内容也能 实现本发明的目的。1、CTXl的分离纯化从大陆舟山眼镜蛇自然野生分布优势区域之一的湛江地区野外采集舟山眼镜蛇 毒样本，进行以下分离和纯化得到CTXl (1)凝胶过滤采用 S印hacryl S-100HR 填料，通过 AKTA explorer 100 快速 纯化工艺开拓系统(制备型高效液相色谱仪)进行分子筛过滤柱规格26X 100mm，先用 0. 05MpH6. 4磷酸缓冲液两个柱体积平衡凝胶柱，蛇毒样品溶液通过AKTA explorer-100色 谱仪的上样泵上样(泵速为0. 6ml/min)，洗脱泵速0. 6ml/min,紫外检测波长280nm，每管收 集量6ml/min。获得三个主峰，分别用G-50预装柱(HiPr印26/10Desalting)脱盐，冻干， 备用。取该三个主峰的成分采用以下第3点所述的方法进行戒毒试验，进行戒毒作用的强 弱比较，选取第三主峰进行下一步的“离子交换”。(2)离子交换采用CM Sepharose FF填料，通过AKTA explorer 100快速纯化 工艺开拓系统进行离子交换(柱规格26X100mm，先用0.05M pH6. 4磷酸缓冲液两个柱 体积平衡凝胶柱，第三主峰(IOOmg)样品溶液通过AKTA explorer-100色谱仪的上样泵 上样(泵速为 0. 8ml/min)，用 IOOOmL 含 0. 5mol/L NaCl 的 0. 02mol/L ρΗ8· 0 的 PBS 和 IOOOmLO. 02mol/L pH8. 0的PBS进行梯度洗脱。洗脱泵速0. 8ml/min，紫外检测波长280nm，每管收集量8ml/min。获得CTXl (图1)，用G-50预装柱脱盐，冻干，备用。2、CTXl分子量及其氨基酸序列测定用质谱分析法(MALDI-T0F)测定CTXl的分子量为6697. 915kDa(图2)；用埃德曼降解法(Edman degradation)测定CTXl的氨基酸序列为LKCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVK YVCCNTDRCN与从台湾舟山眼镜蛇毒中纯化出的CTXl相比，来源于大陆湛江地区舟山眼镜蛇 毒CTXl的分子质量仅有约3kDa的差异，但两者氨基酸序列完全一致。3、利用国际戒毒实验的经典模型-条件位置偏爱模型(Conditioned plac印reference，CPP)观察CTXl对吗啡成瘾大鼠的戒毒作用(1)吗啡成瘾大鼠模型的建立雄性SD大鼠体重180 220g，注射吗啡(10mg/kg)后 随即放进条件位置偏爱实验箱(型号JLBehv-CPPG)中50分钟，连续训练8天。于用药后第10 天启动计算机程序，根据15min内大鼠在黑、白两箱的停留时间，筛选出吗啡成瘾大鼠50只。(2) CTXl对吗啡诱导大鼠已形成CPP效应的影响将吗啡成瘾大鼠分成5组模型组，对照组(每天腹腔注射生理盐水)，低剂量组 (每天腹腔注射0. lmg/kg的CTX1)，中剂量组(每天腹腔注射0. 2mg/kg的CTX1)，高剂量 组(每天腹腔注射0. 4mg/kg的CTX1)，每组10只大鼠，连续给药8天后，分别记录大鼠的体 重、测量CPP、观察其对吗啡戒断的症状(如直立、理毛、湿狗样抖动、寒战、伸展、舔阴、齿颤 的次数)并评分。实施例一不同剂量CTXl对吗啡形成CPP的影响大鼠在对吗啡产生稳定的CPP后，连续分别给予CTX10. 1,0. 2,0. 4mg/kg剂量各8 天后，在dll时CTX10. 2mg/kg和0. 4mg/kg剂量组与吗啡对照组和给CTXl前比较有显著性 差异(P < 0. 05 0. 01)。8天连续给予CTXl处理后，各CTXl剂量组能对伴药箱不再产生 偏爱甚至产生厌恶。CTXl抑制大鼠由吗啡诱导形成的CPP(表1)说明其对吗啡成瘾后动物 的渴药行为及奖赏效应有良好的戒毒效果。表1 不同剂量CTXl对吗啡成瘾cpp的影响 #p < 0. 05vsN. S groups ρ < 0. 01 · ρ < 0. 001 A ρ < 0. 05vsM0Rgroupρ < 0. 05vsCTXl (0· lmg/kg * ρ < 0. OlvsCTXl (0. lmg/kg)实施例二 CTX1对纳洛酮的催瘾效应对实施例一中各实验组大鼠在dl8时进行腹腔注射5mg/kg纳洛酮催瘾，观察40 分钟，记录戒断症状并评分(表2)。经统计学处理显示，吗啡组与其他各组间差异显著(P < 0. 05)，而生理盐水组与各CTXl组间无统计学意义(P > 0. 05)。该结果说明CTXl不是以替代吗啡类成瘾药品而发挥其戒毒的功效。表2纳洛酮对模型组、CTXl各剂量组的催瘾效应(χ士 s，η = 8) ■ P < 0. 01, vs 0. 9% N. S control group ※卩^川丄…CTXl group < 0. 05 vs 0. 9% N. S control group andCTXlgroup实施例三CTX1处理对成瘾大鼠体重的影响大鼠连续8天给予吗啡进行条件位置偏爱训练后，大鼠重量明显比同样方式处理 生理盐水组增长小，表明大鼠已对吗啡形成依赖，影响了体重的增长。成瘾大鼠连续给予不 同剂量CTX18天后体重都有不同程度的增加(表3)，其中CTX10. 2mg/kg、CTX10. 4mg/kg剂
量组体重增长比CTX10. lmg/kg显著，分别达到132. 3士2. 0%及139. 2士3. 7%，较吗啡组有 显著差异(P < 0. 01)。结果表明CTX1能够改善吗啡依赖大鼠体重，改善其精神活动和饮 食状况且有一定的剂量效应关系。表3CTX1对成瘾大鼠体重的影响(％ ) (χ士s，η = 8)
权利要求
蛇毒来源的细胞毒素 CTX1在制备戒毒药物中的应用。
2.蛇毒来源的细胞毒素-CTXl在制备戒除吗啡类毒品引起的毒瘾的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了蛇毒来源的细胞毒素-CTX1在制备戒毒药物中的应用。经实验证明，CTX1能较好的消除成瘾大鼠对吗啡的行为敏化，消除大鼠的渴药行为和戒断症状，具有良好的戒毒效果。并且能够改善成瘾大鼠的功能状况和饮食和活动、明显增加体重从而恢复正常生理获活动。
文档编号A61P25/36GK101926980SQ200910215378
公开日2010年12月29日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年7月29日
发明者仲维高, 信文君, 刘先国, 唐娅, 孔天翰, 崔超伟, 崔跃, 董伟华, 黄绍 申请人:中山大学