专利名称：Il-4在制备治疗重症肝炎的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，具体涉及白细胞介素-4(IL-4)在治制备治疗重症肝炎的 药物中的用途。
背景技术：
重型乙肝病情发展迅速，预后差，是严重危害人类健康的一种疾病。其发病机制复 杂，至今尚未完全阐明，但多数学者认同二次打击学说，认为第一次打击导致肝损伤而使肝 脏屏障功能障碍，其后导致的肠源性内毒素血症，激活了单核吞噬细胞系统，释放大量细胞 因子和炎性介质，形成第二次打击，进一步损伤肝脏、加重肝细胞坏死，导致肝衰竭发生。所 以内毒素主要的致毒成分脂多糖(lipopolysaccharidhLPQ，是肝衰竭的重要致病机制的 核心分子。小鼠经D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)致敏后，再注射小剂量的LPS，可 导致严重的实验性重型肝炎，肝脏生化和代谢改变与临床病毒性重型肝炎较为相似，可同 时引起内、外源性内毒素血症。因此，能应用LPS/felN诱发的小鼠实验性重型肝炎模型，筛 选重症肝炎的治疗药物。IL-4是一种主要由Th2细胞分泌的细胞因子，它具有促进Th细胞0型(T helperO,ThO)细胞发育、分化为Th2细胞的功能，被认为是Th2转化的必需因子。目前IL-4 主要用于肿瘤的临床治疗，它能诱导肿瘤免疫并排斥已形成的恶性肿瘤粒细胞巨噬细胞 集落朿lJ激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)与 IL-4 联合用药可以治疗癌症。用量为2. 5mg/kg/d GM-CSF加上0 6. 0ug/kg/d IL-4，给药方 式为全身给药，治疗周期为14天。其中IL-4的最大耐受剂量为6.0ug/kg/d，最适剂量为 4. 0ug/kg/d。IL-4对Thl诱导的器官特异性自身免疫病具有普遍的治疗作用。此外，还有研 究发现，对于严重的顽固性银屑病患者，应用重组人类白细胞介素-4(Recombinant Human IL-4, rhIL-4)具有明显的临床治疗作用[。在IL-4重组蛋白药物治疗的20名银屑病病 人的6周临床实验研究中，所有病人的银屑病面积与严重程度都有所降低，其中15名病人 病情改善了 68%以上。其治疗机理在于IL-4能够诱导Th2应答，保持Thl与Th2的平衡， 改善Thl致炎性细胞因子造成的组织损伤(Nat Med. 2003Jan;9(l) :40-6)。目前，并没有 IL-4能有效治疗重症肝炎的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供白细胞介素-4的一种新用途。IL-4的这种新 用途是用于制备治疗重症肝炎的药物组合物。其中，上述用途中，IL-4的制备的治疗重症肝炎的药物中的IL-4的用量为0. 1 5ug/kg/d。优选的，IL-4 的用量为 0. 5ug/kg/d 5ug/kg/d。其中，上述治疗重症肝炎的药物的给药途径为皮下注射给药。其中，上述治疗重症肝炎的药物的使用时间为1个月。3
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种重症肝炎的药物组合物。该治疗重 症肝炎的药物组合物是由IL-4添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。其中，上述IL-4的用量为0. lug/kg/d 5ug/kg/d。优选的IL-4的用量为0. 5ug/ kg/d 5ug/kg/cL其中，上述治疗重症肝炎的药物组合物的给药途径为皮下注射给药，使用时间为1 个月。本发明实施例表明上述实验结果表明IL_4治疗可以降低重型肝炎模型小鼠血 清ALT、AST、LDH、BILT水平，治疗后重症肝炎模型小鼠的肝脏病理损伤程度明显减轻；IL-4 治疗能够降低重型肝炎小鼠血清和肝脏中炎症因子水平，肝内炎症因子的mRNA水平也明 显下调；IL-4治疗能够改善重型肝炎小鼠肝脏细胞凋亡情况，治疗以后的重肝小鼠其肝脏 的凋亡明显减少；IL-4治疗还能够提高重型肝炎小鼠肝内还原型谷胱甘肽的含量，这对于 保护肝损伤具有重要的作用；IL-4治疗也能降低重型肝炎小鼠肝诱导性一氧化氮合成酶 的水平，减弱NO对肝脏的损伤程度。由此可见，以IL-4为为活性成分制备治疗重型肝炎的 药物，具有很好的应用前景。
图1为IL-4治疗重症肝炎模型小鼠的肝脏病理切片HE染色(X200)结果；其中 A 正常对照组；B 模型对照组；C 大剂量治疗组；D 小剂量治疗组。图2为IL-4治疗重症肝炎模型小鼠对血清和肝脏TNF- α的影响。图3为IL-4治疗重症肝炎模型小鼠对血清和肝脏IL-I β的影响。图4为IL-4治疗重症肝炎模型小鼠对血清和肝脏IL-6的影响。图5为IL-4治疗重症肝炎模型小鼠对血清和肝脏IFN- γ的影响。图6为IL-4治疗对小鼠肝脏炎症因子mRNA转录水平的影响；其中1 正常对照组；2模型对照组；3 大剂量治疗组；4 小剂量治疗组。图7为IL-4治疗对小鼠肝细胞凋亡情况的影响。A 正常对照组；B 模型对照组；C 大剂量治疗组；D 小剂量治疗组。图8为IL-4治疗对小鼠肝脏iNOS水平的影响。1 正常对照组；2 模型对照组；3大剂量治疗组；4 小剂量治疗组。
具体实施例方式实施例一用IL-4治疗重症肝炎(一 )材料1.实验动物BALB/c小鼠(7-8周，雌性)购自四川大学动物研究中心，体重18_22g ；2.主要试剂、材料及试剂盒1)IL_4(购自 PR0SPEC 公司，以色列，货号.CYT-282)2) D-GalN, LPS 购自 Sigma。3) IL-I β，TNF-α，IL-6, IL-10，IFN ELISA 试剂盒购自欣博盛公司。4) TUNEL 检测试剂盒(DeadEnd Fluorometric TUNEL System)购自 Promega 公4司。5) ERKl，ERK2，P-ERK, iNOS抗体购自中衫金桥公司。6)辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗小鼠IgG (H+L)购自北京中山生物公司。7)DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。8) Western blotting化学发光检测试剂盒购自PIERCE公司。9)其他试剂均为进口或国产分析纯产品。3.试剂配制3. IRIPA 裂解液(RIPA Lysis Buffer) :50mMTris-Hcl PH= 7. 4,150mM NaC, lmmol/LPMSF ； ImMEDTA ；1% Tritox-100 ； 脱氧胆酸钠；0. 1% SDS3. 2免疫组化试剂配制1)TBS Tris-HCl 缓冲液(0. 5M, pH7. 6) 100ml, NaCl 8. 5g，定容至 1000ml。2)枸橼酸盐缓冲液储存液=A液0. IM枸橼酸溶液称取21. Olg枸橼酸(C6H5O7 -H2O)溶于IOOOml蒸 馏水中。B液0. IM枸橼酸钠溶液称取29. 41g枸橼酸钠(C6H5Na7A ·2Η20)溶于IOOOml超 纯水中。工作液取9ml A液和41ml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值应为6. 0士0. 1， 0. OlM柠檬酸缓冲液用于抗原修复。3. 3EMSA 试剂配制DSucrose Buffer 0. 32M Sucrose ； IOmM Tris HCl pH 8. 0 ；3mM CaC12 ； 2mMMg0Ac ；0. ImM EDTA ；0. 5% NP-40 ；ImM DTT ；0. 5mM PMSF2)Low Salt Buffer :20mM HEPES(pH 7. 9) ；1. 5mM MgCl2 ；20mM KCl ；0. 2mMEDTA ； 25% glycerol (v/v) ；0. 5mM DTT ；0. 5mM PMSF ；3)High Salt Buffer ；20mM HEPES (pH 7. 9) ； 1. 5mM MgC12 ；800mM KCl ； 0. 2mMEDTA ；25 % glycerol(v/v) ；1 % NP-40 ；0.5mM DTT；0.5mM PMSF ；4.0 μ g/ mlleupeptin, aprotinin,pepstatin4) 5X Binding Buffer :50mM Tris HCl (pH 8. 0) ；750mM KCl ；2. 5mM EDTA ；0. 5% Triton-X 100 ；62. 5% glycerol (v/v) ；ImM DTT4.实验仪器及设备1)超低温冰箱SANYO公司，型号MDF_382E2)酶标仪Bio-Rad公司，型号5503)纯水仪MiIlipore 公司，型号EASYpure UF 074124)低速离心机:Heraeus Heraeus，型号Varifuge 3. 0 ；Megafuge 1. 05)病理切片机:RM2125, LEICA6)病理组织漂烘处理仪PHY-III，常州中威电子仪器厂7)图像采集系统显微镜Nikon ECLIPSE E600，摄像仪SPOT ；ZEISS荧光显微镜。(二)、实验方法1.动物处理1. 1小鼠重型肝损伤模型的制备D-GalN和LPS均用无菌生理盐水溶解，D-GalN浓度为70mg/mL，LPS浓度为lmg/5mL。7-8周龄雌性BalB/C小鼠，D-GalN700mg/kg腹腔注射，同时LPS 1μ g/kg腹腔注射，制 备小鼠免疫性肝损伤模型。1. 2动物的分组与用药治疗建模后的小鼠随机分为3组，每组6只，分别为LPS/felN模型对照组，IL_4给药 5 μ g/kg组(大剂量组)，IL-4给药0. 5 μ g/kg组(小剂量组)。给药组在建模结束以后， 给于相应剂量的IL-4于皮下进行治疗。模型对照组于同一时间点给予生理盐水0. 2ml皮 下注射。正常组采用正常老鼠，在所有相应的时间点均予生理盐水0. 2ml腹腔注射或皮下 注射。1. 3标本收集8小时后摘除小鼠眼球取血，分离血清待检；同时，脱颈椎处死小鼠，取肝脏左叶 相同部位，用10%福尔马林溶液固定，作病理检查。选肝脏右叶用冷生理盐水漂洗去除积 血，置于去酶EP管中并保存于速冻液氮内，再转存于一 70°C冰箱，以待提取总RNA、总蛋白、 核蛋白等下一步生理生化测定。2、生化指标检测IfiIi青的MBI (alanine aminotransferase, ALT)(aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脱氧酶(lactate dehydrogenase, LDH)、总胆红素(total b i 1 irub iη，TBIL)，全自动生化仪测定。3、小鼠炎症相关细胞因子水平分析3. 1血清和肝脏组织炎症相关水平测定(ELISA法)1)组织勻浆液的制备量取预冷的生理盐水于EP管中，体积总量应该是组织块重 量的9倍。将冻存的组织放入研钵中，加液氮进行研磨，研磨成粉状，倒入加有生理盐水的 EP管中，置于冰上30分钟后在4°C，12000g离心10分钟，上清液即为组织勻浆液，分装小 管，进行测定。2)待检样品包括血清和组织勻浆液。在做ELISA之前，血清和组织勻浆液经过不 同比例的稀释后，进行细胞因子测定浓度和实验OD值结果相关性分析，确定样本最佳稀释 比例。做ELISA之前，每份样品严格进行蛋白定量，保证样品之间总蛋白的一致性3)采用双抗体夹心ELISA法测定。96孔板每孔加50 μ 1待检样品。轻轻混勻，37 °C 孵育90分钟。吸取每孔液体弃去，用400μ1洗涤液洗板共洗5次并用吸水纸吸干。每孔 加100 μ 1生物素酶结合物溶液，37°C孵育60分钟。用400 μ 1洗涤液洗板子，共洗5次并 用吸水纸吸干。每孔加入100 μ 1酶结合工作液，37°C孵育30分钟，400 μ 1洗涤液洗板子， 共洗5次并用吸水纸吸干。每孔加100 μ 1显色底物，37°C孵育15分钟，加入终止液100 μ 1 每孔，混勻。在3分钟内，于酶标仪检测0D450nm。
3. 2肝脏组织炎症因子mRNA表达检测(RT-PCR)1)取冻存的肝组织，于研钵中加入液氮研磨成粉状，迅速置盛有Iml Trizol的EP 管中，室温静置5分钟，10，OOOg 4°C离心10分钟。取上清加入三氯甲烷O.aiil，振荡，室温 静置3分钟，12，000g 4°C离心15分钟。取上层水相，加异丙醇0. 5ml，室温静置10分钟， 12, 000g 4°C离心10分钟。弃上清，75%乙醇清洗RNA沉淀，7，500g 4°C离心5分钟，晾干 RNA。以30 μ IDEPC水溶解，分光光度计测浓度，RNA电泳。2)按照 SuperScript First-Strand Synthesis System(invitrogen 公司)试剂盒说明书合成cDNA。取cDNA2 μ 1做半定量PCR，用相应细胞因子上游及下游引物各50pmol， GAPDH上游及下游引物各50pmol。取反应结束产物8 μ 1加样于2%琼脂糖凝胶上电泳。引 物由上海英骏生物工程公司合成(见表1)。
表1引物序列
权利要求
1.IL-4在制备治疗治疗重症肝炎的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述IL-4的用量为0.lug/kg/d 5ug/ kg/d0
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述IL-4的用量为0.5ug/kg/d 5ug/ kg/d0
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述IL-4的给药途径为皮下注射给药。
5.根据权利要求1 4任一项所述所述的用途，其特征在于所述IL-4的使用时间为 1个月。
6.治疗重症肝炎的药物组合物，其特征在于由IL-4添加药学上可接受的辅助性成分 制备而成，IL-4的用量为0. lug/kg/d 5ug/kg/d。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述IL-4的用量为0.5ug/kg/d 5ug/kg/d。
8.根据权利要求6或7所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的给药途径 为皮下注射给药，使用时间为1个月。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，本发明所要解决的技术问题是提供IL-4的一种新用途。具体来讲，是提供了IL-4在制备重症肝炎的药物组合物中的用途。在用量为0.1μg/kg/d～5μg/kg/d时治疗重症肝炎具有好的效果。为重症肝炎的治疗提供了一种新的选择。
文档编号A61K38/20GK102049041SQ20091030885
公开日2011年5月11日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者李炯, 魏于全 申请人:四川大学