专利名称：包含tb10.4的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明公开了 一种具有低剂量抗原的人用疫苗，包含佐剂中的融合于抗原85-复 合体(如Ag85B)的多肽的TB10. 4 ；以及结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的 免疫和治疗方法。
背景技术：
全世界正致力于开发出比当前使用的卡介苗(BCG)疫苗更有效的结核分枝杆菌 疫苗，这包括不同的策略，例如活的减毒疫苗(9)、病毒载体化的结核分枝杆菌疫苗(11)和 亚单位疫苗(12，14)。亚单位疫苗方法拥有诸多优点，例如，安全性和稳定性增加，以及经证 实的加强之前的BCG接种的能力(4，7)。另外，由于亚单位疫苗似乎不受环境中分枝杆菌的 影响，因此这类疫苗可能在发展中国家中特别有用(3)。然而，该领域的进展已因缺乏引起 细胞介导的强免疫(CMI)应答的佐剂而被延误。因此，仍然需要能形成多功能免疫细胞从 而提供更强的抵御结核分枝杆菌的保护作用的免疫原性组合物。
发明内容
本研究检查了作为抵御结核分枝杆菌感染的新疫苗的Ag85B-TB10.4(HyVaC 4) 和IC31 佐剂的结合物。结果显示，Ag85B-TB10. 4和IC31 佐剂诱导了大量的多功能 ⑶4+T细胞，并提供了抵御结核分枝杆菌的显著保护作用。令人意外地是，Ag85B-TB10. 4 抗原和IC31 佐剂的结合物对抗原剂量敏感。因此，尽管在小鼠中的标准剂量5. 0 μ g IC31 中的Ag85B-TB10. 4不会引起抵御结核分枝杆菌的保护作用，但是0. 5μ gIC31⑧中 的Ag85B-TB10. 4却诱发了与BCG相当的保护作用。
具体实施例方式本发明公开了一种人用免疫原性组合物，包含TB10. 4蛋白和Ag85_复合蛋白，所 述TB10. 4蛋白和Ag85-复合蛋白任选地可融合在一起或作为分开的蛋白提供，其中蛋白总 量少于约25. 0 μ g、优选地少于10. 0 μ g或者等于约0. 5 μ g/抗原剂量。所公开的免疫原性组合物可以额外地包含佐剂。本发明的优选佐剂具有至少一种 聚阳离子肽和至少一种寡核苷酸，优选地，所述寡核苷酸为TLR9激动剂。本发明的优选佐剂为IC31 ，并且Ag85_复合体的优选蛋白为Ag85B蛋白。本发明公开了 一种人用疫苗，包含上述免疫原性组合物。本发明还公开了一种在人中诱导抵御结核分枝杆菌的保护作用的方法，所述方法 包括将一种如上所述的免疫原性组合物引入该人中。本研究检查了作为抵御结核分枝杆菌感染的新疫苗的Ag85B-TB10.4(HyVaC 4) 融合蛋白和IC31 的结合物。IC31 佐剂包含阳离子肽和TLR9受体激动剂。在形成抵御结核分枝杆菌感染的有效疫苗的尝试中，Ag85B-TB10. 4融合蛋白和 IC31 的结合物因以下原因而具有吸引力
(1) IC31⑧可促进强Thl应答；(2)IC31 在临床试验中具有前景光明的特点；已经在临床1期试验中结合三价 流感疫苗以及结合结核病疫苗对它进行了成功测试(50 μ g IC31 中的Ag85B-ESAT-6 ；临 床数据尚未公布)。用IC31 中的Ag85B-ESAT6进行的动物研究记载于(1)；(3)Ag85B_TB10.4融合蛋白具有的优点是它不含可用于诊断目的的任何蛋白 例如ESAT-6。ESAT-6是一种极有价值的诊断试剂，并且是诸多商业化诊断测试的基础 (5，10，13)。将ESAT-6排除在日后的疫苗之外将使得诊断测试和疫苗可平行使用，因为 Ag85B-TB10. 4融合蛋白不会影响任何具体的诊断测试；(4)由于Ag85B和TB10. 4两者均由BCG表达，因此本发明的疫苗还可用作BCG的 加强疫苗。结果表明，Ag85B-TB10. 4和IC31 的结合物诱导了大量的多功能⑶4+T细胞，并 提供了抵御结核分枝杆菌的显著保护作用。令人意外地，Ag85B-TB10.4融合蛋白和IC31 佐剂的结合物对抗原剂量极为敏感。因此，尽管剂量为5. 0μ g的IC31 中的Ag85B-TB10. 4 不会引起抵御结核分枝杆菌的显著保护作用，但是0. 5 μ g的IC31 中的Ag85B-TB10. 4却 诱发了与BCG相当的强保护作用(实施例3和图4)。相比之下，之前用其他抗原例如在 MPL-DDA中的Ag85B-ESAT6的研究显示，该融合蛋白的最佳抗原剂量为大约10. 0 μ g(16)， 并且剂量为5μ g的MPL-DDA中的Ag85B-TB10. 4提供了与BCG相当的显著保护(8)，表明 Ag85B-TB10. 4是一种不寻常的免疫原性分子。这是证明IC31 佐剂中的Ag85B_TB10.4融合蛋白形成抵御结核分枝杆菌感染的 有效疫苗的首份研究。在整篇说明书中，除非上下文另有要求，否则措辞“包含”或其变化形式例如“含 有”或者“包括”将被理解为意味着包括所述要素、整数、要素组或整数组，但是并不排除任 何其他要素、整数、要素组或整数组。抗原本发明的抗原可以包含融合于TB10. 4蛋白的Ag85_复合体的蛋白，包括例如 Ag85-复合体的蛋白 Ag85A、Ag85B 或 Ag85C。Ag85B-TB10. 4是一种不寻常的免疫原性分子，该分子必须以低剂量给予，以引发 最大量的多功能免疫细胞，诱导更多的干扰素-Y表达和增加的抵御结核分枝杆菌的保护 作用。在本说明书中，Ag85B-TB10. 4融合蛋白与术语H4和HyVac4可互换。在另一个实施方案中，抗原可包含Ag85复合体的蛋白和TB10. 4蛋白，其中所述 Ag85复合蛋白没有融合于所述TB10. 4蛋白。优选的所述Ag85复合体的蛋白为Ag85B。
权利要求
1.一种人用免疫原性组合物，包含 TB10. 4蛋白和Ag85-复合蛋白，其中所述TB10. 4蛋白和所述Ag85-复合蛋白的总量少于约25. 0 μ g。
2.权利要求1的免疫原性组合物，其中所述TB10.4蛋白和所述Ag85-复合蛋白以融合 蛋白的形式存在。
3.权利要求1或2的免疫原性组合物，还包含佐剂。
4.权利要求3的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含 至少一种聚阳离子肽，和至少一种寡核苷酸。
5.权利要求1-4任一项的免疫原性组合物，其中所述Ag85-复合蛋白为Ag85B蛋白。
6.权利要求1-5任一项的免疫原性组合物，其中所述融合蛋白的存在量少于约 10. 0μ g。
7.权利要求6的免疫原性组合物，其中所述融合蛋白的存在量等于约0.5μ g。
8.权利要求4的免疫原性组合物，其中所述至少一种寡核苷酸为TLR9激动剂。
9.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述佐剂为肽NH2-KLKLLLLLKLK-C00H和寡核苷 酸 5' -ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC-3'的混合物。
10.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述佐剂为IC31⑧。
11.一种人用疫苗，包含 TB10. 4蛋白和Ag85-复合蛋白包含至少一种聚阳离子肽和至少一种寡核苷酸的佐剂， 其中所述TB10. 4蛋白和所述Ag85-复合蛋白的总量少于约25. 0 μ g。
12.权利要求10的疫苗，其中所述TB10.4蛋白和所述Ag85-复合蛋白以融合蛋白的形式存在。
13.权利要求10-11任一项的疫苗，还包含佐剂。
14.权利要求12的疫苗，其中所述佐剂包含 至少一种聚阳离子肽，和至少一种寡核苷酸。
15.权利要求10-13任一项的疫苗，其中所述Ag85-复合蛋白为Ag85B蛋白。
16.权利要求10-14任一项的疫苗，其中TB10.4蛋白和所述Ag85-复合蛋白的总量少 于约 10. 0 μ g。
17.权利要求15的疫苗，其中TB10.4蛋白和所述Ag85-复合蛋白的总量等于约 0. 5 μ g。
18.权利要求13的疫苗，其中所述至少一种寡核苷酸为TLR9激动剂。
19.权利要求14的疫苗，其中所述佐剂为肽nh2-klklllllklk-cooh(seqID NO:)和寡 核苷酸 5' -ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC-3' (SEQ ID NO:)的混合物。
20.权利要求13的疫苗，其中所述佐剂为IC31⑧。
21.一种在人中诱导抵御结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的保护作用的方法，所述方法包括将权利要求1-9任一项的免疫原性组合物引入该人中。
22. 一种在人中诱导多功能CD4+T细胞的方法，所述方法包括将权利要求1-9任一项的 免疫原性组合物引入该人中。
全文摘要
用Ag85B-TB10.4和IC31的结合物进行的接种形成了大量表达高水平IFN-γ、TNF-α和IL-2的多功能CD4+T细胞。这在结核病小鼠气雾攻击模型中进一步引起抵御结核病分枝杆菌感染的显著保护。重要地是，本发明人的结果还表明，疫苗的免疫原性及其抵御TB感染的保护能力高度地依赖于抗原剂量。因此，尽管标准抗原剂量5.0μg、以及15.0μg并不会引起抵御结核病分枝杆菌的显著保护作用，然而将该剂量减少至0.5μg增加了疫苗的免疫原性，并将其保护效力提高至与在BCG接种小鼠中观察到的水平相当的水平。因此，佐剂IC31和最佳的抗原剂量可以引起抵御结核分枝杆菌的强保护性Th1应答。
文档编号A61K39/04GK102149404SQ200980136013
公开日2011年8月10日 申请日期2009年7月14日 优先权日2008年7月15日
发明者C·阿加德, J·迪特里希, P·安徒生 申请人:国家血清研究中心