专利名称：O157:h7增强粘膜免疫多价融合型重组菌及疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及肠出血性大肠杆菌0157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组菌、重组蛋 白制备方法及基因工程疫苗，属于生物制药领域。
背景技术：
食源性病原微生物是当今世界上不断增多的食品安全和突发性公共卫生事件的 主要诱因。在食源性病原微生物中，肠出血性大肠杆菌(EHEC)占有重要地位。自1982年 美国俄勒冈州和密执安州出现EHEC 0157:H7引起的暴发流行以来，在各个国家和地区包括 中国都出现不同程度的暴发流行。2001年，我国江苏、安徽等地发生了 2万人0157:H7食物 中毒，177人死亡。中国已将EHEC列为21世纪可能对国人健康有重大影响的12种病原微 生物之一。目前，防止0157:H7大肠杆菌感染已成为世界性问题。人类感染可引起严重的胃肠道和循环系统疾病，如出血性结肠炎 (hemorrhagicColitis，HC)、溶血尿毒综合征(Haemolytic uraemic syndrome, HUS)等，个 别患者可因急性和慢性肾功能衰竭而死亡。大肠杆菌0157:H7感染患者和无症状携带者 可作为传染源。大肠杆菌0157:H7患者平均排菌时间可达13天，常者可达到62天，HUS的 患者排菌时间可达21天，最长可达124天。在动物宿主范围非常广泛，其中反刍动物带菌 率较高。相对来讲，动物作为传染源要比人类更为重要，它往往是动物源食品污染的根源。 动物传染源排菌时间更长，往往长期排菌甚至终身排菌。感染动物粪便中的含菌量可达到 IO3 105CFU/g，甚至高达108CFU/g。EHEC 0157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致 病性与致死性以及抗生素治疗会加剧病情等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。目前，对0157:H7的感染缺乏有效的防治方法，只能给予对症治疗和适当的抗菌 治疗。由于0157:H7的暴发流行特点和治疗上的困难，疫苗研究就显得极为紧迫。有效的 疫苗研制是预防和治疗0157:H7感染最简单、经济和快捷的手段。0157:H7的致病性主要体现于细菌的粘附定植力和细菌毒素两个方面。转位紧密 素受体(Translocation intiminreceptor, Tir)是0157:H7—种重要的毒力蛋白，与紧密 素结合发挥作用。该蛋白通过EHEC III型分泌系统(type III Secretion System,TTSS) 分泌并转位至宿主细胞中，在EHEC 0157:H7定植感染过程中起重要作用。Tir全基因为 1677bp，编码559个氨基酸。EHEC 0157:H7可以产生两种毒素，分别为志贺毒素I和志贺毒素II。两种毒素均 由1个A亚单位和5个B亚单位组成，前者具有细胞内毒性，能够与28SrRNA作用从而抑制 蛋白质合成，是大肠杆菌0157:H7引起临床表现的病理基础；后者具有细胞结合特性，能与 具有特定糖鞘脂受体(Gb3)的细胞结合，从而引导A亚单位发挥作用，是志贺毒素致病的关 键。StxB作为靶受体结合区，可以激发机体的免疫应答，是开发疫苗可选择的重要靶分子。 并且，证实StxB单位因能与具有Gb3受体的抗原递呈细胞一树突细胞(DC)结合，有助于疫 苗抗原的递呈和诱导细胞及体液免疫应答，显示了良好的免疫佐剂活性。EHEC 0157:H7为肠道内寄生菌群，增强肠粘膜系统的粘膜免疫功能显得尤为重要。目前研究报道的具有粘膜佐剂效果的基因和蛋白众多，并且都有一定的增强粘膜免疫 的效果。理想的佐剂应该具备自身免疫原性低而佐剂活性强的特点，所以筛选更加有效 的粘膜免疫佐剂仍然是研究的热点。霍乱弧菌封闭小带毒素(Zonula occludens toxin, Zot)--肠道吸收的增强子为免疫佐剂或载体来促进蛋白质的吸收和增强EHEC 0157:H7 免疫反应等方面的研究目前尚未见报道。随着基因工程技术的发展和成熟，研制亚单位疫苗，尤其是多价融合亚单位疫苗 是研究的主攻方向，与单一抗原成分比较具有明显的优势，既降低纯化蛋白成本，又可以保 证融合蛋白质量稳定，批间差异小。三、发现内容技术问题本发明目的在于构建EHEC 0157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组菌，表 达重组蛋白，进而研制基因工程疫苗。本发明在抗原选择上直接针对EHEC 0157:H7重要的 致病因子，强调多个致病因子相关保护性抗原的组合应用以产生强大的免疫保护作用。为 进一步增强其粘膜免疫作用，选取Zot作为佐剂以增强多个致病因子相关保护性抗原的组 合应用的效果，提供了一种多价融合型EHEC 0157:H7基因工程疫苗及其制备方法。技术方案本发明的具体实施方案如下肠出血性大肠杆菌0157:H7(EHEC 0157:H7)增强粘膜免疫多价融合型重组菌、重 组蛋白制备方法及基因工程疫苗，其特征在于，所说的多价重组菌和重组蛋白为BL21(pGEX -4T-l-stx2b-tir-stxlb-zot)。多价重组菌和重组蛋白的制备方法包括(1)获取stx2b、stxlb、tir和zot基因，并串联克隆入pGEX_4T_l载体根据GenBank 中 0157:H7 EDL933 Tir 基因序列(序列号AF125993)、Stxl (序列 号:AP000400)和Stx2(序列号:AP000422)基因序列分别设计引物。引物序列如下Stx2b-Pl 5' -ttagaattcgcggcggattgtgctaaag-3‘Stx2b_P2 :5， -tcagtcgacattattaaactgcacttca-3‘Tir-Pl 5' -ggcgtcgacactcttaacaggcagattgg-3‘Tir-P2 :5， -atcaggcgtcgccagttttcgatgaagcgc-3，Stxlb-Pl :5，-gcgcttcatcgaaaactggcgacgcctgat-3，Stxlb_P2 5' -cgcctcgagaacgaaaaataacttcgct-3‘其中用于扩增Stx2b片段的引物上下游分别加有BamH I和Sal I酶切位点(下划 线处)，PCR反应条件为951预变性51^11，941 lmin, 54°C 30s, 72°C 30s，共30个循环，最 后72°C延伸5min，以双蒸水为阴性对照；扩增Tir和Stxlb片段采用SOE (Genesplicing by over lap extension)方法进行PCR产物拼接，其中Tir上游和Stxlb下游分别加有Sal I 和Xho I酶切位点(下划线处)，PCR反应条件为95°C预变性5min，94°C lmin,60°C 30s, 72°C 1. Omin，共30个循环，最后72°C延伸7min，以双蒸水为阴性对照；根据GenBank登陆的zot序列(序列号M83563. 1)，由金思特公司合成911核苷 酸，其中包括位于N端和C端各一个Xho I酶切位点，克隆于pUC57载体中；Stx2b-Pl 和 Stx2b_P2、Tir_Pl 和 Tir_P2、Stxlb_Pl 和 Stxlb_P2 扩增片段分别为 210bp、891bp和207bp，其中Tir-Pl和Tir_P2扩增片段位于整个ORF的274-1176核苷酸之 间；Stxlb-Pl 和 Stxlb-P2、Stx2b_Pl 和 Stx2b_P2 扩增片段分别位于 62-268 和 55-264 核 苷酸之间，均截去信号肽序列。将扩增PCR产物用1. 5%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍
5体积的DE-Abuffer后65°C作用lOmin，待胶全部融化后，再加入DE-Abuffer的0. 5体积的 DE-B buffer，颠倒混勻后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心lmin，弃液体，加 Affl buffer 500ul，12000g 离心 30s 60s，再弃液体，加入 W2 buffer 750ul，12000g 离 心lmin，弃液体，空管12000g离心lmin，转移柱子于干净的1. 5ml的印pendorf管中，并加 Λ 60ul Elution buffer, 12000g离心lmin,收集离心液，即为经过纯化的230bp、891bp和 238bp片段，命名为stx2b、tir和stxlb片段；而后用Tir-Pl和Stxlb_P2为上下游引物， 以回收的PCR产物tir和stxlb为模版，用SOE方法扩增出tir-stxlb串联片段；将BamH I和Sal I酶切的stx2b片段Iul与同样酶切的载体pGEX_4T_l片段6ul， T4DNA连接buffer和T4DNA连接酶各1. Oul，双蒸水1. Oul同时加入一个印pendorf管，混 勻后，4°C连接过夜，用于转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒， 用BamH I和Sal I双酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条230bp 的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEX-4T-l-stx2b重组质粒；用Sal I和 Xho I酶切tir-stxlb片段和pGEX-4T-l-stx2b阳性重组质粒，胶回收后各取4. 0ul，T4DNA 连接buffer和T4DNA连接酶各1. Oul，一同加入一个印pendorf管，混勻后，4°C连接过夜， 用于转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamH I和Xho I、 Sal I和Xho I分别进行双酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以分别1359bp 和1129bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得PGEX-4T-1-重组质粒；将pGEX-4T-l-stx2b-tir_stxlb和 pUC57_zot 用 Xho I 单酶切，碱性磷酸酶去磷酸 化处理，4°C连接，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoRI 进行单酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选正向插入的zot片段，有1493bp 条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEX-4T-l-StX2b-tir-StXlb-ZOt重组质 粒；(2)多价重组菌的构建、多价重组融合蛋白的表达和纯化将上述测序正确的阳性质粒pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb_zot转化到BL21 (DE3) 感受态细胞中，获得BL21(pGEX-4T-l-stx2b-tir-stx lb-zot)多价重组菌。将BL21(pGEX_ 4T-l-stx2b-tir-stxlb-zot)多价重组菌过夜培养物按2%的量接种于含有氨苄抗生素的 LB中，37°C振荡培养至A = 0. 6 0. 8时加入诱导剂IPTG至工作浓度为0. 5mM,继续30°C 震荡培养8h。诱导菌液离心收集菌体重悬于TE缓冲液中，超声裂解后，IOOOOg离心20min， 收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，可以清晰看到分子量大小为107kD目的蛋白，主要以可溶 性蛋白形式存在于菌体蛋白中，占菌体总蛋白的25%左右；将上述诱导重组菌BL21 (pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb-zot)经 12000g 离心 IOmin,收集菌体，用1/25体积的GST binding/washing buffer重悬，再加入lmg/mL的 溶菌酶和ImM的DTT，混勻后30°C作用2h，超声波进行超声破碎，4°C 12000g离心30min 收集上清，0.45 μ M滤器过滤后上经过预处理(10倍柱体积的IXGST Bind/Wash Buffer 洗柱子)的GST亲和层析柱，加入Elution buffer洗脱收集蛋白，即为经过纯化的 stx2b-tir-stxlb-zot 重组蛋白。(3)EHEC 0157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组蛋白基因工程疫苗的制备将上述纯化的多价融合型重组蛋白测定蛋白浓度，控制在1 μ g/μ L。抗原与佐剂 (ISV50，法国S印pic公司生产)按照4. 6 5.4(V/V)进行分散处理制成油乳剂。
(4)EHEC 0157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组蛋白活载体疫苗的制备将上述重组菌BL21 (pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb-zot)经过诱导表达、冷冻干燥 后，可直接作为活载体疫苗，预防肠出血性大肠杆菌的感染。有益效果本发明的特点和优点如下1、本发明针对EHEC0157:H7重要的致病因子与粘膜免疫增强佐剂串联构建 了多价融合型重组菌。分别利用PCR技术和基因合成技术，获得stx2b、tir、stxlb 和zot四个基因片断，并依次串连，最终克隆入表达质粒PGEX-4T-1中，成功构建 pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb-zot，转化入 BL21 中获得重组菌，即 BL21 (pGEX-4T-l_stx2b-tir-stxlb-zot)。2、本发明成功获得 BL21(pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb_zot)，经过 37°C高密度发 酵培养，300C IPTG的诱导获得高效表达，表达量占全菌蛋白的25 %，经过纯化后获得重组 多价融合型蛋白。3、本发明对 BL21 (pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb_zot)重组菌禾口 纯化后的 stx2b-tir-stxlb-zot重组蛋白分别制备了基因工程疫苗，免疫了 BALB/c小鼠，明确了上 述多价融合型重组菌和表达的重组蛋白具有良好的抗原性，尤其是能够明显的增强粘膜免 疫，在粪便中能够检测到高达IO1抗体滴度的SIgA，为更加安全而有效的防控肠出血性大肠 杆菌的感染和致病提供了有效的手段。
四
图1 :PGEX-4T-stx2b-tir-stxlb 重组质粒酶切鉴定。M, DL-2000 ； 1，pGEX-4T-stx2b-tir_stxlb 重组质粒质粒 EcoR I/Xho I ；2， PGEX-4T 空质粒 EcoR I/Xho I图 2 :pGEX-4T-stx2b-tir-stxlb-zot 重组质粒酶切鉴定。M，DL-2000 ；7，9，11 和 14，pGEX-4T-stx2b-tir-stxlb_zot 重组质粒 EcoR I 酶切， zot为正向插入；1-10，12，13，15和16，未正确插入zot基因。图 3 :pGEX-4T-stx2b-tir-stxlb-zot 重组菌 SDS-PAGE。M，中分子量蛋白质Marker ；l，pGEX_4T_l空载体诱导后；2，pGEX_4T_l空载体诱导 前；3，pGEX-4T-2b-tir-lb-zot 诱导前全菌蛋白；4-7，pGEX-4T-stx2b-tir-stxlb_zot 诱导 后全菌蛋白图4 皮下免疫后小鼠血清中IgG滴度测定图5 皮下免疫后小鼠血清中IgA滴度测定图6 皮下免疫组小鼠攻毒排菌量的变化图7 鼻腔内免疫后小鼠血清中IgG滴度测定图8 鼻腔内免疫后小鼠血清中IgA滴度测定图9 鼻腔内免疫后小鼠粪便中IgA滴度测定图10 鼻腔内免疫组小鼠攻毒排菌量的变化
五具体实施例方式1、获取Stx2b、Stxlb、tir和zot基因，并串联克隆入pGEX_4T_l载体
7
根据GenBank中0157: H7 EDL933 (上海三踏生物科技有限公司)Tir基因序列(序 列号AF125993)、Stxl(序列号:AP000400)和Stx2(序列号:AP000422)基因序列分别设计 引物。引物序列如下Stx2b-Pl 5' -ttagaattcgcggcggattgtgctaaag-3‘Stx2b_P2 :5， -tcaRtcRacattattaaactRcacttca-3‘Tir-Pl 5' -ggcKtcgacactcttaacaggcagattgg-3‘Tir-P2 :5， -atcaggcgtcgccagttttcgatgaagcgc-3，Stxlb-Pl :5，-gcgcttcatcgaaaactggcgacgcctgat-3，Stxlb-P2 5' -cgcctcgagaacgaaaaataacttcgct-3‘将过夜培养0157 :H7培养物，分装ImL/管，12000r离心2min，倾去上清，收集菌 体沉淀重悬于1/5体积的双蒸水中，沸水煮10min，4°C 12000r离心IOmin后吸取上清冻 存-20°C，用于PCR扩增备用。其中用于扩增Stx2b片段的引物上下游分别加有BamH I和Sal I酶切位点，PCR 反应条件为95°C预变性5min，94°C lmin，54°C 30s, 72°C 30s，共30个循环，最后72°C延 伸5min，以双蒸水为阴性对照；扩增 Tir 禾口 Stxlb 片段采用 SOE(Gene splicing by over lap extension)方法 进行PCR产物拼接，其中Tir上游和Stxlb下游分别加有Sal I和Xho I酶切位点，PCR反 应条件为95°C预变性 5min，94°C lmin,60°C 30s, 72°C 1. Omin，共 30 个循环，最后 72°C延 伸7min，以双蒸水为阴性对照；根据GenBank登陆的zot序列(序列号:Μ83563· 1)，由金思特公司合成911核苷 酸，其中包括位于N端和C端各一个Xho I酶切位点，克隆于pUC57载体(genscript公司) 中；上述Stx2b-Pl 和 Stx2b_P2、Tir-Pl 和 Tir_P2、Stxlb-Pl 和 Stxlb_P2 扩增片段 分别为210bp、891bp和207bp，其中Tir-Pl和Tir_P2扩增片段位于整个0RF(2160bp)的 274-1176核苷酸之间；Stxlb-Pl和Stxlb_P2、Stx2b_Pl和Stx2b_P2扩增片段分别位于整 个0RF(270bp)的62-268和55-264核苷酸之间，均截去信号肽序列(分别位于1_61核苷 酸和1-54位核苷酸之间)；合成的zot基因长度为91让？，位于整个01^(120(^ )的11-921 个核苷酸之间。将扩增PCR产物用1. 5 %的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的DE-Abuffer 后65°C作用lOmin，待胶全部融化后，再加入DE-A buffer的0. 5体积的DE-B buffer, 颠倒混勻后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心lmin，弃液体，加入Wl buffer500ul，12000g 离心 30s 60s,再弃液体,加入 W2 buffer 750ul，12000g 离心 lmin, 弃液体，空管12000g离心lmin，转移柱子于干净的1.5ml的印pendorf管中，并加入60ul Elutionbuffer，12000g离心lmin,收集离心液，即为经过纯化的230bp、891bp和238bp片 段，命名为stx2b、tir和stxlb片段；而后用Tir-Pl和Stxlb-P2为上下游引物，以回收的 PCR产物tir和stxlb为模板，用SOE方法扩增出tir-stxlb串联片段；将BamH I和Sal I酶切的stx2b片段Iul与同样酶切的载体pGEX_4T_l (Novagen 公司)6ul，T4DNA连接buffer和T4DNA连接酶各l.Oul，双蒸水l.Oul同时加入一个 印pendorf管，混勻后，4°C连接过夜，用于转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamH I和Sal I双酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可 以看到一条230bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEX-4T-l-stx2b重 组质粒；用Sal I和Xho I酶切tir-stxlb片段和pGEX-4T-l-stx2b阳性重组质粒，胶回 收后各取4. Oul，T4DNA连接buffer和T4DNA连接酶各1. Oul，一同加入一个eppendorf 管，混勻后，4°C连接过夜，用于转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取 质粒，用BamH I和Xho I, Sal I和Xho I分别进行双酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶 电泳鉴定，可以分别1359bp和1129bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得 pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb 重组质粒(图 1)；将pGEX-4T-l—stx2b-tir-stx Ib 和 pUC57_zot 用 Xho I 单酶切，碱性磷酸酶去 磷酸化处理，4°C连接，转化ToplO感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用 EcoRI进行单酶切，37°C水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选正向插入的zot片段，有 1493bp条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEX-4T-l—StX2b-tir-StXlb-ZOt 重组质粒(图2)；2、多价重组菌的构建、多价重组融合蛋白的表达和纯化将上述阳性质粒pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb-zot 转化到 BL21 (DE3)(北京天为 有限公司)感受态细胞中，获得BL21(pGEX-4T-l—stx2b-tir-stxlb-zot)多价重组菌。将 BL21(pGEX-4T-l—stx2b-tir-stxlb-zot)多价重组菌过夜培养物按2 %的量接种于含有 氨苄抗生素(lOOyg/mL)的LB中，37°C振荡培养至A = 0. 6 0. 8时加入诱导剂IPTG至 工作浓度为0. 5mM，继续30°C震荡培养8h。诱导菌液离心收集菌体重悬于TE缓冲液中，超 声裂解后，IOOOOg离心20min，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，用于分析表达目的蛋白主要 存在形式。在上清中可以清晰看到分子量大小为107kD目的蛋白，表明主要以可溶性蛋白 形式存在于菌体中，占菌体总蛋白的25%左右(图3)；将上述经过0. 5mM IPTG 诱导的重组菌 BL21 (pGEX-4T-l—stx2b-tir-stxlb-zot) 经12000g离心lOmin，收集菌体，用1/25体积的GST binding/washing buffer重悬，再加 入lmg/mL的溶菌酶和ImM的DTT，混勻后30°C作用2h，超声波进行超声破碎，4°C 12000g 离心30min收集上清，0. 45 μ M滤器过滤后上经过预处理的GST亲和层析柱，加入Elution buffer洗脱收集蛋白，即为经过纯化的重组蛋白。将纯化的-Stx2b-tir-Stxlb-zot重组蛋白免疫家兔制备阳性抗血清，分别 与EHEC 0157:H7的细菌培养物超声波上清进行Western blot反应，显示重组蛋白 2b-tir-lb-zot具有良好的抗原性。3, EHEC 0157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组蛋白基因工程疫苗的制备将上述纯化的多价融合型重组蛋白2b-tir-lb-zot测定蛋白浓度，lyg/yL以 上。抗原与佐剂(ISV50，法国S印pic公司生产)按照4. 6 5.4(V/V)进行分散处理制成 油乳剂。或将上述重组菌BL21 (pGEX-4T-l—stx2b-tir-stxlb-zot)经过诱导表达、冷冻 干燥后，可直接作为活载体疫苗，预防肠出血性大肠杆菌的感染。4、免疫试验(1)实验小鼠选取雄性BALB/c (扬州大学购买)小鼠数只，16g_18g/只，免疫途 径分皮下免疫和鼻腔内免疫2种。
(2)免疫攻毒和分组情况皮下免疫组分为3组，12只/组，同时设置对照组2组； 鼻腔内免疫组分为2组，10只/组，同时设置对照组1组，10只/组。具体同时设置对照组。 分别进行两次免疫，一免后21天进行二免，14天后攻毒10-50LD50 EHEC0157:H7，观察免疫 保护情况和检测粪便中排菌时间和排菌量的变化。具体分组和免疫情况见表1和表2。(3)抗体测定分别于一免和二免后采集小鼠尾部血进行IgG、血清IgA和粪便中 SIgA滴度测定。(4)免疫效果确定依据①皮下途径免疫免疫组包括三组，分别为免疫I组(pGEX-4T-Stx2b-tir-Stxlb 重组蛋白)、免疫II组(pffiX-4T-Stx2b-tir-StxIb-ZOt重组蛋白)和免疫III组 (pGEX-4T-stx2b-tir-stxlb-zot重组活菌)；对照组包括两组，分别对照I组(pGEX-4T_I 重组蛋白)和对照II组(PBS)。二免后14天攻毒保护情况，免疫I组、免疫II组和免疫 III组小鼠存活率分别为86% (6/7) ,100% (7/7)和82% (9/11)；对照I组和II组小鼠 存活率分别为33% (2/6)和50% (3/6)，总体存活率为42%。见表1。表1 皮下免疫途径接种多价融合型重组蛋白攻毒保护情况
权利要求
肠出血性大肠杆菌O157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组菌，其构建方法为根据GenBank中O157:H7 EDL933 Tir基因序列、Stx1和Stx2基因序列分别设计引物，引物序列如下Stx2b P15’ ttagaattcgcggcggattgtgctaaag 3’，Stx2b P25’ tcagtcgacattattaaactgcacttca 3’Tir P15’ ggcgtcgacactcttaacaggcagattgg 3’Tir P25’ atcaggcgtcgccagttttcgatgaagcgc 3’Stx1b P15’ gcgcttcatcgaaaactggcgacgcctgat 3’Stx1b P25’ cgcctcgagaacgaaaaataacttcgct 3’将过夜培养O157:H7培养物，分装1mL/管，12000r离心2min，倾去上清，收集菌体沉淀重悬于1/5体积的双蒸水，沸水煮10min，4℃12000r离心10min后吸取上清冻存 20℃，用于PCR扩增用；用于扩增Stx2b片段的引物上下游分别加有BamH I和Sal I酶切位点，PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃1min，54℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸5min，以双蒸水为阴性对照；扩增Tir和Stx1b片段采用SOE方法进行PCR产物拼接，其中Tir上游和Stx1b下游分别加有Sal I和Xho I酶切位点，PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃1min，60℃30s，72℃1.0min，共30个循环，最后72℃延伸7min，以双蒸水为阴性对照；根据GenBank登陆的zot序列，合成911核苷酸，其中包括位于N端和C端各一个Xho I酶切位点，克隆于pUC57载体中；Stx2b P1和Stx2b P2、Tir P1和Tir P2、Stx1b P1和Stx1b P2扩增片段分别为210bp、891bp和207bp，其中Tir P1和Tir P2扩增片段位于整个ORF的274 1176核苷酸之间；Stx1b P1和Stx1b P2、Stx2b P1和Stx2b P2扩增片段分别位于62 268和55 264核苷酸之间，均截去信号肽序列，分别位于1 61核苷酸和1 54位核苷酸之间；将扩增PCR产物用质量比1.5％的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积的DE A buffer后65℃作用10min，待胶全部融化后，再加入DE A buffer的0.5体积的DE B buffer，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心1min，弃液体，加入W1 buffer500ul，12000g离心30s～60s，再弃液体，加入W2 buffer 750ul，12000g离心1min，弃液体，空管12000g离心1min，转移柱子于干净的1.5ml的eppendorf管中，并加入60ul Elutionbuffer，12000g离心1min，收集离心液，即为经过纯化的230bp、891bp和238bp片段，命名为stx2b、tir和stx1b片段；而后用Tir P1和Stx1b P2为上下游引物，以回收的PCR产物tir和Stx1b为模版，用SOE方法扩增出tir stx1b串联片段；将BamH I和Sal I酶切的stx2b片段1ul与同样酶切的载体pGEX 4T 1片段6ul，T4DNA连接buffer和T4DNA连接酶各1.0ul，双蒸水1.0ul同时加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamH I和Sal I双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条230bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEX 4T 1 stx2b重组质粒；用Sal I和Xho I酶切tir stx1b片段和pGEX 4T 1 stx2b阳性重组质粒，胶回收后各取4.0ul，T4 DNA连接buffer和T4 DNA连接酶各1.0ul，一同加入一个eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHI和Xho I、Sal I和Xho I分别进行双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以分别1359bp和1129bp的条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEX 4T 1 stx2b4ir stx1b重组质粒；将pGEX 4T 1 stx2b tir stx1b和pUC57 zot用Xho I单酶切，碱性磷酸酶去磷酸化处理，4℃连接，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用EcoR I进行单酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选正向插入的zot片段，有1493bp条带出现，将双酶切鉴定阳性的细菌测序，获得pGEX 4T 1 stx2b tir stx1b zot重组质粒，将测序正确的阳性质粒pGEX 4T 1 stx2b tir stx1b zot转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得多价重组菌BL21(pGEX 4T 1 stx2b tir stx1b zot)。
2.权利要求1所述肠出血性大肠杆菌0157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组菌BL21( pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb-zot)表达的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，将权利要求1所述多价重组菌BL21 (pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb-zot)过夜培养物按 体积比2%的量接种于含100 μ g/mL有氨苄抗生素的LB中，37°C振荡培养至A = 0. 6 0. 8 时加入诱导剂IPTG至工作浓度为0. 5mM，继续30°C震荡培养8h，诱导菌液离心收集菌体重 悬于TE缓冲液中，超声裂解后，IOOOOg离心20min，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，可以清 晰看到分子量大小为107kD目的蛋白，即为获得的stX2b-tir-stXlb-ZOt多价重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于，将权利要求3所述经过0.5mMIPTG 诱导的重组菌BL21 (pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb-zot)经 12000g 离心 lOmin，收集菌体，用 1/25体积的GST binding/washing buffer重悬，再加入lmg/mL的溶菌酶和ImM的DTT，混 勻后30°C作用2h，超声波进行超声破碎，4°C 12000g离心30min收集上清，0. 45 μ M滤器过 滤后上经过10倍柱体积的IXGST Bind/Wash Buffer洗柱子预处理的GST亲和层析柱，加 入Elution buffer洗脱收集蛋白，即为经过纯化的stx2b-tir-stxlb_zot重组蛋白。
5.用权利要求1所述肠出血性大肠杆菌0157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组菌制备 的疫苗。
6.用权利要求2-4之一所述重组蛋白制备的疫苗。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，将权利要求2-4之一所述重组蛋白纯化后 测定蛋白浓度，控制在Iyg/μ L作抗原，与佐剂ISV50按照体积比4. 6 5. 4进行分散处 理制成油乳剂。
8.权利要求1所述重组菌BL21(pGEX-4T-l-stx2b-tir-stxlb-zot)直接作为活载体疫 苗在预防肠出血性大肠杆菌的感染方面的应用。
全文摘要
本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7增强粘膜免疫多价融合型重组菌、重组蛋白制备方法及基因工程疫苗，属于生物制药领域。分别扩增出EHEC O157:H7的志贺毒素1和2的B亚基(Stx1B和Stx2B)、转位紧密素受体(Tir)，依次串联，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，而后将霍乱弧菌封闭小带毒素(zot)串联其后，即获得重组质粒pGEX-4T-1-2b-tir-1b-zot，在BL21(DE3)获得高效表达。经过高密度发酵和一系列的纯化程序获得高纯度的融合蛋白分子疫苗。该疫苗的制备工艺简捷、易于放大、重复性好，所获得目标蛋白纯度较高，动物试验证明可刺激机体在体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫方面产生高效的免疫应答，免疫预防保护和治疗作用。
文档编号A61K39/108GK101948792SQ201010118490
公开日2011年1月19日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者何孔旺, 俞正玉, 倪艳秀, 卢维彩, 吕立新, 周俊明, 周萍, 张雪寒, 李彬, 沈江萍, 温立斌, 王小敏, 茅爱华, 赵攀登, 郭容利 申请人:江苏省农业科学院