专利名称：由骨粉和纤维蛋白胶制成的固体骨架的制作方法
由骨粉和纤维蛋白胶制成的固体骨架
技术领域：
本发明涉及一种用于骨再生的骨架以及制备该骨架的方法，更特别地涉及一种包括纤维蛋白胶、与纤维蛋白胶混合的骨粉以及用于容纳促骨生长素的多个小孔的骨再生骨架，其中所述骨架具有预先确定的凝结形状。
背景技术：
骨组织工程学的目的是通过在需要骨头的位置移植骨原细胞来诱导骨再生以及发育骨组织。这种组织工程需要骨原细胞、骨原细胞所附接的用以存活的骨架以及用于促使骨诱导以及异化骨再生的生长因子。当给部件赋予刺激物同时保持适当的时间和环境， 各自的部件会形成骨组织。因此，有很多的为每个部件寻找理想因子的研究。特别地，骨传导材料(例如用于形成骨头的骨架)对于骨原细胞的寄生是很重要的。类似于骨矿物质中材料的骨传导材料应该是生物相适的，并且提供与骨周围环境接近的表面反应以及物理支持。各种骨传导材料(例如陶瓷、胶原质、生物分解的聚合体等)已经被研究。Takahashi等人报道了使用多孔渗水羟磷灰石(HA)和骨形态发生蛋白(BMP)的骨结合(Takahashi K 等人，J Biomed Master Res A12 :117_123，2007) ,Asahina 等人报道了使用HA、胶原质、牛骨形态发生蛋白等(Asahina I等人，J Med dent Sci. 44 =63-69,1997), Ohgushi 等人报道了使用陶瓷骨架(Ohgushi H 等人，J Biomed Mat Res 26 :885-95,1992 ； OhgushiH 等人，J Biomed Mat Res 32 :341_8，1996)，以及 Caplan 等人报道了使用多孔渗水磷酸钙等(CaplanAI. J Cell Physiol 213(2) :341-347,2007) 另外，欧洲专利第1231947号公开了骨替换材料，其包括(a)由纤维蛋白或纤维蛋白原组成的软基质、(b)活细胞以及(c)由非陶瓷羟磷灰石胶结材料组成的固定基质。另外，日本专利申请第1999-513590号提出了一种生物可降解的、多孔渗水三维骨移植基质，其包括由矿物化胶原质形成的并且颗粒尺寸为5μπι或更销的磷酸钙微粒，磷酸钙微粒被固定在基质上。另外，美国专利公开号为2008-02132 的专利申请文件公开了一种用于生产纤维蛋白的方法，这种蛋白纤维含有治疗骨折的半固态造骨细胞成分，所述方法包括隔离造骨细胞与动物的骨组织、在Dulbecco改良的Eagle培养基或(DMEM)中或α -MEM培养基中培养/增殖被隔离的造骨细胞以制备造骨细胞悬浮液、以及混合造骨细胞悬浮液和半固态造骨细胞凝结素。但是，传统的骨架不能用于活造骨细胞生长的介质。另外，当骨架在骨缺陷区域内被嫁接时，其形状和强度不能被保持并且在治疗过程中不能被稳定地保持，这会导致很差的骨再生效率。公开内容技术问题本发明努力研制一种能克服上述问题的骨架，并且发现通过混合纤维蛋白胶和骨粉以及冷干上述混合物所获得的固态骨架在活的有机体内是稳定的、能够保持在骨再造过程中持续放置细胞的空间、以及即使在活的有机体环境中能维持其适当的形状和强度，借此能诱导快速的骨再生。因此，本发明是基于这些事实来被实现的。另外，通过混合纤维蛋白胶和骨粉之后的冷干过程，在混合物中能形成大量的小孔，借此改进促骨再生素的吸收和维持。另外，本发明骨架可在具有预定期望形状的铸模中被冷干从而具有期望的形状。 该有益效果是提供一种适于在骨缺陷区域内使用的骨架。结合最近的3D扫描技术，可在患者体能准确地确定骨缺陷区域并且再生骨架的形状，并且因此能改进本发明的使用。因此，本发明的目的是提供一种用于故再生的固体骨架，其中骨粉与纤维蛋白胶混合，纤维蛋白胶包括作为主要成分的纤维蛋白原和凝血酶。更特别地，本发明的另一个目的是提供一种用于骨再生的混凝骨架，其中通过混合骨粉和包含作为主要成分的纤维蛋白原和凝血酶的纤维蛋白胶以及冷干合成的混合物以形成多个小孔从而容纳促骨生长素。本发明的又一个目的是提供一种具有期望形状的骨架，这种骨架通过将纤维蛋白和骨粉的混合物放入具有预定形状的铸模内并且冷干所述混合物来获得。本发明的又一个目的是提供一种为患者定制的骨架，这种骨架通过使用3D数字扫描技术来制备与患者的骨缺陷区域相应的铸模、将纤维蛋白胶与骨粉的混合物放入铸模内并且冷干混合物来获得的。技术方案为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种用于骨再生的凝结骨架，其中骨粉与纤维蛋白胶混合，纤维蛋白胶包含作为主要成分的纤维蛋白原和凝血酶。也就是说， 本发明骨架的特征在于骨粉被加至纤维蛋白胶。另外，本发明骨架可以是固态和凝固态。为此，纤维蛋白胶和骨粉可以被混合在一起，并且所产生的混合物可以被冷却干燥。同样，本发明骨架可被处理以在被冷却干燥之前具有预定的形状，或者可以在预定的铸模中被冷却干燥。一方面，形状和铸模可对应患者的颚骨或齿缺陷区域。更特别地，铸模可通过(a)使用3DCT制备3D模型以及(b)在3D颅骨模型内使用牙用树脂制备用于制备适于骨缺陷区域的骨架的铸模被制备的。在本发明中，术语“骨粉”涉及除去了造骨细胞的粉碎骨粉，优选地涉及粉碎无机骨粉。骨粉可选自自体骨、同种异体骨、异种骨以及人造骨(例如羟磷灰石)的至少一种。在本发明中，骨粉可在市场上购买到，例如Dynagraft (Austem有限公司)，Biocera(Oscotec 公司)，Bio-Oss (JungsanBiomed 有限公司)，ICB(Purgo)，MBCP (Purgo)，等等。在本发明中，术语“纤维蛋白胶”涉及包含作为主要成分的纤维蛋白原和凝血酶的生物适合以及生物可降解的产品。纤维蛋白胶被使用在各种应用中。例如，在欧洲，纤维蛋白胶通过施加作为组织粘合剂的纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙或者纤维蛋白溶解酶抑制剂被临床上用于替代或加强缝合以经过纤维蛋白的组织粘合来缝合末梢神经和改进血管。另外，在日本，纤维蛋白胶被用作脑神经手术(包括血管手术领域)、整形外科手术(例如骨粘合)以及为伤口受伤的患者止血的手术粘合剂。例如，在市场上可购买到Greenplast (绿十字公司),Beriplast-P (Aventis)，Tisseel (Baxter)等等。本发明纤维蛋白胶优选地包括纤维蛋白原和凝血酶。纤维蛋白原的浓度为10至1000mg/ml，优选地为10至100mg/ml。而凝血酶的浓度为0. 1至1000IU/ml，优选地为1至 100IU/ml。本发明纤维蛋白胶进一步包括抑肽酶或氯化钙。另外，本发明纤维蛋白胶进一步包括水溶性粘合剂。水溶性粘合剂可以是细胞培养介质、蒸馏水或血液。在本发明中，当骨粉和纤维蛋白胶混合在一起时，纤维蛋白胶数量上的增加会增加引起毒性的可能性，并且因此优选地适于调整纤维蛋白胶的含量。另外，当骨架的大小更大时，优选地增加骨粉的含量以保持骨架的密度和形状。考虑到这些事实，在本发明中，纤维蛋白胶和骨粉可以1 1至10的体积比混合，优选地为1 1至5，更加优选地为1 1 至3。本发明促骨生长素包括各种用于促进骨生长的因子。例如，促骨生长素可包括荷尔蒙、细胞因子或干细胞等等。更特别地，促骨生长素可以是血小板衍生生长因子(PDGF) 或血管内皮生长因子(VEGF)。当纤维蛋白胶和骨粉的混合物经受冷干过程时由于在混合物上形成大量的小孔， 本发明骨架可以改进促骨生长素的吸收和保持。冷干的骨架已经吸收了包含促骨生长素的介质并且将该介质传递入小孔内。本发明的另一方面涉及一种用于制备具有预定形状的固态骨架的方法，所述方法包括混合骨粉和纤维蛋白胶并且在具有预定形状的铸模中冷干所产生的混合物。冷干过程可以采用传统的方式进行，这意味着在冷干过程中残留水分的量为2% w/w或更少。另外，本发明冷干过程可使用市场上购买的冷干机进行。本发明的另一个方面涉及一种制备患者定制的骨架的方法，这种骨架适合患者的骨缺陷区域以通过将骨架应用到骨缺陷区域来促进骨再生。特别地，本发明制备患者定制的骨架的方法包括(a)使用3DCT制备3D模型，(b) 使用牙用树脂在3D模型中制备铸模，该铸模用于制备适于骨缺陷区域的骨架，以及(c)将纤维蛋白胶和骨粉的混合物放入铸模并且冷干所述混合物。有益效果本发明用于骨再生的固态骨架适合活的有机体并且在骨再生过程中持续地改进促骨生长素(例如细胞或细胞因子)的吸收和保持。另外，本发明固态骨架可将骨再生诱导至合适的形状(因为固态骨架的形状要适合骨缺陷区域)，维持能放置各种用于骨再生的材料的空间，以及即使在活的有机体环境中保持合适的形状和密度，借此诱导快速的骨再生。
图1显示了使用在本发明中的纤维蛋白胶成套材料的构造；图2显示了本发明冷干的Biocera/纤维蛋白块；图3显示了本发明冷干的Biocera/纤维蛋白块的制备过程(A 混合MBCP和纤维蛋白胶，B 冷干过程之前的凝胶状态，C 冷干过程，D 冷干过程之后的固态)；图4A显示了 MBCP和纤维蛋白胶的混合物；图4B显示了通过冷干混合物所获得的MBCP/纤维蛋白块的状态；图5分别显示了作为试验动物的小猪的麻醉诱导、牙齿的提取以及提取的牙齿；
图6显示了本发明骨移植材料被移植到小猪的齿槽缺陷区域内的位置；图7显示了移植本发明骨移植材料的过程(A 通过下颚内的残余齿槽脊的经翻瓣来暴露移植区域，B 以鞍状物的形式形成唯一的骨缺陷区域，以及移植MBCP和纤维蛋白胶混合物或MBCP/纤维蛋白块)；图8A至8D显示了使用Dicom阅读器程序分析骨密度(图8A 线条调整，图8B 厚度调整，图8C 密度测量，以及图8D 被分割成3个碎片的密度测量(10x10像素大小，3mm 厚度))；图9显示了涉及本发明骨移植材料被移植的区域的3D计算机X线体层照相术的
结果；图10显示了涉及本发明骨移植材料被移植的区域的免疫组织化学着色的结果。发明的具体实施方式下文中，将参考附图描述本发明的优选实施方式。下文中，将参考附图详细地描述本发明的具体实施方式
从而使得本领域技术人员能够容易地实施本发明。实施例1 制备本发明骨架1-1、制备纤维蛋白胶使用Greenplast kit (Greenplast成套材料、绿十字集团、韩国)制备纤维蛋白胶(图1)。如下实施纤维蛋白胶的制备。1)制备瓶-1溶液5ml首先，瓶-1内的蛋白质浓度确定为97.6mg/ml。为了调整蛋白质浓度至40mg/ml， 溶液被稀释2. 5倍。2. 5ml的瓶-2溶液被加至一个瓶_1以溶解蛋白质，并且2. 5ml的生理盐水溶液被加至另一瓶-1以溶解蛋白质。然后，两个完全溶解的瓶-1溶液被收集到一个
试管中。2)制备瓶-3溶液瓶-3中的凝血酶滴定度确定为557IU/ml。为了调整凝血酶滴定度至20IU/ml，溶液被稀释28倍。2. 5ml的瓶-4溶液被加至一个瓶_3中以溶解蛋白质，并且Iml的瓶-4溶液被取出并且被加至IOml的生理盐水溶液中，并且被彻底混合。1-2、混合纤维蛋白胶和骨粉1)盘状骨块称量0. 25g的骨粉(Biocera)并且将其放入M孔平板的每个孔中。0. 2ml的瓶_1 溶液被加入每个孔中并且与骨粉混合从而使得骨粉能充分地吸收瓶-1溶液。然后，0. Iml 的瓶-3溶液被加入每个孔中并且使用调药刀迅速地混合，所产生的混合物被保持成固定的。2)半圆形杆状骨块使用具有IOml吸液管的已准备好的铸模。称重1. 25g的骨粉(Biocera)并且放置到每个通道中。2ml的瓶-1溶液被加入每个孔中并且混合从而使得骨粉能充分地吸收瓶-1溶液。0. 5ml的瓶-3溶液被加入每个孔中并且使用调药刀迅速地混合，所产生的混合物被保持在室温一个小时。1-3、冷干
冷干器的隔板的温度被设定在-45 V并且运行冷干器。结果，获得冷干的半圆形杆状骨块(图2)。实施例2 用于试验的材料和方法2-1、试验动物和材料使用4条30kg的小猪(PWG，韩国)作为试验动物。这些猪在室温下使用软动物饲料和水、采用合格的喂养设备喂养预定的一段时间。1)牙齿提取从小猪的左右下颚提取从前白齿至第一白齿的牙齿。提取牙齿之后，伤口被连续地缝合。缝合一周之后，进行注射，并且伤口愈合一个月。在愈合过程中，在外壳手术中进行额外的结实牙齿的提取。2)制备MBCP/纤维蛋白块(1)制备纤维蛋白胶使用Greenplast kit (Greenplast成套材料、绿十字集团、韩国)制备纤维蛋白胶。Iml的Greenplast成套材料包括浓缩的人类纤维蛋白原、抑肽酶、人类血清凝血酶以及α-MEM(介质溶液)。抑肽酶与浓缩的人类纤维蛋白原混合以制备纤维蛋白原溶液、而 α -MEM与人类血清凝血酶混合以制备凝血酶溶液。(2)制备MBCP/纤维蛋白合成物(下文中被称为“MBCP+纤维蛋白胶”)已经准备好的纤维蛋白胶(包含纤维蛋白原溶液以及凝血酶溶液)与MBCP以 1 1的体积比混合，并且所产生的混合物被装入已经制备好的铸模中。然后，所述混合物经受冷干过程以制备MBCP/纤维蛋白块(也即本发明骨架)(图3和4)。2-2、试验方法1)麻醉诱导为了小猪的骨移植，动物麻醉剂(Rompun ;3mg/kg，Bayer韩国有限公司，韩国) 和可他命的每个被静脉内地注射给小猪以诱导全身麻醉。使用队0+02进行口腔插管以诱导全身麻醉。为了提供视野，上颚与下颚的犬齿被绷带系住从而导致最大的张开度。使用 Potadine对口腔灭菌，并且包含1 100，000体积比肾上腺素的利多卡因(Yuhan有限公司，韩国)被注射入下颚剩余的牙槽骨内从而诱导局部麻醉并且阻止流血(图5)。2)牙槽骨暴露小猪的剩余牙槽骨经受水平的切入和垂直的切入，并且骨膜被剥离以将下颚的脸颊侧和舌面(lingual side)暴露至最大。3)对照组和试验组的编制使用半径3mm的微锯形成深度为4至5mm、长度8mm以及底部宽度6至7mm的鞍形二壁骨缺陷。使用外科圆头锉或槽子或槌将粗燥区域打磨成期望的形状。首先，用于对照组的MBCP与纤维蛋白胶混合，所产生的混合物被凝结并且被装入右手骨缺陷区。然后，用于试验组的MBCP/纤维蛋白块被装入左手骨缺陷区的前面(图6)。在伤口处释放切入以释放张力，并且使用4-0尼龙以进行持续的锁定缝合。阿莫西林(Tiramox ，SAMJIN制药有限公司，韩国)和双氯芬酸钠(Kinpoin ，SAMJIN制药有限公司，韩国)被肌肉内地注射入所有的试验动物三天以防止外科手术之后的感染，并
8且试验动物被喂养具有高蛋白奶的软食物一周。使用洗必太(Hexamedin ，Bukwang制药有限公司，韩国)消毒一周(图7)。2-3、可视检查在手术之后，持续地对提供给小猪的饲料进行消毒，并且小猪被保持健康状态。手术2、4以及8周之后，小猪被宰杀，并且在骨组织样本被福尔马林保存之前用肉眼观察骨移植区域的愈合水平、炎症状况以及伤口开裂。2-4、计算机X线断层摄影术检查随后，使用标准的数字射线照片检查每个骨移植区域并且每个骨移植区域经受牙齿计算机X线断层摄影。然后，相对于骨移植区域的中心，进行骨移植区域之间的垂直和水平骨切割。1) 3D计算机X线断层摄影使用锥形束CT(Alphard vega，朝日伦琴设备公司，日本)影像小猪的包含每个移植材料的下颚骨。所述影像在SOKVp的管压下和8mA的管流下进行15秒。所有试样的空间分辨率被设定至0. 2mmX0. 2mm,并且每个试验获取约512个图像。所获得的图像以“.dcm” 的格式存储，并且使用DICOM阅读器程序(OnDemand 3应用软件，Cybermed公司，韩国)分析这些文件，并且所有的图像在诊断监控器(WIDE公司，韩国)上被鉴别和分析。2)骨密度分析在Dicom阅读器程序上相对于骨缺陷区域的中心调整冠状平面、矢形面以及横向面的轴线。相对于10像素X 10像素的感兴趣区域(ROI)，测量横向平面上骨缺陷区域的五个区(例如上、下、左、右区)的射线照片不透明性。每个骨缺陷区域的三个区域(例如前、 中和后区)被测量，并且在每个小猪上进行相同的分析2、4和8周。然后，随着时间的推移统计地分析射线照片的不透明性。另外，基于分析结果，随着时间的推移试验组之间射线照片不透明性的变化被统计地分析。此处，该程序上的数值是代表1023至3071范围的不透明性的相对值，并且小猪的皮层骨和松质骨分别在约500至1300和-100至600的射线照片不透性下被测量(图8)。2-5、组织学检查1、在手术2、4和8周之后小猪被宰杀以获得分别的组织样本。然后，组织样本被固定在10%的中性福尔马林溶液中两天，使用10%的EDTA除去矿物质并且通过常规方法脱水并植入树脂。然后，4至6 μ m大小的显微镜用薄片样本被附接至多聚赖氨酸涂层载片以制备样本。使得骨移植区域和正常区域被包含在组织断片内地制备组织断片。为了观察新骨和纤维性组织的形状和检查新骨和纤维性组织的形状的变化，使用苏木精&曙红以及马森三色染剂染色样本并且在显微镜下检查样本。实施例3 试验结果3-1、临床表现每组中的三个小猪中的每个在2、4和8周的时间点上被分析。从临床评估的结果可以看出，在2周的时间点在对照组中出现伤口裂开和严重的炎症。但是，在其他的试验组中，在试验的4和8周的时间点上没有出现炎症和伤口裂开，并且观察到极好的骨再生(表 1)。
[表 1]通过MBCP+纤维蛋白胶和MBCP/纤维蛋白块的炎症
权利要求
1.用于骨再生的骨架，包括 纤维蛋白胶；与纤维蛋白胶混合的骨粉；以及被加工用来容纳促骨生长素的多个孔； 其中所述骨架具有预定的凝结形状。
2.根据权利要求1所述的骨架，其中所述骨架被处理以在冷干之前具有预定的形状。
3.根据权利要求1所述的骨架，其中所述骨架在预定的铸模中被冷干。
4.根据权利要求3所述的骨架，其中所述铸模通过下述方式制备(a)使用3D计算机X射线断层扫描技术(CT)制备3维(3D)颅骨模型，以及(b)在3D颅骨模型内使用牙用树脂制备铸模，该铸模用于制备适于骨缺陷区域的骨^K O
5.根据权利要求1所述的骨架，其中所述骨粉是除掉造骨细胞的粉碎骨粉。
6.根据权利要求5所述的骨架，其中所述骨粉选自自体骨、同种异体骨、异种骨以及人造骨中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的骨架，其中所述纤维蛋白胶包括纤维蛋白原和凝血酶。
8.根据权利要求7所述的骨架，其中所述纤维蛋白原的浓度为10至1000mg/ml。
9.根据权利要求7所述的骨架，其中所述凝血酶的浓度为0.1至1000IU/ml。
10.根据权利要求1所述的骨架，其中所述纤维蛋白胶进一步包括抑肽酶或氯化钙。
11.根据权利要求1所述的骨架，其中所述纤维蛋白胶进一步包括水溶性粘合剂。
12.根据权利要求11所述的骨架，其中所述水溶性粘合剂是细胞培养介质、蒸馏水或血液。
13.根据权利要求1所述的骨架，其中所述骨粉和纤维蛋白胶以1至10 1的体积比混合ο
14.根据权利要求1所述的骨架，其中所述促骨生长素是荷尔蒙、细胞因子或干细胞。
15.一种制备用于骨再生的骨架的方法，所述方法包括 混合骨粉和纤维蛋白胶；以及冷干所产生的混合物，其中所述骨架包括被加工用来容纳促骨生长素的多个孔并且具有预定的凝结形状。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述骨架被处理以在冷干前具有预定的形状。
17.根据权利要求15所述的骨架，其中所述冷干过程是在预定的铸模中进行的。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述铸模通过下述方式制备(a)使用3DCT制备3D颅骨模型，以及(b)在3D颅骨模型内使用牙用树脂制备铸模，该铸模用于制备适于骨缺陷区域的骨^K O
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述骨粉是除掉造骨细胞的粉碎骨粉。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述骨粉选自自体骨、同种异体骨、异种骨以及人造骨中的至少一种。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述纤维蛋白胶包括纤维蛋白原和凝血酶。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述纤维蛋白原的浓度为10至1000mg/ml。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述凝血酶的浓度为0.1至1000IU/ml。
24.根据权利要求15所述的方法，其中所述维蛋白胶进一步包括抑肽酶或氯化钙。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述纤维蛋白胶进一步包括水溶性粘合剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述水溶性粘合剂是细胞培养介质、蒸馏水或血液。
27.根据权利要求15所述的方法，其中所述骨粉和纤维蛋白胶以1至10 1的体积比混合ο
28.根据权利要求15所述的方法，其中所述促骨生长素是荷尔蒙、细胞因子或干细胞。
全文摘要
本发明涉及一种骨再生骨架，并且更特别地涉及一种由纤维蛋白胶和骨粉的混合物组成的骨再生骨架，在骨架的内部具有多个用于容纳骨生长素的小孔，所述骨架具有预定的凝结形状。本发明还涉及一种用于制造所述骨架的方法。
文档编号A61L27/14GK102264401SQ200980152504
公开日2011年11月30日 申请日期2009年2月2日 优先权日2009年1月16日
发明者尹东贤, 李俊 申请人:圆光大学校产学协力团