专利名称：有效成分包含来自野山参或人参等人参类形成层的植物干细胞株且用于进行获得性免疫 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于进行获得性免疫缺陷综合症的预防或治疗的组合物，该组合物的有效成分包含来自野山参或人参等人参形成层的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中任意一种或一种以上。
背景技术：
自从1982年在美国的洛杉矶第一次发现获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)患者以来，AIDS患者数在全世界范围内增长。在韩国， 自从1985年发现的美国人AIDS患者病例以来，患者数持续增加，AIDS治疗剂等研发已刻不容缓。人类免疫缺陷病毒(以下称为HIV)是一种主要攻击人体淋巴球的病毒，围有包膜(envelope)，具有使遗传物质RNA染色体组(genome)逆转录为DNA后插入到宿主细胞的DNA中的特性，又名逆转录病毒。HIV结构的最内部存在有遗传信息RNA和逆转录酶 (reverse transcriptase)，RNA和逆转录酶外层包有包膜蛋白，在其外层形成包含被称为 gpl20和gp41的糖蛋白脂肪膜保护膜。人们已经知道gpl20在病毒识别T-细胞后入侵时起决定性的作用。由于⑶4细胞膜蛋白(⑶4)是HIV-I病毒的细胞受体，因此HIV将⑶4+T细胞作为目标。病毒细胞入侵取决于与细胞内CD4受体分子结合的gpl20，由于HIV感染诱导这类细胞的枯竭，导致免疫功能耗竭、机率性感染、神经功能障碍、新生物生长、甚至死亡。随着HIV感染者和AIDS患者的增加，美国、法国、加拿大、日本等世界许多国家加紧了治疗剂的开发。目前已知的抗HIV物质有美国FDA批准的2，3_叠氮胸苷(AZT)、双脱氧基苷(ddl)、双脱氧胞苷(ddC)等。但上述药物有严重的副作用并且难以获得有效治疗， 基于这样的现实，新药品的开发已成为重要的课题。还有一种治疗剂是HIV的蛋白酶抑制剂。HIV转变为如融合有外膜蛋白和酶等的 gag蛋白和gag-pol蛋白的前体蛋白质后，根据自身的蛋白酶进行分解制造外膜蛋白、蛋白酶、逆转录酶和整合酶(integrase)等，在该过程中如果能抑制蛋白酶，则病毒的复制被中断，蛋白酶抑制剂就是以此原理为基础开发的。已开发的用作AIDS患者治治疗剂的蛋白分解酶抑制剂有沙奎那韦(saquinavir)，利托那韦(ritonavir)，茚地那韦(indinavir)等。 但上述药物易引发糖尿病，溶血，出血，高血压，脂肪代谢障碍等副作用，而且由于需要长期服用治疗剂，导致出现灵杆菌，引发严重的问题。本发明人致力于开发预防、治疗获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的效果优异的来自天然物的组合物，发现野山参或人参等人参形成层的植物干细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物，对预防、治疗获得性免疫缺陷综合症(AIDQ的效果优异，并完成了本发明。
发明内容
本发明目的在于提供一种来自天然物的组合物，其使现有获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)治疗剂的副作用降至最低，并具有增强预防、治疗获得性免疫缺陷综合症的功效。为实现上述目的，本发明提供一种用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症 (Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)的组合物，该组合物从人参类(Panax ginseng)形成层中诱导出来，包含具有如下特征的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中任意一种或一种以上，其中，所述细胞株具体特征如下(a)天然未分化状态(innately undifferentiated)；(b)同质性细胞株(homogeneous cell line)；以及(c)具有多个液泡(vacuole)的形态学特征。本发明还提供一种预防或改善获得性免疫缺陷综合症的功能性食品，该功能性食品含有上述细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中任意一种或一种以上。本发明还提供一种增加T细胞的免疫促进剂，其包含上述细胞株、其裂解液、其提取物、及其培养物中任意一种或一种以上。本发明还提供一种预防或治疗获得性免疫缺陷综合症的组合物的用途，该组合物包含上述细胞株、其裂解液、其提取物与其培养物中的任意一种或一种以上。本发明还提供一种预防或治疗获得性免疫缺陷综合症的方法，上述方法包括适用于包含上述细胞株、其裂解液、其提取物与其培养物中任意一种或一种以上的步骤。本发明的其他特征和实施方式通过以下的详细说明和权利要求书进一步清楚。
图1是表示本发明中的细胞株诱导过程(a)、来自野山参形成层的细胞株(b)A)和来自人参子叶的愈伤组织细胞株(生物资源中心，KCTC PC10224)的照片。图2是表示本发明中的对来自野生人参形成层的细胞株进行给药之前的第77天开始到给药后第9天为止的⑶4+T细胞数以及⑶4+T细胞数/⑶8+T细胞数的比例曲线图。图3是在临床例中对14位患者进行HIV-I RNA检测结果的示意图。
具体实施例方式在没有作其他形式的定义时，本说明书中所使用的所有技术与科技用语与本领域技术人员通常理解的含义相同。一般来讲，本说明书中所使用的命名方法是本领域所熟知的通用方法。在本发明的实施例中主要使用的用语定义参考如下。本申请中的“形成层(cambium)”是指使植物的茎及根变粗，能够材积生长的组织。由于形成层是细胞分裂最活跃的分裂组织，当被用作植物组织培养的分离块时，能够高速并大量产生细胞(大韩民国授权专利第0533120号)。本申请中的“裂解液”是指利用清洁剂等化学方法或物理方法等将细胞裂解后获得的细胞溶解物；细胞株“提取物”可以通过对细胞溶解于溶剂中后分离出的物质利用蒸馏或蒸发的方法进行浓缩后获得。另外，本申请中的“培养物”概念包括培养的细胞株和培养液。此时培养的细胞株包括根据培养条件被分化的，或者有用物质的生产能力和/或分解能力得到提高的所有细胞株。本申请中的“天然未分化状态(innately undifferentiated) ”是指从最初开始维持分化之前的状态，而不是经过脱分化过程后具有的未分化的状态。本申请中的“T细胞是指来自胸腺的、发挥主要免疫作用的淋巴球，在细胞表面表现CD4抗原的⑶4+T细胞被称作辅助T细胞(helper T cell)，细胞表面发现有CD8抗原的 ⑶8+T细胞被称为细胞毒性T细胞(cytotoxic Tcell)。其中，辅助T细胞用于辅助B细胞抗体的生产或细胞毒性T细胞的活性。本发明的一个观点是本发明涉及一种用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症的组合物，其有效成分为来自人参类(Panax ginseng)形成层的同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中的一种或一种以上。在本发明中，人参类(Panax ginseng)包括野山参或人参(Lian M. L. et al.，J. Plant Biology, 45 :201,2002 ；Han J. Y. et al.，J. Plant Biology,49 :26,2006 ；Teng W. L. et al.，Tissue and Organ Culture，68:233，200 。此时，本发明中的上述野山参或人参包括露天人参或组织培养的人参类(不定根和来自不定根的细胞株)。本发明中的来自人参类形成层的细胞株具有如下特征(a)天然未分化状态 (innately undifferentiated) ； (b)同质细胞株(homogeneous cell line)；以及(c)具有多个液泡(vacuole)的形态学特征。另外，还具有如下特征(a)在进行悬浮培养时，以单细胞水平存在；(b)与来自人参类形成层以外的组织细胞株相比，在生物反应器中的剪应力(shear stress)敏灵敏度低；(c)与来自人参类形成层之外的组织细胞株相比，生长速度快，能够稳定培养。在本发明中，上述同质细胞株的特征在于根据包括如下步骤的分离方法获得步骤(a)，获得含有人参类形成层的组织；步骤(b)，在包括3-吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid, IAA)或 3_ 吲丁 酸 (Indole-3-butyric acid, IBA)的培养基中培养上述获得的含有形成层的组织，诱导来自形成层的细胞株；此时，具有如下特征在上述培养过程中或培养前期步骤或后期步骤中，向上述含有形成层的组织进行渗透胁迫；和步骤(c)，回收上述被诱导的来自形成层的细胞株。此时，在上述步骤(b)中，上述渗透胁迫工序是为了根据形成层的特异性诱导细胞株而进行的，优选在包括上述IAA或IBA的培养基中进行培养之前进行，这样，在形成层之外的一般组织，即，一般组织在皮层(cortex)、韧皮部(phloem)、木质部(xylem)、髓心 (pith)处丧失分裂能力之后，与IAA或IBA相同，实施形成层分裂特异激素处理后进行培养时会坏死。此时将渗透剂的含量处理为0. 5 2M，优选为在冷藏或常温条件下施加16至 M小时的渗透胁迫处理后撤销渗透胁迫。渗透剂的浓度、处理时间和温度按照不同植物、不同组织的状态而不同，对此没有特别限制。还有，在上述阶段(b)中，优选为所包含的上述 IAA或IBA的含量为0. 1 52mg/L。另外，在上述步骤(c)中，其特征在于优选为将被诱导的来自形成层的细胞株在包含 2，4-D 0，4- 二氯苯氧基乙酸，2，4-dichlorophenoxyacetic acid)、毒莠定 (Picloram)和IBA中一种或一种以上的培养基内进行增殖，然后回收来自形成层细胞株。此时，上述2，4-D、毒莠定或IBA中任一种含量优选为1 5mg/L，更优选地为ang/L。本发明中所使用的培养基为通常进行植物组织培养时使用的培养基，可例举N6 培养基、SH培养基、MS培养基、AA培养基、LS培养基、B5培养基、WPM培养基、LP培养基、 White培养基，⑶培养基、DKff培养基、DCR培养基，但不限于此。在本发明中，上述提取物，其特征在于其是利用蒸馏水、低级醇、丙酮、二甲亚砜 (Dimethyl Sulfoxide, DMS0)以及他们的混合溶剂所形成的组中选出的溶剂进行提取的。 此时，低级醇是指甲醇、乙醇等碳原子数为1-5的醇。另外，CD4+T细胞在其体内与并存的抗原进行反应，并进行特异识别，然后增殖，同时释放人类已经知道的控制其他免疫体系细胞的淋巴因子(Iymphokine)蛋白。并且，B淋巴球细胞根据⑶4+T细胞产生的信号(signaling)，识别抗原，分泌特定抗体，其用于中和或去除伴随细胞间的体液运动的抗原性细菌和病毒。与此相似，⑶8+T细胞(cytotoxicT cell)被由CD4+T细胞发出的信号激活，杀死被细胞内病原体感染的细胞。此外，CD4+T细胞还对感染和初期恶性肿瘤反应时伴随产生的自然杀伤细胞(natural killer cell)和巨噬细胞等已知免疫体系细胞的活性进行调节。AIDS免疫缺陷综合症清楚地说明了这类⑶4+T细胞的重要性。正是由于这些细胞的缺损，AIDS患者残留的CD4+T细胞的抗原反应减少或消失，必须的免疫-调节因子异常生成。CD4+T细胞由于数量及功能容量的减少，在B细胞和细胞毒性T细胞(CD8+T细胞) 的成熟方面无法充分发挥应有的作用。因此，为了监控感染HIV (human immunodeficiency virus)的患者，需要测定CD4+T细胞数或百分含量(Giorgi J. V. et al. , Clin. Immunol. Newslett. ，10 :55，1990)。有鉴于此，在本发明实施例中，将来自野山参的形成层的同质细胞株向被诊断为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的患者给药后的结果，确认辅助T细胞CD4+T细胞的数量增加。因此，本发明中的来自人参类形成层的同质细胞株能够增强因HIV病毒减少的免疫性能，具有预防和治疗获得性免疫缺陷综合症(AIDQ的效果。此外，在本发明的另一实施例中，将来自野山参形成层的同质细胞株向被诊断为获得性免疫缺陷综合症(AIDQ的患者给药后，测量了患者血浆中HIV的RNA数值。从测量结果可确认，通过本发明中的同质细胞株的给药，HIV的RNA数值发生有意义的减少，另外， 通过给药，还可以确认未被检测出HIV病毒的患者。像这样的HIV减少或未检出，不仅意味着本发明中的同质细胞株具有抑制或消灭HIV增殖的作用，而且还可以作为治疗AIDS的证据。尤其是，给AIDS患者使用本发明中的同质细胞株后没有检出HIV，这样的结果表明，作为AIDS治疗剂它引人注目，而且提示有可能治愈AIDS。综上所述，在本发明中虽然没有具体的实施例来揭示含有上述同质细胞株裂解液和提取物的组合物能够发挥预防与治疗获得性免疫缺陷综合症的功能，但具有通常知识的本领域技术人员应该能够知道，同上所述，由于确认上述细胞株具有预防与治疗获得性免疫缺陷综合症的活性，本发明中的含有同质细胞株裂解液或提取物的组合物也能够具有预防与治疗获得性免疫缺陷综合症的效果。在本发明中，含有同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中一种或一种以上的用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症的组合物，增加CD4+T细胞的免疫促进剂不仅可以单独包括上述同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中的任一种或一种以上，还可以为包括一种或一种以上的允许药用的载体、赋形剂或稀释剂的医药组合物。医药组合物中的上述同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物的有效药理含量可以根据疾病及其病重程度、患者的年龄、体重、健康状态、性别、给药途径和治疗期限等适当确定。上述“允许药用”是指，从生理学角度允许给人类使用时，通常不会引起胃肠障碍、 眩晕等类似过敏反应或与之相似反应的组合物。上述载体、赋形剂与稀释剂可例举乳糖、 葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及其矿物类等。上述医药组合物还可以包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂和防腐剂等。另外，可利用本领域的公知方法将本发明中的组合物制成制剂，从而对哺乳动物给药后活性成分能够迅速、持续或延缓释放。剂型可为粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、气雾剂、软质或硬质明胶胶囊、灭菌注射液、灭菌粉末等。从另一角度，本发明涉及预防或改善获得性免疫缺陷综合症的功能性食品，其包括来自上述人参类形成层的同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中一种或一种以上。本发明中的“功能性食品”意味着通过向普通食品添加本发明中的同质细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物，来提供食品功能。实施例以下，通过实施例对本发明进一步详细说明。具有通常知识的本领域技术人员应当知道，这些实施方式仅用于对本发明进行举例说明，并不限制本发明的保护范围。尤其是在下述的实施方式中，具有通常知识的本领域技术人员应当知道，虽然来自野山参形成层的同质细胞株对获得性免疫缺陷综合症(AIDQ的预防与抑制效果已经得到确认，使用含有其裂解液或其提取物及其细胞株的培养物也能够获得相同结果。实施例1.制备来自人参类形成层的同质细胞株1-1 准备植物材料(1)图1(a)中的A体现了本发明中所使用的野山参的典型外观。准备好野山参后，为了使用野山参的主根部分，用流水去除附在外表面的土或其他污染物，再用液体洗剂洗涤主根表面，之后放到流水中。将清洗干净的组织放入到净化工作台内的已经灭菌的烧瓶中，用70%的乙醇灭菌30秒至1分钟的程度。之后用灭菌水漂洗，用至1.5%次氯酸钠(sodium hypochlorite, Junsei, Japan)进行5分钟至15分钟程度的消毒处理。此时，为了使消毒液能够有效地渗透到组织内，滴入几滴TWEEN 20 (聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，Junsei, Japan) 0该处理过程结束后，使用灭菌水漂洗3至5回的程度。然后，为了防止经杀菌处理后的组织纤维化，将杀菌后的主根放入包含抗氧化剂的BIM(browning inhibition medium)中进行30分钟至1小时程度的震荡培养，然后放到灭菌滤纸上去除水分。使用的BIM的组成与使用浓度参见表1。表1. BIM的组成与使用浓度
权利要求
1.用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquiredimmunodeficiency syndrom, AIDS)的组合物，其特征在于，包含从人参类(panax ginseng)形成层诱导出来的细胞株、 其裂解液、其提取物及其培养物中一种或一种以上，所述细胞株具有如下特征a 为天然未分化状态(innately undifferentiated)； b为同质细胞株(homogeneous cell line)；以及 c具有多个液泡(vacuole)的形态学特征。
2.如权利要求1所述的用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)的组合物，其特征在于，所述细胞株还具有如下特征a在进行悬浮培养时，以单细胞水平存在；b同来自人参类形成层以外的组织的细胞株相比，在生物反应器中对剪应力(shear stress)的敏感性低；以及c与来自人参类形成层之外的组织的细胞株相比，生长速度快，能够稳定培养。
3.如权利要求1所述的用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)的组合物，其特征在于，所述细胞株按照包括如下步骤的分离方法制得步骤a，获得含有人参类形成层的组织；步骤b，将所述获得的含有形成层的组织放到含有IAAandole-3-acetic acid)或 IBA(Indole-3-butyric acid)的培养基中进行培养，诱导来自形成层的细胞株，其中，在所述实施培养的过程中，或在培养前阶段或后阶段向所述含有形成层的组织施加渗透胁迫； 步骤c，回收上述被诱导的来自形成层的细胞株。
4.如权利要求3所述的用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)的组合物，其特征在于，将所述步骤c中的被诱导的来自形成层的细胞株放到包含2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)、毒莠定 (picloram)和IBA中一种或一种以上的培养基中进行增殖后，回收来自形成层的细胞株。
5.如权利要求1所述的用于预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)的组合物，其特征在于，所述提取物是使用由蒸馏水、低级醇、丙酮、DMSO(Dimethyl Sufoxide)及它们的混合溶剂构成的组中选择出的溶剂进行提取。
6.用于预防或改善获得性免疫缺陷综合症(Acquiredimmunodeficiency syndrom, AIDS)的功能性食品，其特征在于，包含从人参类形成层诱导出的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中的一种或一种以上，所述细胞株具有如下特征a 为天然未分化状态(innately undifferentiated)； b为同质细胞株(homogeneous cell line)；以及 c具有多个的液泡(vacuole)的形态学特征。
7.如权利要求6所述的用于预防或改善获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)的功能性食品，其特征在于，所述细胞株还具有如下特征a在进行悬浮培养时，以单细胞水平存在；b与来自人参类形成层以外的组织的细胞株相比，在生物反应器中，对剪应力(shearstress)的敏感性低；以及c与来自人参类形成层之外的组织的细胞株相比生长速度快，能够稳定培养。
8.如权利要求6所述的用于预防或改善获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)的功能性食品，其特征在于，所述细胞株根据包含如下步骤的分离方法制得步骤a，获得含有人参类形成层的组织；步骤b，将所述获得的含有形成层的组织放到含有IAAandole-3-acetic acid)或 IBA(Indole-3-butyric acid)的培养基中进行培养，诱导来自形成层的细胞株，其中，在所述实施培养的过程中，或在培养前阶段或后阶段向所述含有形成层的组织施加渗透胁迫; 以及步骤c，回收上述被诱导的来自形成层的细胞株。
9.如权利要求8所述的用于预防或改善获得性免疫缺陷综合症(Acquired immunodeficiency syndrom, AIDS)的功能性食品，其特征在于，将所述步骤c中的被诱导的来自形成层的细胞株放到包含2，4-D O，4-dich 1 orophenoxyacetic acid)、毒莠定 (picloram)和IBA中一种或一种以上的培养基中进行增殖后，回收来自形成层的细胞株。
10.增加T细胞的免疫促进剂，其特征在于，含有从人参类形成层诱导出的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中的一种或一种以上，所述细胞株具有如下特征，a 为天然未分化状态(innately undifferentiated)；b为同质细胞株(homogeneous cell line)；以及c具有多个液泡(vacuole)的形态学特征。
11.如权利要求10所述的增加T细胞的免疫促进剂，其特征在于，所述细胞株根据包含如下步骤的分离方法制得步骤a，获得含有人参类形成层的组织；步骤b，将所述获得的含有形成层的组织放到含有IAAandole-3-acetic acid)或 IBA(Indole-3-butyric acid)的培养基中进行培养，诱导来自形成层的细胞株，其中，在所述实施培养的过程中，或在培养前阶段或后阶段向所述含有形成层的组织施加渗透胁迫； 以及步骤c，回收上述被诱导的来自形成层的细胞株。
12.如权利要求11所述的增加T细胞的免疫促进剂，其特征在于，将所述步骤c中的被诱导的来自形成层的细胞株放到包含2，4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)、毒莠定 (picloram)和IBA中一种或一种以上的培养基中进行增殖后，回收来自形成层的细胞株。
全文摘要
本发明涉及用于进行获得性免疫缺陷综合症的预防或治疗的组合物，该组合物的有效成分包含来自野山参或人参等人参形成层的植物干细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物中任意一种或一种以上。本发明中的细胞株、其裂解液、其提取物及其培养物为来自天然物的组合物，将现有药物治疗剂的副作用降至最低，对人体安全，通过有效增加CD4+T细胞等的T细胞数并减少HIV(human immunodeficiency virus)数，可以防止由于免疫障碍所引起的机率性感染、神经机能障碍、新生物生长甚至面临死亡的危险，从而可以用于获得性免疫缺陷综合症的预防、治疗及症状缓解。
文档编号A61K36/258GK102170891SQ200980138689
公开日2011年8月31日 申请日期2009年9月30日 优先权日2008年9月30日
发明者李银庆, 洪宣美, 阵荣雨 申请人:云火公司