用于促进血管屏障功能和治疗肺纤维化的组合物和方法

专利名称：用于促进血管屏障功能和治疗肺纤维化的组合物和方法
用于促进血管屏障功能和治疗肺纤维化的组合物和方法关于联邦资助研究的陈述本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)提供的资金号ROl HL077671的政府支持下做出。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术：
急性和慢性肺部血管炎症和渗漏与多种病理状况相关。例如，流感感染和脓毒症 可以具有急性并潜在地威胁生命的肺部血管炎症的特征。此外，慢性肺部血管炎症与肺纤 维化的发生和发展相关。肺纤维化是在肺中纤维状瘢痕组织的异常形成，其中瘢痕形成之 前出现并伴有炎症。肺纤维化是引起肺泡和肺的间质组织膨胀和瘢痕形成的慢性疾病。肺 纤维化的病因通常是从未确定的(即特发性肺纤维化)，但在某些情况下，肺纤维化的发生 和发展与疾病或感染例如结核病、系统性红斑狼疮、系统性硬化症，一种或多种环境条件诸 如例如暴露于二氧化硅粉尘和石棉或甚至特定药物例如硝呋妥因妥英、乙胺碘呋酮和博来 霉素相关。尽管肺纤维化可能温和到几乎不引起症状，但是它也可能是致命的。发明简述本文描述了促进血管屏障功能的活性药剂和组合物。本文描述的组合物包括至少 一种能够促进血管屏障功能的活性药剂，并且在一个这样的实施方案中，本文描述的组合 物包含促进血管内皮屏障功能的活性药剂。在另一个实施方案中，本文描述的组合物包括 在选自肺脏的血管内皮、肾脏的血管内皮和脾脏的血管内皮之一的内皮组织中促进血管屏 障功能的活性药剂。在另一个实施方案中，本文描述的组合物包括抑制与肺部炎症相关的 血管通透性的活性药剂，所述血管通透性包括与导致急性肺部炎症和慢性肺部炎症或由急 性肺部炎症和慢性肺部炎症引起的病症相关的血管通透性。正如由本文提供的实验例所显 示的，本说明书、特别是实施方案的活性药剂，即使在存在炎症和血管通透性的多种介导物 包括例如内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF- α )和IL-I β的情况下，也促进血 管屏障功能。本文还提供了用于促进血管内皮屏障功能的方法。在一个实施方案中，用于促进 血管内皮屏障功能的方法包括用本文描述的活性药剂处理一种或多种血管内皮细胞。在 一个这样的实施方案中，处理一种或多种血管内皮细胞的步骤，可以通过向需要的患者给 药治疗有效量的本文描述的活性药剂来进行。在具体实施方案中，使用活性药剂处理一种 或多种血管内皮细胞引起下列一种或多种效应血管内皮屏障功能的保留；在存在一种或 多种炎症介导物、包括内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β中的一 种或多种的情况下，促进内皮屏障功能；在存在一种或多种炎症介导物、包括内毒素(例如 LPS)、肿瘤坏死因子中的一种或多种的情况下，抑制血管渗漏；促 进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现；以及促进pl20-连环蛋白在血管内皮细胞 表面的表达。在另一个这样的实施方案中，在血管内皮细胞暴露于一种或多种炎症介导物 后，使用活性药剂治疗一种或多种血管内皮细胞，至少部分恢复了血管屏障功能，其中炎症 的一种或多种介导物选自内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β中的 一种或多种。
附图简述

图1 :Slit2N通过增强VE-钙粘着蛋白在细胞表面的定位而使内皮稳定。(A)，在 存在模拟物或S1U2N的情况下，在用LPS、TNF- α或IL-I β刺激的HMVEC-肺中测量的体 外通透性。(B)，在存在模拟物或S1U2N的情况下，用IL-I β刺激Robo4或对照siRNA敲 除的HMVEC-肺，以评估体外通透性。(C-E)，将HMVEC-肺用模拟物或S1U2N处理，进行膜 分级，然后对VE-钙粘着蛋白(C)、pl20-连环蛋白(D)或β-连环蛋白(E)进行免疫印迹。 (F)，将HMVEC-肺用模拟物或S1U2N刺激，并对VE-钙粘着蛋白进行免疫荧光分析(绿 色)。白色箭头指示VE-钙粘着蛋白细胞表面定位增强的区域。对于所有实验来说，Ν>3， *Ρ < 0. 05，***Ρ < 0. 005，****Ρ < 0. 001，误差线表示 s. e. m。图2 :Slit2N增强VE-钙粘着蛋白/pl20-连环蛋白的相互作用。(A) JfHMVEC^i 在存在模拟物或S1U2N的情况下用IL-I β处理，并对VE-钙粘着蛋白和ρ120-连环蛋白进 行免疫染色。白色箭头指示在模拟物处理的细胞中缺少VE-钙粘着蛋白或ρ120-连环蛋白 的细胞表面区域。黄色箭头指示在S1U2N处理的细胞中VE-钙粘着蛋白或ρ120-连环蛋白 的细胞表面定位增强的区域。(B)，将HMVEC-肺在存在模拟物或S1U2N的情况下用IL-I β 刺激。将裂解物进行对VE-钙粘着蛋白的免疫沉淀，然后对Ρ120-连环蛋白和VE-钙粘着蛋 白进行免疫印迹。(C)，将HMVEC-肺在存在模拟物或S1U2N的情况下用IL-I β刺激。评 估VE-钙粘着蛋白的内化(绿色)，内化的区域用白色箭头指示。(D)，在存在对照IgG或 VE-钙粘着蛋白抗体的情况下测量体外通透性。对于所有实验来说，N ^ 3, *Ρ < 0. 05，**Ρ
<0. 01，***Ρ < 0. 005，误差线表示 s. e. m。图3 :Slit2N在体内抑制LPS诱导的通透性、蛋白渗出和细胞浸润。(A)，对Robo4+A 和R0b04AP/AP小鼠进行模拟物或Slit2N静脉内注射，然后气管内滴注IOyg LPS。然后小 鼠接受伊文思蓝白蛋白(EBA)静脉内注射，并使用EBA在肺中的积累来评估血管通透性 (N > 4)。(B-D)，可选地，在LPS给药后M小时获取支气管肺泡灌洗液，并评估蛋白含量 (B)、总炎性细胞积累(C)或中性粒细胞积累⑶(N>5)。(E)，在来自在模拟物或Slit2N 存在下暴露于LPS的小鼠的肺脏切片上，进行H&E染色。尔)，在用3.348 LPS处理的小 鼠中测量到蛋白渗出(N = 5)。(G-I)，对小鼠进行模拟物或S1U2N与对照或VE-钙粘着 蛋白阻断抗体的静脉内注射，然后气管内滴注LPS。获取支气管肺泡灌注液，并评估蛋白含 量(G)、总炎性细胞积累(H)或中性粒细胞积累(I) (N > 5)。*P < 0. 05，***P < 0. 005，****P
<0. 001，误差线表示s. e. m。图4 :Slit2N在脓毒症的盲肠结扎和穿刺模型中降低通透性和死亡率。(A)，将小 鼠进行CLP或假手术。对小鼠进行伊文思蓝白蛋白(EBA)静脉内注射，并测量肾脏(A)或 脾脏⑶中的EBA积累以评估血管通透性(N = 5)。(C)对Robo4v+小鼠进行CLP并用模 拟物或S1U2N治疗，并评估存活率(模拟物治疗N= 15，Slit2N治疗N= 14)。在模拟物 或S1U2N治疗的CLP小鼠(N = 6)的血清中细胞因子⑶或趋化因子(E)的水平。(F)， 对Robo4AlVAP小鼠进行CLP并用模拟物或S1U2N治疗，并评估存活率(模拟物治疗N= 13， Slit2N 治疗 N = 13)。*P < 0. 05，**P < 0. 01，****P < 0. 001，误差线表示 s. e. m。图5 :Slit2N在H5m感染模型中降低死亡率。(A)，将Balb/c小鼠用H5W病毒进 行鼻内感染。对小鼠进行伊文思蓝白蛋白(EBA)静脉内注射，并测量肺中EBA的积累以评 估血管通透性(N=5)。(B)，在H5m感染后小鼠的存活率(模拟物治疗N = 20，Slit2N治疗N = 20)。(C)，在感染后6天，在来自H5m感染的小鼠的肺部切片上进行H&E染色。左 上图中的白色箭头指示肺部小动脉周围水肿液的积累。中上图证实了严重的肺泡炎症。右 上图中的黑色箭头指示泡沫状巨噬细胞的出现。(D)，在感染后6天测量H5W病毒的滴度 (N = 3个合并的小鼠组)。在感染后6天测量肺勻浆液中细胞因子(E)或趋化因子(F)的 水平(N = 3个合并的小鼠组)。图6 =Slit通过增加细胞表面的VE-钙粘着蛋白降低由多种炎症刺激引起的血管 渗漏。(A)，在正常条件下，肺泡毛细血管提供半透性屏障。(B)，炎症刺激引起细胞因子大 量释放，导致VE-钙粘着蛋白的内化和屏障功能的破坏。这引起血管渗漏和富含蛋白质的 水肿液在肺泡空间中的积累。(C)，Slit通过增加细胞表面的VE-钙粘着蛋白增加抗多种 细胞因子的血管屏障功能。图7 小至Slit2_Dl(40kD)的重组Slit肽是有活性的。在图7A中，描述了用于 Slit蛋白的不同构建物。标出了四个富含亮氨酸的结构域(LRR)、表皮生长因子同源区 (EGF)和 C-末端标签(MYC/HIS)。图7B中显示了 VEGF介导的内皮细胞迁移被不同Slit构建物QnM)的抑制。图8 :SecinH3抑制博来霉素诱导的纤维化。对6_8周龄的BL/6小鼠进行盐水或 0. 05U博来霉素的鼻内滴注。每天两次通过腹膜内注射给药100 μ L介质或30 μ M SecinH30 肺纤维化通过Sircol胶原蛋白测定法进行评估。N >每组7只动物，*P < 0. 05。图9 :SecinH3的化学结构。图10 :Robo4信号传导途径的图示。图11 在LPS滴注后6小时，肺中的Robo4表达增加。图12 在禽流感的小鼠模型中，给药Slit2蛋白对禽流感病毒感染的小鼠的存活
率的影响。图13 (a)在博来霉素给药后11天，Slit2极大降低了在Robo4+A小鼠肺中博来 霉素诱导的EBA积累。Slit2的效应在Robo4AlVAP小鼠中丧失。(b) Slit2也极大降低博来 霉素诱导的肺纤维化。这种效应在R0b04AP/AP小鼠中丧失，表明Slit2直接作用于内皮以减 少肺纤维化。(c)使用三色染色以增加胶原蛋白沉积的可视性进行的肺组织学检查证实了 Slit2以Robo4依赖性方式的作用。图14 =Slit以剂量依赖性方式抑制LPS诱导的细胞浸润。㈧通过免疫印迹评估 了 Robo4或对照siRNA敲除的HMVEC-肺的Robo4表达。(B) Z-轴的共聚焦图像显示在下 方，旁边用黄色线标出。在S1U2N处理的细胞中观察到接合厚度的增加。(C-D)在水平逐 渐增加的S1U2N存在下对小鼠进行LPS诱导的ALI。显示了细胞浸润和中性粒细胞。N = 4，*P < 0. 05。图15 正如通过定量组织学所评估的，S1U2N减少LPS诱导的ALI。在存在S1U2N 的模拟物的情况下，对Robo4+A和Robo4AlVAP小鼠进行LPS诱导的ALI。由不知情研究人员 对来自这些小鼠的肺切片进行H&E染色和定量组织学，以评估肺损伤的程度。N = 3，***P < 0. 005。图16 =Slit不降低人初始PMN的迁移。(A)在模拟物Slit2存在下对细胞进行了 向白细胞趋化物fMLP的迁移。(B)从hPMN分离RNA，并进行定量PCR。使用脑cDNA作为阳 性对照。N = 3，***P < 0. 005，误差线表示s. e. m。
图17 :Slit2在整个肺中表达在内皮近端。如箭头所标出，Slit2与Robo4碱性磷 酸酶(AP)表达被共定位。图18 在CLP过程中不存在显著的肺损伤。(A-C)对小鼠进行CLP，并用模拟物或 S1U2N处理。将肺切片用H&E染色(A)，并进行定量组织学以评估所执行的肺损伤程度(B)， N = 3。(C)使用伊文思蓝白蛋白评估了小鼠肺中的通透性。N = 5。图19 :Robo4的丧失不影响早期发育中的肺中血管内皮的图式形成。A_C、D_F和 G-I分别显示R0b04v+、R0b04VAP和Robo4AlVAP E12. 5肺，对内皮(E-钙粘着蛋白)和血管 系统(⑶31)进行染色。箭头指示左肺动脉EC管的远端范围。B、E和H是第一左侧部次级 气路支路的远端分支的放大图，其中横线表示从远端支路顶点向外线性延伸的CD31+网状 组织区划的厚度。C、F和I显示了用针对⑶31的抗体染色的远端左肺动脉EC管区域的放 大图。第一、第二和第三左背部次级气路分支的位置用Dl、D2和D3表示。图20 :Robo4的丧失不影响发育中的肺中血管内皮的图式形成。A_B、C-D和E-F 分别显示R0b04v+、R0b04+Au^n Robo4AlVAP E14. 5肺，对肺内皮(E-钙粘着蛋白)和血管发 育(⑶31)进行染色。箭头表示位于左主支气管侧方的左肺动脉。A、C和E中的深色箭头 指示向右副叶供血的右肺动脉支路，其位于通向副叶的右侧次级气路支路的后方。详细描述I.定义公开了可以用于本公开的活性药剂、组合物和方法、可以与它们结合使用、可用于 制备它们或是它们的产物的材料、组合物和组分。在本文中公开了这些以及其他的材料，并 应该理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、组群等被公开时，尽管可能没有专门公开这 些化合物的每个不同的个体和集合的组合和排列的具体指称，但它们每个都在本文中具体 考虑并描述。例如，如果公开并讨论到多肽，并且讨论到对于包含多肽的大量分子可以进行 大量修饰时，多肽和可能的修饰的每个和所有的组合和排列都被具体考虑到了，除非明确 指明不是这样。因此，如果公开了一组分子A、B和C以及一组分子D、E和F，并且公开了组 合分子A-D的实例，那么即使没有对每种组合分子进行单独列举，它们也被单独地和集合 地考虑到了。因此，在本例中，每个组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F被具体地 考虑到了，并应该被认为从A、B和C，D、E和F以及示例组合A-D的公开中得到公开。同样 地，它们的任何子集或组合也被具体考虑到并公开。因此，例如，亚组A-E、B-F和C-E被具 体考虑到了，并应该被认为从A、B和C，D、E和F以及示例组合A-D的公开中得到公开。这 种概念适用于本申请的所有情况，包括但不限于在制造和使用本公开的组合物的方法中的 步骤。因此，如果存在各种不同的可以执行的附加步骤，应该理解每个这些附加步骤可以与 本公开的方法的任何具体实施方案或实施方案的组合一起执行，并且每个这样的组合都被 具体考虑到了，并应该被当作公开了。本领域技术人员只使用常规实验即可识别或能够确定本文描述的方法和组合物 的具体实施方案的等价物。这样的等价物打算被所包含的权利要求书涵盖。还应该理解，本文中使用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，而不打算用于 限制本文描述的发明的范围。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语，具有本领域技术人员在 本说明书背景下所通常理解的意义。
必须指出，当在本文和随附的权利要求书中使用时，单数形式包括复数指称物，除 非上下文明确表示不是这样。因此，例如，指称“多肽”包括大量这样的多肽，指称“多肽”是 指一个或多个多肽或其本领域技术人员已知的等价物，等等。“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件、情况或材料可以发生或存在，或者可 以不发生或不存在，并且该描述包括了事件、情况或材料发生或存在的情形，以及它不发生 或不存在的情形。在本文中，范围可以表示成从约一个特定值和/或到约另一个特定值。当用这样 的范围表示时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过 使用先行词“约”将值表示成近似值时，应该理解具体的值形成了另一个实施方案。还应该 理解，每个范围的端点的重要性在于既与另一个端点有关，又独立于另一个端点。还应该理 解，本文中公开了许多数值，每个值在本文中除了该值本身之外，还公开为约该特定值。例 如，如果公开了值10，那么也公开了约10。还应该理解，两个特定单位之间的每个单位也被 公开。例如，如果公开了 10和15，那么11、12、13和14也被公开了。烷基是指由碳-碳单键相连并具有1到8个连接在一起的碳原子的任选被取代的 烃基。烷基烃基可以是直链，或包含一个或多个分支。这些基团包括甲基、乙基、丙基、异丙 基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。低级烷基是指具有1到4个碳原子的任选被取代 的支链或直链烷基。烯基是指在碳原子之间包含至少一个碳-碳双键并含有连接在一起的2-8个碳原 子的任选被取代的烃基。烯基烃基可以是支链或直链的。环烷基是指任选被取代的环状烷基或任选被取代的非芳香族环状烯基，并包括单 环和例如二环和三环的多元稠合环结构。环烷基可以具有例如3到15个碳原子。在一个 实施方案中，环烷基具有5到12个碳原子。适合的环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊 基、环己基等。杂环是指任选被取代的饱和或部分饱和的非芳香族成环部分，包含至少一个碳原 子。杂环部分典型地包含单环或例如二环和三环的多元稠合环结构。在一个实施方案中， 环是5到6元的，并典型地包含1到3个非碳原子。杂环的非碳原子可以独立地选自氮、氧 和硫。芳基是指带有至少一个具有共轭π电子环系统的环的任选被取代的芳香基团， 包括单环或例如二环和三环的多元稠合环结构。芳基包括任选被取代的碳环芳基。适合的 芳基的实例包括苯基、萘基、蒽基、菲基等。杂环芳基是指带有至少一个具有共轭π电子环系统的环、包含至少一个非碳原 子的任选被取代的芳香基团。杂环芳基部分典型地包含一个环或例如二环和三环的多元稠 合环结构。适合的杂环芳基的实例包括呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡啶基等。烷氧基是指与烷基相连的氧。低级烷氧基是指与低级烷基相连的氧。在一个实施 方案中，氧与长度为1到4个碳的未取代烷基相连。例如，烷氧基可以是甲氧基、乙氧基等。亚烷基是指在碳原子之间只含碳-碳单键的任选被取代的烃链。亚烷基链具有1 到6个碳，并在两个位置处与其他官能团或结构部分相接。适合的亚烷基的实例包括亚甲 基、亚乙基等。当在本文中使用时，小分子是指低分子量化合物。例如，在特定实施方案中，这样的小分子化合物是显示出50道尔顿到800道尔顿之间的分子量的化合物。在可选实施方 案中，本文中描述的小分子表现出选自100道尔顿到500道尔顿之间和250道尔顿到475 道尔顿之间范围内的分子量。本文中使用的术语“对象”是指任何给药的靶。对象可以是脊椎动物例如哺乳动 物。因此，对象可以是人类。该术语不指定具体年龄或性别。因此，成年和新生对象以及胎 儿，不论是雄性还是雌性，都打算被涵盖。术语患者是指遭受病状的对象。术语患者包括人 类和兽医对象。“抑制”是指阻止、降低、失活或逆转活性、反应、状况、疾病或其他生物参数。抑制 可以包括但不限于完全消除活性、反应、状况或疾病。抑制还可以包括例如与天然水平相 比减慢或降低活性、反应、状况、疾病或其他生物参数，其中术语“天然水平”是指在不存在 抑制剂的情况下表现出的水平。抑制还可以包括例如与天然水平相比活性、反应、状况、疾 病或其他生物参数的逆转，其中术语“天然水平”是指在不存在抑制剂的情况下表现出的水 平。就此而言，降低可以是任何可测量到的降低。在具体实施方案中，降低可以是例如与天 然水平相比降低 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，或在具体列举 的百分率之间的任何量。“促进”是指活性、反应、状况、疾病或其他生物参数的保留、恢复或增加。促进可以 包括但不限于活性、反应、状况或生物参数的引发。或者，考虑到否则相关的活性、反应、状 况或其他生物参数将降解、降低或消除，促进可以包括活性、反应、状况或其他生物参数的 保留。促进还可以包括例如与天然或对照水平相比活性、反应、状况或生物参数的增加。在 具体实施方案中，活性、反应、状况或其他生物参数的增加可以是与天然或对照水平相比增 加 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或以上，包括在具体列举的百 分率之间的任何量的增加，其中术语“天然水平”是指在不存在促进剂的情况下表现出的水 平。术语“载体”是指当与化合物或组合物组合时，辅助或促进化合物或组合物的制 备、储存、给药、递送、有效性、选择性或其目标应用或目的的任何其他特点的化合物、组合 物、物质或结构。例如，载体可用于提供药物制剂，并可以进行选择以使活性药剂的任何降 解最小化，并使在对象中的任何不利副作用最小化。在本文中使用时，术语“治疗”是指治疗性益处，由其阻止、降低、中止、逆转或减缓 特定病状、疾病、病症、事件或伤害的有害效应或发展。治疗有效量是通过例如抑制或逆转与病状相关的活性、反应、情况、疾病或其他参 数来实现治疗性益处的化合物的量。治疗有效量可以是至少在一定程度上缓解对象中病状 的一种或多种症状、使与病状相关或是其病因的一种或多种生理或生化参数部分或完全恢 复正常、和/或降低病状发生的可能性的量。术语病理或病状是指可能作为疾病、状况、事件或受伤的结果而发生的与健康、正 常或有效状况的任何偏离。当在本文中使用时，术语蛋白或肽是指广义的多肽分子，并且不用于指称任何具 体尺寸、长度或分子量的多肽分子。蛋白变体和衍生物对于本领域技术人员来说是熟知的， 并可以包含氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰典型地属于三种类型中的一种或多种 取代、插入或缺失变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入一般是比氨基或羧基末端融合更小的插入，例如在1到4个残基的量级 上。免疫原性融合蛋白衍生物，例如在实施例中所描述的，是通过体外交联将足够大从而赋 予免疫原性的多肽与靶序列融合，或通过对用编码融合蛋白的DNA转化的重组细胞进行培 养来制造的。缺失的特征在于从蛋白序列中移除一个或多个氨基酸残基。典型情况下，在 蛋白分子中任一位点处缺失不超过约2到6个残基。这些变体一般通过在编码蛋白的DNA 中进行核苷酸的位点特异性突变从而产生编码变体的DNA，然后将DNA在重组细胞培养物 中表达来制备。用于在具有已知序列的DNA中特定位点处制造取代突变的技术是众所周知 的，例如M13引物致变和PCR致变。氨基酸取代典型是单残基的，但是可以一次发生在众多 不同位置处；插入通常在约1到10个氨基酸残基的量级上；缺失将在约1到30个残基的范 围内。缺失或插入优选邻近成对制造，即，缺失两个残基或插入两个残基。取代、缺失、插入 或其任何组合，可以进行组合以获得最终构建物。突变不可放置在阅读框外的序列中，并优 选不产生能够产生mRNA 二级结构的互补区。取代变体在本技术领域中是熟知的，其中已经 移除至少一个残基并在其位置中插入了不同残基。典型情况下，在取代变体形成中制造的 取代是本技术领域公知的保守取代，并且取代变体通常可以制造成改进多肽分子的一种或 多种特性，例如循环半衰期、稳定性等，并同时保留或增加多肽的生物活性。功能或免疫性质的显著改变，可以通过选择对维持(a)取代区域中多肽骨架的结 构例如片层或螺旋构型、(b)靶位点处分子的电荷或疏水性或(c)侧链的体积具有不同效 应的取代来制造。一般来说预计将在蛋白性质方面产生最大变化的取代，是其中发生下列 情况的取代(a)亲水性残基例如丝氨酸基或苏氨酸基取代(或被取代成)疏水残基例如 亮氨酸基、异亮氨酸基、苯丙氨酸基、缬氨酸基或丙氨酸基；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代(或 被取代成)任何其他残基；(c)具有正电性侧链的残基例如赖氨酸基、精氨酸基或组氨酸基 取代(或被取代成)负电性残基例如谷氨酸基或天冬氨酸基；或(d)具有大体积侧链的残 基例如苯丙氨酸取代(或被取代成)不具有侧链的残基例如这种情形下为甘氨酸，(e)通 过增加用于硫酸盐化和/或糖基化的位点数量。例如，将一个氨基酸残基用另一个生物和/或化学相似的氨基酸残基取代，被本 领域技术人员称为保守取代。例如，保守取代是用一个疏水残基取代另一个疏水残基，或用 一个极性残基取代另一个极性残基。取代包括组合，例如Gly，Ala ；Val, lie, Leu ；Asp,Glu ； Asn, Gln ；Ser, Thr ；Lys, Arg ；和Phe, Tyr。每个明确公开的序列的这种保守取代变异包括 在本文提供的多肽中。取代或缺失致变可用于插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr) 位点。半胱氨酸或其他不稳定残基的缺失也可能是需要的。缺失或取代潜在的蛋白水解位 点例如Arg，通过缺失一个碱性残基或用谷氨酰胺或组氨酸残基取代它来实现。在重组生产多肽的情形下，某些翻译后衍生作用是重组宿主细胞对表达的多肽 的作用的结果。谷氨酰胺和天冬酰胺残基通常在翻译后脱胺形成相应的谷氨酸残基和天 冬氨酸残基。或者，这些残基在温和的酸性条件下脱胺。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖 氨酸的羟化、丝氨酸残基或苏氨酸残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的 ο-氨基的甲基化(Τ. E. Creighton,《蛋白质结构与分子性质》(Proteins Structure and Molecular Properties), W. H. Freeman & Co.，San Francisco 79—86 页[1983]，在此引为 参考)、N-末端氨基的乙酰化以及某些情况下C-末端羧基的酰胺化。
应该理解，确定本文公开的多肽的衍生物、类似物和同源物的一种方式是通过确 定衍生物、类似物和同源物与具体已知序列的同源性/同一性。本领域技术人员容易理解 如何确定两个蛋白的同源性。例如，同源性可以在将两个序列进行比对以使同源性处于其 最高水平后进行计算。计算同源性的另一种方式可以通过已发表的算法来进行。用于比较的序列最优 化比对可以通过Smith和Waterman Adv. App 1. Math. 2 :482(1981)的局部同源性算法、 Needleman 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的同源性比对算法、Pearson 和 Lipman， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 :2444(1988)的相似性搜索方法，以及这些算法的计算机 化实施(Wisconsin 遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison，WI)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA)或 通过检查来进行。应该理解，存在大量可以掺入到本公开的多肽中的氨基酸和肽类似物。例如，存在 大量D-氨基酸或与表1中显示的氨基酸具有不同功能性取代基的氨基酸。已经公开了天 然存在的肽的反立体异构体以及肽类似物的立体异构体。通过为tRNA分子装上所选的氨 基酸和利用例如琥珀密码子以位点特异性方式将类似氨基酸插入到肽链中的遗传工程改 造的构建物，可以容易地将这些氨基酸掺入到多肽链中(Thorson等，Methods in Molec. Biol. 77 :43-73(1991) ；Zoller, Current Opinion in Biotechnology,3 :348-354(1992)； Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216(1995) ；Cahill 等， TIBS,14(10) :400-403(1989) ；Benner, TIB Tech, 12 :158-163(1994) ；Ibba 和 Hennecke, Bio/technology, 12 :678-682 (1994)，其全部在此引为参考)。D-氨基酸可用于产生更稳定的肽，因为D-氨基酸不被肽酶等识别。将共有序列的 一种或多种氨基酸用同样类型的D-氨基酸系统地取代(例如D-赖氨酸取代L-赖氨酸)， 可用于产生更稳定的肽。半胱氨酸可用于环化或将两个或多个肽连接在一起。这对于限制 肽成为特定构象可能是有益的(Rizo和Gierasch，Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992)，在此 引为参考)。当在本文中使用时，血管通透性是指小分子(例如离子、水、营养物)、大分子(例 如蛋白和核酸)或甚至整个细胞(通往炎症位点的淋巴细胞)通过血管壁的能力。II. R0B04信号传导途径Robo4信号传导抑制病理性血管形成和新生血管化的信号传导途径，描述在国际 公布号 WO 2009/129408、国际公布号 WO 2008/073441 和 Jones 等(CA. Jones 等，2008. Robo4通过抑制病理性血管形成和内皮渗透性过高使血管网络稳定(Robo4 stabilizes the vascular network by inhibiting pathologic angiogenesis and endothelial hyperpermeability) ,Nat Med 14:448-453)中。正如在这些参考文献中所述，Robo4的表 达产生了对Slit2的响应性，并且Slit2-Robo4信号传导对细胞粘附刺激的细胞侵入活性 具有负调控作用。这种负调控由Robo4与连接物蛋白桩蛋白及其旁系同源物的相互作用所 介导，所述相互作用召集ARF-GAP例如GITl，导致ADP核糖基化因子6 (ARF6)的局部失活。 由此该信号传导途径(在图10中显示)干扰了粘附介导的Racl活化和细胞侵入。图10 中所描述的信号传导途径提出了用于调节Robo-4信号产道途径的多个靶，并且Jones等、 国际公布号WO 2009/129408和国际公布号W02008/073441进一步描述了参与Robo4信号传导途径的ARF-GAP和ARF-GEF的调节，可以不需要Slit/Robo4信号传导来实现。Jones 等、国际公布号WO 2009/129408和国际公布号WO 2008/073441，其每个的内容在此引为参考。Robo4信号传导在多种不同炎症介导物存在的情况下起到保护血管完整性的作 用。例如，Robo-4信号传导途径可用于在内毒素(例如脂多糖或“LPS”)、肿瘤坏死因子 (例如TNF-α )和白介素-1 β ("IL-1 β ”)的存在下保护血管完整性，这些物质每个都是已 知的炎症介导物(Dinarello，CA. 1997.脓毒性休克病理发生中作为介导物的前炎性和抗 It生:导· (Proinflammatory and antiinflammatory cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock) ,Chest 112 :321S_3^S)。此外，Robo-4 信号传导途径在 多种不同组织中，例如在肺脏、肾脏和脾脏中起到保护内皮屏障功能的作用。此外，Robo4信 号传导途径不仅在与急性炎症反应相关的病症中起到保护血管完整性的作用，而且Robo-4 信号传导途径可用于在急性和慢性肺部炎症的模型中在体内保护内皮屏障功能。II.活性药剂和组合物本文描述的活性药剂和组合物用于促进血管屏障功能。在每个实施方案中，本文 描述的组合物包括至少一种能够促进血管屏障功能的活性药剂，并且在一个这样的实施方 案中，本文描述的组合物包含促进血管内皮屏障功能的活性药剂。在另一个实施方案中，本 文描述的组合物包括在选自肺脏的血管内皮、肾脏的血管内皮和脾脏的血管内皮之一的内 皮组织中促进血管屏障功能的活性药剂。在另一个实施方案中，本文描述的组合物包括抑 制与导致急性肺部炎症的病症以及与慢性肺部炎症相关的病症例如肺纤维化的发生与发 展相关的血管通透性的活性药剂。正如本文提供的实验例所说明的，在特定实施方案中，本 文描述的活性药剂甚至在多种炎症和血管通透性的介导物、例如内毒素(例如LPQ、肿瘤 坏死因子(例如TNF- α )和IL-I β的存在下，也促进血管屏障功能。在具体实施方案中，本文描述的活性药剂和组合物适用于治疗患有病理症状例如 肺纤维化以及其他与急性肺部血管炎症相关的病症的个体。在一个这样的实施方案中，本 文描述的组合物包括抑制一种或多种与肺纤维化包括特发性肺纤维化的发生或发展相关 的急性肺部血管水肿、急性肺部血管炎症和慢性肺部血管炎症的活性药剂。在另一个这样 的实施方案中，本文描述的组合物包括在暴露于微生物内毒素或患有流感感染例如禽流感 感染的动物、包括人类中，促进血管屏障功能的活性药剂。在其他实施方案中，本文描述的 组合物包括促进血管屏障功能和抑制与病状例如细菌脓毒症或流感感染例如禽流感感染 相关的血管通透性的活性药剂。在血管内皮中，关键性的稳定化相互作用受粘着连接蛋白，血管内皮钙粘着蛋 白(VE-钙粘着蛋白)的调节(Dejana，Ε.，F. Orsenigo 和 M. G. Lampugnani. 2008.粘着 连接和VE-钙粘着蛋白在血管通透性控制中的作用(The role of adherens junctions and VE-cadherin in the control of vascular permeability), J Cell Sci 121 2115-2122 ；Vestweber, D. 2008. VE-钙粘着蛋白控制细胞连接和血管形成的主要内皮 粘附分子(VE-cadherin :the major endothelial adhesion molecule controlling cellular junctions and blood vessel formation), Arterioscler Thromb Vasc Biol 28 :223-232). VE-钙粘着蛋白的表面表达受到pl20_连环蛋白与VE-钙粘着蛋白的结合 的调控，并且已知P120-连环蛋白与VE-钙粘着蛋白的结合抑制VE-钙粘着蛋白从细胞表面内化并促进血管稳定性(Potter，Μ. D.，S. Barbero和D. A. Cheresh. 2005. VE-钙粘着 蛋白的酪氨酸磷酸化阻止P120-和β-连环蛋白的结合并维持细胞间质状态(Tyrosine phosphorylation of VE-cadherin prevents binding of pl20-and beta-catenin and maintains the cellular mesenchymal state. J Biol Chem 280 :31906-31912 ； Xiao, K. , J. Garner, K. M. Buckley, P. A. Vincent, C. M. Chiasson, E. Dejana, V. Faundez 和A. P. Kowalczyk. 2005. pl20_连环蛋白调控VE-钙粘着蛋白的网格蛋白依赖性胞吞作 用(pl20-catenin regulates clathrin-dependent endocytosis of VE-cadherin)， Mol Biol Cell 16 :5141-5151)。在具体实施方案中，本文描述的活性药剂促进VE-钙粘着蛋 白在细胞表面连接处的出现。在一个这样的实施方案中，本发明的活性药剂促进细胞表面 P120-连环蛋白的表达。不受具体理论的限制，目前相信在促进细胞表面P120-连环蛋白 的表达中，这样的实施方案保护了 VE-钙粘着蛋白与pl20-连环蛋白之间的结合，从而通过 减少例如否则在一种或多种炎症介导物(例如一种或多种细胞因子)的存在下可能发生的 VE-钙粘着蛋白的胞吞作用，来促进血管完整性。因此，在特定实施方案中，本文描述的活性 药剂通过促进VE-钙粘着蛋白在内皮细胞例如血管内皮细胞表面的出现和促进pl20-连环 蛋白在内皮细胞例如血管内皮细胞表面的表达之一或二者，在包括人类的动物中促进血管 屏障功能。本文描述的活性药剂可以包括Slit多肽，例如Slit2多肽。当讨论本文所考虑的 Slit2多肽时，全长Slit2蛋白以及全长Slit2蛋白的衍生物、类似物和同源物都考虑到了， 只要该多肽在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPQ、肿瘤坏死因子 (例如TNF-α )和IL-I β存在下促进内皮屏障功能，并在一种或多种炎症介导物、包括一种 或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下抑制血管渗漏、 促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现或促进ρ120-连环蛋白在血管内皮细胞表 面的表达即可。衍生多肽分子是指从天然化合物直接或通过修饰或部分取代形成的多肽。 同源多肽分子是指源自于不同物种的特定基因的多肽产物。类似多肽分子是结构上相似但 不一致，与参比多肽序列中包含的氨基酸在数量和性质方面有差异的多肽。例如，给定多肽 的类似物将表现出一定水平的序列同源性，但是可以包含一个或多个氨基酸取代或缺失。在具体实施方案中，当活性药剂是Slit2多肽时，活性药剂可以选自哺乳动物 Slit2多肽，例如人类Slit2多肽。当活性药剂是哺乳动物Slit2时，活性药剂可以选自已 知的、全长的、天然存在的哺乳动物Slit2多肽，诸如例如SEQ ID NO 1所显示的Slit2多 肽，及其能够执行下列一种或多种功能的衍生物、类似物和同源物在一种或多种炎症介导 物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下促进 内皮屏障功能；在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因 子(例如TNF-α )和IL-I β存在下抑制血管渗漏；促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表 面的出现；以及促进Ρ120-连环蛋白在血管内皮细胞表面的表达。正如将被容易地认识到 的，可以根据本技术领域已知的技术分离和纯化天然存在的Slit2多肽(Wang，KH等，1999. 作为感觉轴突延长和分支的正调控物的哺乳动物slit蛋白的生物化学纯化(Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching.), Cell Mar 19 ；96 (6) :771-84 ;Chedotal，A. 2007. Slit 及其
(Slits and their receptors), Adv Exp Med Biol 621 :65_80)。
除了天然存在的Slit2多肽之外，本文所考虑的Slit2活性药剂可以通过本技术 领域公知的重组或合成生产技术来获得。此外，活性药剂可以选自天然存在的、重组或合成 的哺乳动物Slit2多肽的衍生物、类似物或同系物。在具体实施方案中，Slit2活性药剂可 以选自天然存在的Slit2蛋白的片段，例如由SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所显示的片段， 及其能够执行下列一种或多种功能的衍生物、类似物和同源物在一种或多种炎症介导物、 包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF- α )和IL-I β存在下促进内 皮屏障功能；在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子 (例如TNF-α)和IL-I β存在下抑制血管渗漏；促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面 的出现；以及促进Ρ120-连环蛋白在血管内皮细胞表面的表达。在其他实施方案中，可以使用由SEQ ID NO :4到SEQ ID NO :12所显示的Slit2 多肽作为活性药剂。具体来说，本文描述的活性药剂可以选自Slit2N(SEQ ID NO 4)、SEQ ID NO :5 所显示的 Slit2 多肽、Slit2AP(SEQ ID N0:6)、Slit2 Dl (SEQ ID N0:7)、Slit2 D1-D2(SEQ ID N0:8)、Slit2 D1_D3(SEQ ID N0:9)、Slit2 D1_D4(SEQ ID N0:10)、Slit2 D1-E5(SEQ ID NO :11)和Slit2 D1_E6(SEQ ID NO : 12)，及其能够执行下列一种或多种功 能的衍生物、类似物和同源物在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如 LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下促进内皮屏障功能；在一种或多种炎 症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存 在下抑制血管渗漏；促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现；以及促进ρ120-连 环蛋白在血管内皮细胞表面的表达。在其他实施方案中，当活性药剂选自本文描述的Slit2多肽之一的衍生物、类似 物或同源物时，活性药剂可以选自天然存在的哺乳动物Slit2多肽或由SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4到SEQ ID NO 12所描述的Slit2多肽之一的衍生物、类似物或同 源物，其中这样的活性药剂与相关的天然存在的哺乳动物Slit2多肽或SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2 禾口 SEQ ID NO :4 至IjSEQ ID NO 12 的任一个，显示出至少约 80%、81 %、82%、83%、 84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99%或以上的多肽序列同源性。在每个这样的实施方案中，选择的衍生物、类似物或同源物 具有下列一种或多种能力在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、 肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下促进内皮屏障功能；在一种或多种炎症介导 物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下抑 制血管渗漏；促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现；以及促进ρ120-连环蛋白 在血管内皮细胞表面的表达。在另一个实施方案中，活性药剂是天然存在的哺乳动物Slit2多肽或由SEQ ID NO =USEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4到SEQ ID NO 12所描述的Slit2多肽之一的衍生物、类 似物或同源物，还表现出与其所源自的多肽较低的多肽序列同源性，例如选自80%或以下、 70%或以下、60%或以下或50%或以下之一的同源性，同时保留下列一种或多种能力在 一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α) 和IL-I β存在下促进内皮屏障功能；在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素 (例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下抑制血管渗漏；促进VE-钙粘着 蛋白在血管内皮细胞表面的出现；以及促进Ρ120-连环蛋白在血管内皮细胞表面的表达。
在一个实施方案中，本文描述的活性药剂是Robo4受体的配体。在这样的实施方 案中，Robo4的配体可以是任何通过Robo4起作用以促进血管屏障功能的分子。在本文中 使用时，表述“通过…起作用”是指配体对需要Robo4受体存在的内皮细胞有效应。在一个 实施方案中，对内皮细胞有效应的配体可以通过以引起Robo4信号传导的方式与Robo4受 体结合或联合而通过Robo4起作用。不受具体理论的限制，目前相信本文描述的Slit2多 肽通过Robo4受体起作用。因此，在本文描述的活性药剂是Robo4受体的配体的具体实施 方案中，活性药剂可以选自本文描述Slit多肽。在另一个这样的实施方案中，Robo4的配 体可以是任何通过Robo4起作用以促进VE-钙粘着蛋白在细胞表面连接处出现的分子。在 具体实施方案中，Slit配体或其片段或变体，以产生下列一种或多种效应的方式与Robo4 结合或联合在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPQ、肿瘤坏死因子 (例如TNF-α )和IL-I β存在下促进内皮屏障功能；在一种或多种炎症介导物、包括一种 或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下抑制血管渗漏； 促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现；以及促进ρ120-连环蛋白在血管内皮细 胞表面的表达。在另一个实施方案中，本文描述的活性药剂可以是Robo4的配体，其中配体通过 Robo4起作用以促进pl20-连环蛋白的细胞表面表达。在其他实施方案中，本文描述的活性 药剂包括Robo4受体的配体，其中配体通过Robo4起作用以起始GITl的桩蛋白活化。在另 一个实施方案中，本文描述的活性药剂包括Robo4受体的配体，其中配体通过Robo4起作用 以活化GITl对ARF6的抑制。在其他实施方案中，本文描述的活性药剂包括Robo4受体的 配体，其中配体以引起下列一种或多种效应的方式通过Robo4起作用在一种或多种炎症 介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在 下促进内皮屏障功能；在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤 坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下抑制血管渗漏；促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮 细胞表面的出现；以及促进Ρ120-连环蛋白在血管内皮细胞表面的表达。当本发明的活性 药剂包括Robo4的配体时，在具体实施方案中，配体可以是与Robo4的细胞外结构域结合弓I 起Robo4信号传导的分子。所需结构的多肽可以使用本技术领域公知的方法和材料进行生产。例如，各种 用于分离天然存在的多肽或生产重组多肽的方法是众所周知的。此外，用于合成生产所 需序列的多肽的各种方法是已知的。例如，可以使用目前可以获得的实验室设备，使用 Fmoc (9-芴基甲氧羰基)或Boc (叔丁氧基羰基)化学来化学合成肽(Applied Biosystems, Inc.，Foster City, CA)。本文描述的Slit多肽可以通过本领域技术人员熟知的重组和 合成技术来获得，包括在本文中以及例如在国际公布号WO 2009/129408和国际公布号WO 2008/073441中描述的方法来获得。本领域技术人员可以容易地认识到，对应于所需蛋白的肽可以通过标准化学反应 来合成。例如，肽可以被合成并不从其合成树脂上切下，而蛋白的另一个片段可以被合成然 后从树脂上切下，由此暴露出在另一个片段上被功能性阻断的末端基团。通过肽缩合反应， 可以将这两个片段通过肽键分别在它们的羧基和氨基末端处共价相连，以形成抗体或其片 段(Grant GA (1992)《合成肽用户指南》(Synthetic Peptides :A User Guide), W. H. Freeman and Co.，N. Y. (1992) ；Bodansky M 和 Trost B.主编，(1993)《肽合成原理》(Principlesof Peptide Synthesis), Springer-Verlag Inc.，NY (其在此至少以其与肽合成相关的材 料引为参考))。或者，所需蛋白或肽可以使用标准的重组技术在体内合成。当将要连接 在一起形成所需蛋白的独立的肽在体内独立进行生产时，一旦这些独立的肽被产生并分离 后，可以通过类似的肽缩合反应将它们连接以形成所需蛋白或其片段。例如，克隆或合成的肽区段的酶法连接允许将相对短的肽片段相连，以产生较大 的肽片段、多肽或整个蛋白结构域(Abrahmsen L等，Biochemistry，30 :4151 (1991))。或 者，可以利用合成肽的天然化学连接从较短的肽片段合成地构建大的肽或多肽。该方法由 两步化学反应构成(Dawson等，通过天然化学连接合成蛋白(Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation)，Science, 266 :776-779 (1994))。第一步是将未保护的合成 肽-硫酯与另一种含有氨基末端Cys残基的未保护的肽区段进行化学选择性反应，以产生 硫酯连接的中间体作为起始共价产物。不改变反应的条件，该中间体经历自发、快速的分 子内反应，在连接位点处形成天然肽键(Baggiolini M等，(1992)FEBS Lett. 307 :97-101 ； Clark-Lewis I 等，J. Biol. Chem. , 269 16075 (1994) ；Clark-Lewis I 等，Biochemistry, 30 :3128(1991) ；Rajarathnam K^, Biochemistry 33:6623—30(1994))。或者，将未保护的肽区段化学连接，其中肽区段之间形成的键作为化学连接的结 果是非天然的(非肽)键(Schnolzer, M等，Science，256 :221 (1992))。这种技术已被用 于合成蛋白结构域的类似物以及大量具有完全生物活性的相对纯的蛋白(deLisle Milton RC 等，《蛋白质化学技术 IV》(Techniques in Protein Chemistry IV), Academic Press, New York,pp.257-267(1992))。在另一个实施方案中，本文描述的活性药剂可以是小分子活性药剂，其抑制选自 胞粘蛋白的ARNO家族的胞粘蛋白的活性。选自以导致一种或多种ARF、例如ARF6和ARFl 的抑制的方式抑制ARF-GEF，例如胞粘蛋白、选自胞粘蛋白的ARNO家族的胞粘蛋白或ARNO 的可利用性、活化或活性的化合物的小分子活性药剂，描述在Jones等、国际申请公布号WO 2009/U9408和国际申请公布号WO 2008/073441中。在本文描述的组合物和方法的情形 下，已经确定，以导致一种或多种ARF、例如ARF6和ARFl的抑制的方式抑制ARF-GEF、例如 胞粘蛋白、选自胞粘蛋白的ARNO家族的胞粘蛋白或ARNO的可利用性、活化或活性的小分子 活性药剂，能够抑制肺部血管通透性和/或炎症以及可能由此发生的肺纤维化。在具体实施方案中，本文描述的小分子活性药剂以导致下列一种或多种效应的方 式抑制选自胞粘蛋白的ARNO家族的胞粘蛋白的活性抑制ARF6的活性或可利用性；抑制 ARFl的活性或可利用性；在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿 瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下促进内皮屏障功能；在一种或多种炎症介导 物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下抑 制血管渗漏；促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现；以及促进ρ120-连环蛋白 在血管内皮细胞表面的表达。在另一个实施方案中，小分子活性药剂以导致下列一种或多 种效应的方式抑制ARNO的活性抑制ARF6 ；保护血管内皮屏障功能；在一种或多种炎症介 导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下 促进内皮屏障功能；在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏 死因子(例如1顺-叫和11^-13存在下抑制血管渗漏；促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细 胞表面的出现；以及促进P120-连环蛋白在血管内皮细胞表面的表达。在另一个实施方案中，小分子活性药剂抑制ARF6的活性或可利用性，导致下列一种或多种效应保护血管内 皮屏障功能；在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子 (例如TNF-α )和IL-I β存在下促进内皮屏障功能；在一种或多种炎症介导物、包括一种 或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下抑制血管渗漏； 促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现；以及促进ρ120-连环蛋白在血管内皮细 胞表面的表达。在具体实施方案中，本文描述的活性药剂可以是％(^11!13，其结构提供在图9中。 SecinH3是胞粘蛋白的抑制剂(参见例如Hafner等，通过SeCinH3抑制胞粘蛋白导致肝 脏姨岛素抗性(Inhibition of cytohesins by SecinH3 leads to hepatic insulin resistance), Nature (2006)，444，941-944，以及国际专利申请公布号 WO 2006/053903，二 者的内容在此引为参考)。已经发现，SeCin-H3抑制炎症介导物的效应和血管通透性。因 此，在一个实施方案中，SeCinH3可以被选做以导致选自ARF6和ARFl的ARF的抑制的方式 抑制选自胞粘蛋白的ARNO家族的胞粘蛋白的活性的小分子活性药剂，并提供一种或多种 下列效应在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPQ、肿瘤坏死因子 (例如TNF-α )和IL-I β存在下促进内皮屏障功能；在一种或多种炎症介导物、包括一种 或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α )和IL-I β存在下抑制血管渗漏； 促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现；以及促进ρ120-连环蛋白在血管内皮细 胞表面的表达。在另一个实施方案中，本文描述的组合物包括一种或多种小分子活性药剂，其选 自以导致下列一种或多种效应的方式抑制ARF-GEF、例如胞粘蛋白、选自胞粘蛋白的ARNO 家族的胞粘蛋白或ARNO的可利用性、活化或活性抑制ARF6的活性或可利用性；抑制ARFl 的活性或可利用性；保护血管内皮屏障功能；在一种或多种炎症介导物、包括一种或多种 内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF- α )和IL-I β存在下促进内皮屏障功能；在 一种或多种炎症介导物、包括一种或多种内毒素(例如LPS)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α) 和IL-Ιβ存在下抑制血管渗漏；促进VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现；以及促 进Ρ120-连环蛋白在血管内皮细胞表面的表达。当本文描述的活性药剂包括小分子活性药剂时，在具体实施方案中，活性药剂可 以包括一种或多种具有下列化学式(式1)的化合物或其可药用盐、溶剂化物或水合物
权利要求
1.一种促进对象中血管屏障功能的方法，所述方法包含向对象给药治疗有效量的至少一种Slit多肽，其中给药所述至少一种Slit多肽引起 内皮屏障功能的促进。
2.权利要求1的方法，其中至少一种Slit多肽是Robo4的配体。
3.权利要求1或2的方法，其中至少一种Slit多肽是至少一种Slit2多肽。
4.权利要求3的方法，其中至少一种Slit2多肽是Slit2N(SEQID NO 4)。
5.权利要求1或2的方法，其中至少一种Slit多肽包含至少下列之一的多肽序列SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12，及其组 合、衍生物、同源物和类似物。
6.前述权利要求任一项的方法，其中血管屏障功能的促进在至少一种炎症介导物的存 在下发生，所述介导物选自脂多糖、TNF-α、IL_li3及其组合。
7.前述权利要求任一项的方法，其中内皮屏障功能的促进包含促进血管内皮钙粘着蛋 白(VE-钙粘着蛋白)在血管内皮细胞表面的出现和促进pl20-连环蛋白在血管内皮细胞 表面的表达中的至少一种。
8.一种促进对象中血管屏障功能的方法，所述方法包含向对象给药治疗有效量的至 少一种ARF GTP交换因子(ARF-GEF)的至少一种抑制剂，其中调节至少一种ARF-GEF导致 对象中血管通透性的抑制。
9.权利要求8的方法，其中抑制至少一种ARF-GEF导致至少一种ADP核糖基化因子 (ARF)的抑制。
10.权利要求9的方法，其中至少一种ARF选自ARF6、ARFl及其组合。
11.权利要求8到10任一项的方法，其中至少一种抑制剂是小分子化合物，所述小分 子化合物抑制至少一种ARF-GEF的可利用性、至少一种ARF-GEF的活化和至少一种ARF-GEF 的活性中的至少一种。
12.权利要求8到11任一项的方法，其中至少一种ARF-GEF的至少一种抑制剂包含 SecinH3。
13.权利要求8到10任一项的方法，其中至少一种ARF-GEF的至少一种抑制剂包含式 1的化合物和式2的化合物中的至少一种。
14.权利要求8到10任一项的方法，其中至少一种ARF-GEF的至少一种抑制剂选自下 列之一
15.权利要求8到14任一项的方法，其中至少一种ARF-GEF的至少一种抑制剂抑制选 自胞粘蛋白的ARNO家族的胞粘蛋白。
16.权利要求15的方法，其中胞粘蛋白是ARN0。
17.权利要求8到16任一项的方法，其中对象中血管通透性的抑制在至少一种炎症介 导物的存在下发生，所述炎症介导物选自脂多糖、TNF-a、IL_li3及其组合。
18.权利要求8到17任一项的方法，其中对象中血管通透性的抑制包含促进VE-钙粘 着蛋白在血管内皮细胞表面的出现和促进P120-连环蛋白在血管内皮细胞表面的表达中 的至少一种。
19.一种促进对象中VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现的方法，所述方法包含向对象给药治疗有效量的至少一种Slit多肽；其中向对象给药至少一种Slit多肽促 进了对象中VE-钙粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现。
20.权利要求19的方法，其中至少一种Slit多肽选自至少下列之一SEQID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:8、EQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO : 12，及其组合、衍生物、同源 物和类似物。
21.权利要求19或权利要求20的方法，其中促进对象中VE-钙粘着蛋白在血管内皮 细胞表面的出现，在至少一种炎症介导物的存在下发生，所述介导物选自脂多糖、TNF-a、 IL-I β及其组合。
22.权利要求19或权利要求20的方法，其中给药至少一种Slit多肽促进pl20-连环 蛋白在血管内皮细胞表面的表达。
23.一种治疗患有肺部血管炎症的对象的方法，所述方法包含向对象给药治疗有效量的至少一种Slit多肽，其中给药至少一种Slit多肽引起对象 中肺部血管炎症的减轻。
24.权利要求23的方法，其中至少一种Slit多肽是至少一种Slit2多肽。
25.权利要求24的方法，其中至少一种Slit2多肽是Slit2N(SEQID NO 4)。
26.权利要求23或权利要求M的方法，其中至少一种Slit多肽包含至少下列之一的 多月太序列SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12，及其组合、衍生物、同源物和类似物。
27.权利要求23到沈任一项的方法，其中血管炎症的减轻在至少一种炎症介导物的存 在下发生，所述介导物选自脂多糖、TNF-α、IL_li3及其组合。
28.权利要求23到27任一项的方法，其中给药至少一种Slit多肽促进了对象中VE-钙 粘着蛋白在血管内皮细胞表面的出现。
29.权利要求23到28任一项的方法，其中给药至少一种Slit多肽促进了对象中 P120-连环蛋白在血管内皮细胞表面的表达。
30.权利要求23到四任一项的方法，其中治疗血管炎症还包含促进对象中pl20-连环 蛋白在血管内皮细胞表面的表达。
31.一种降低与任何急性肺部血管水肿、慢性肺部血管水肿、急性肺部血管炎症、慢性 肺部血管炎症、肺纤维化包括特发性肺纤维化、细菌脓毒症或流感感染相关的血管通透性 的方法，所述方法包含向对象给药治疗有效量的至少一种Slit多肽，其中给药至少一种Slit多肽降低了对 象中与病状相关的血管通透性。
32.权利要求31的方法，其中病状是肺纤维化，包括特发性肺纤维化。
33.权利要求31或权利要求32的方法，其中至少一种Slit多肽在至少一种炎症介导 物的存在下向对象给药，所述介导物选自脂多糖、TNF-α、IL_li3及其组合。
34.权利要求31到33任一项的方法，其中给药至少一种Slit多肽促进了VE-钙粘着 蛋白在血管内皮细胞表面的出现。
35.一种治疗患有肺纤维化的对象的方法，所述方法包含向对象给药治疗有效量的化合物，所述化合物选自式1的化合物和式2的化合物。
36.权利要求35的方法，其包含向对象给药治疗有效量的kcinH3及其可药用盐、溶剂 化物或水合物。
37.权利要求35的方法，其包含向对象给药治疗有效量的选自下列之一的化合物
38.一种抑制对象中肺纤维化发生的方法，所述方法包含向对象给药治疗有效量的化合物，所述化合物选自式1的化合物和式2的化合物。
39.权利要求38的方法，其包含向对象给药治疗有效量的SeCinH3及其可药用盐、溶剂 化物或水合物。
40.权利要求38的方法，其包含向对象给药治疗有效量的选自下列之一的化合物
41.一种治疗患有肺纤维化的对象的方法，所述方法包含向对象给药治疗有效量的Slit多肽。
42.权利要求41的方法，其包含向对象给药治疗有效量的Slit2多肽。
43.权利要求42的方法，其中Slit2多肽是Slit2N(SEQID NO :4)。
44.权利要求41或权利要求42的方法，其中Slit多肽选自由SEQID NO :1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO: 8,SEQ ID N0:9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO : 12 所显示的多肽，及其组合、衍 生物、同源物和类似物之一。
45.一种抑制对象中肺纤维化的发生的方法，所述方法包含向对象给药治疗有效量的Slit多肽。
46.权利要求45的方法，其包含向对象给药治疗有效量的Slit2多肽。
47.权利要求45或权利要求46的方法，其中Slit多肽选自由SEQIDNO =USEQ ID NO: 2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12 所显示的多肽，及其组合、衍生 物、同源物和类似物之一。
全文摘要
本文描述了促进屏障功能或抑制与肺部炎症相关的血管内皮通透性的活性药剂和组合物。
文档编号A61K38/00GK102083452SQ200980125675
公开日2011年6月1日 申请日期2009年12月11日 优先权日2008年12月12日
发明者尼亚尔·隆东, 朱伟铨, 狄恩·Y·李 申请人:犹他大学研究基金会