专利名称：抑制Plk1表达的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及四种抑制Plkl表达的SiRNA及其应用。
背景技术：
Plkl (Polo-like kinase 1)是一个从酵母到人类高度保守的真核生物丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶家族成员。Plkl不仅参与参与细胞有丝分裂过程中多个步骤的调节，而且 与各种类型肿瘤的发生发展关系密切。大量研究结果表明=Plkl在各种类型肿瘤中均呈现 过表达，且其表达水平具有重要预后价值；将Plkl基因通过转染导入NIH3T3成纤维细胞表 达后，可引起NIH3T3细胞的恶性转化，恶性转化细胞能在软琼脂上快速生长，并在裸鼠体 内形成肿瘤；抑制肿瘤细胞中Plkl的表达后，可导致肿瘤细胞生长的显著抑制和大规模细 胞凋亡；但Plkl表达的抑制却对正常细胞如乳腺上皮细胞的生长影响极小；最近的一项研 究结果还表明，Plkl还可通过调节细胞外基质而参与肿瘤的侵袭与转移。这些研究结果不 仅表明Plkl是一个新的促进肿瘤发生发展的癌基因，而且也毫无疑问地将Plkl确立为一 个有良好应用前景的恶性肿瘤治疗新靶点。目前，以Plkl为靶点开发的多个新的抗肿瘤治 疗药物已经在实验室和临床试验中显示了很强的抗肿瘤效应。以Plkl为靶点的抗肿瘤药物开发目前主要有两种策略(1)传统策略，即设计抑 制Plkl酶活性的传统小分子化合物抑制剂，该策略的主要缺点是特异性较差；( 新策略， 即采用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术设计抑制Plkl基因表达的基因治疗药物， 该策略的最大优势是高效和特异性强。通过RNA i技术来研究开发新的以Plkl为靶点的抗肿瘤药物又有两个主要实现 途径(1)化学合成Plkl SiRNA ； (2)载体介导的Plkl siRNA表达。但这两种途径都需 要首先获得有效的能抑制Plkl表达的siRNA序列，因此，发现新的有效Plkl siRNA序列可 直接用于制备新的抗肿瘤治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于提供抑制Plkl表达的siRNA序列，以及进一步提供该siRNA在 制备抗肿瘤药物中的应用。为达上述目的，本发明的四种抑制Plkl表达的siRNA序列分别为Plkl-siRNA-607 的序列正义链5'-AUGAAGAUCUGGAG⑶GAATT-3‘，反义链5'-UUCACCUCCAGAUCUUCAUTT-3‘；Plkl-siRNA-778 的序列正义链5'-AUACCUU⑶UAGUGGGCAATT-3‘，反义链5'-UUGCCCACUAACAAGGUAUTT-3‘；Plkl-siRNA-838 的序列
正义链5'-GGAUCAAGAAGAAUGAAUATT-3‘，反义链5'-UAUUCAUUCUUCUUGAUCCTT-3‘；Plkl-siRNA-484 的序列正义链5'-GGAGGAAAGCCCUGACUGATT-3‘，反义链5'-UCA⑶CAGGGCUUUCCUCCTT-3‘。上述四种siRNA序列可用于制备抗肿瘤药物。本发明首先根据公认的siRNA序列设计原则从Plkl的cDNA序列中选取候选 siRNA序列，再通过BLAST同源比对排除一些特异性差的候选siRNA序列，最后选定4种新 的PlklsiRNA序列，并采用体外化学合成法合成各组Plkl SiRNA0然后，将各组Plkl siRNA 和阴性对照siRNA同时分别转染HeLa细胞，采用RT-PCR和Wfestern印迹方法分别检测各 组PlklsiRNA在mRNA和蛋白质水平上对Plkl的表达抑制效果，同时通过倒置生物显微镜 观察各组Plkl siRNA对肿瘤细胞生长增殖的抑制效应。RT-PCR分析结果表明，在转染后 48h，与对照组相比，Plkl siRNA转染组的Plkl mRNA水平显著降低，而GAPDH内参对照基 因的表达则没有变化；蛋白质免疫印迹实验表明，瞬时转染后48h，Plkl的表达几乎100% 完全受到抑制，而对照组无明显效应，同时Actin内参对照基因的表达没有变化，说明本发 明提供的各组PlklsiRNA能够特异性的有效抑制Plkl的表达。倒置生物显微镜观察发现， 在转染后Mh，对照siRNA转染组中的肿瘤细胞仍为正常的贴壁生长，而各Plkl siRNA转 染组中大量细胞呈现规则的圆形，并脱离培养皿底壁，漂浮于培养液中。这表明，Plkl的表 达被有效抑制后，肿瘤细胞的正常生长分裂受到显著抑制，被有效阻滞于有丝分裂期。在转 染后48和72h，对照siRNA转染组中的细胞仍为正常的贴壁生长，并表现为密集汇合的生长 特点，而各Plkl siRNA转染组中大量细胞开始死亡、裂解，在显微镜下可观察到大量死亡的 细胞碎片。说明各组PlklsiRNA能有效抑制肿瘤细胞的生长增殖，可直接用于制备新的以 Plkl为靶点抗肿瘤治疗药物。
图1为RT-PCR方法检测各组siRNA在mRNA水平上对Plkl表达的抑制效果2为Western印迹方法检测各组siRNA在蛋白质水平上对Plkl表达的抑制效 果3为倒置生物显微镜观察各组Plkl siRNA对肿瘤细胞生长增殖抑制的结果图具体实施说明实施例1 :Plkl siRNA的合成从公共免费基因数据库GenBank获取Plkl的eDNA序列，然后根据公认的siRNA 序列设计原则从Plkl的cDNA序列中选取候选siRNA序列，再通过BLAST同源比对排除一 些特异性差的候选siRNA序列，最后选定四种Plkl siRNA序列，序列分别为Plkl-siRNA-607 的序列正义链5'-AUGAAGAUCUGGAG⑶GAATT-3‘，反义链5'-UUCACCUCCAGAUCUUCAUTT-3‘；Plkl-siRNA-778 的序列正义链5'-AUACCUU⑶UAGUGGGCAATT-3‘，
反义链5'-UUGCCCACUAACAAGGUAUTT-3‘；Plkl-siRNA-838 的序列正义链5'-GGAUCAAGAAGAAUGAAUATT-3‘，反义链5'-UAUUCAUUCUUCUUGAUCCTT-3‘；Plkl-siRNA-484 的序列正义链5'-GGAGGAAAGCCCUGACUGATT-3‘，反义链5'-UCA⑶CAGGGCUUUCCUCCTT-3‘。委托上海吉玛制药技术有限公司以化学合成法体外合成上述SiRNA序列。
实施例2 =RT-PCR方法检测各组siRNA在mRNA水平上对Plkl表达的抑制效果1、转染实验收集对数生长期的HeLa或H印_2细胞，以合适的密度接种至6孔 培养板，分别设置空白对照组、阴性对照siRNA转染组、Plkl siRNA转染组，置于C02培 养箱培养。培养24h后，细胞密度达到约60%，开始进行siRNA转染实验。转染实验采用 Invitrogen公司的Lipofectamine RNAiMax试剂，具体方法参照试剂使用说明书进行。2、总RNA提取转染后48h，收集各组细胞。使用hvitrogen公司的1Trizol试剂 提取细胞总RNA，具体方法参照试剂使用说明书进行，各组总RNA样品利用紫外分光光度计 定量和变性琼脂糖凝胶电泳检测以确保总RNA的质量和完整性。3、RT-PCR (1)反转录采用 TAKARA 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，具体方法参照试剂盒使用说明书进行。(2)PCR 以GAPDH作 为内参对照，检测Plkl基因的mRNA表达水平变化。Plkl的上下游引物分别为，上游 引物5 ‘ -GGCAACCTTTTCCTGAATGA-3 ‘，下游引物5 ‘ -AATGGACCACACATCCACCT-3 ‘。 GAPDH的上下游引物分别为，上游引物5 ‘ -ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3 ‘，下游引物 5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 ‘。PCR 扩增反应体系组成为 1 μ L IOXPCR 缓冲液、1 μ L 2. 5mmol/L dNTPs、20 X cDNA 模板 1 μ L、0. 1 μ L Taq 酶(5U/μ 1)、10 μ mol/L 上下游引物混 合液1 μ L，双蒸水补足至10 μ L。扩增程序为95°C变性anin，然后用逐步程序95°C 15sec、 60°C 15sec、72°C 20sec完成19 35个循环，最后于72°C延伸7min。2%琼脂糖凝胶电泳 检测PCR扩增产物，EB染色，凝胶成像系统照相。4、结果见图1，RT-PCR分析结果表明，在转染后48h，与对照组相比，各Plkl siRNA转染组的Plkl mRNA水平显著降低，而GAPDH内参对照基因的表达则没有变化，说明 各组siRNA均能有效抑制Plkl在mRNA水平上的表达。实施例3 =Western印迹方法检测各组siRNA在蛋白质水平上对Plkl表达的抑制 效果1、转染实验参见实施例2。2、细胞蛋白质裂解液制备吸去培养皿中的培养基，用IXPBS将细胞洗涤2次，用 细胞刮收集细胞，混悬于RACKl裂解缓冲液(25mM Tris-HCl，pH8. 0，137mM NaCl，2. 7mMKCl, 1% Triton X-100，使用前临时添加适量蛋白酶抑制剂)，冰上放置30min，超声处理进一步 破碎细胞和DNA。4°C 14000rpm离心lOmin，收集上清作为细胞裂解液。采用Bradford法 检测细胞裂解液中的蛋白质浓度，具体方法参见Bio-Rad公司的Bio-Rad ProteinAssay试 剂盒使用说明。3、Western印迹取适量细胞裂解液，加入SDS上样缓冲液(62. 5mM Tris-HCl,pH6. 8,2% β -巯基乙醇，0.01%溴酚蓝)于100°C加热变性处理5min。10% SDS-PAGE分离 样品中各蛋白质。采用Tank法进行转膜，具体方法参见Millipore公司的ImmobilonTM-P 膜使用说明。用封阻液(含5%牛奶的TBS-T)将转印后的蛋白膜于室温封阻Ih或4°C封阻 过夜。TBS-T洗膜三次，每次5min ；加入适量稀释的一抗(Plkl抗体购自Zymed公司，Actin 抗体购自Sigma公司)，室温温育Ih ；TBS-T洗膜三次；加入1 2000稀释的偶联辣根过 氧化物酶的二抗(购自Cell Signaling公司)，室温温育Ih ；TBS-T洗膜三次。最后采用 化学发光法进行检测，具体操作参见Amersham公司的ECL Western blotting detection reagents and analysissystem试剂盒说明，KODAK显像系统进行显影。4、结果见图2，WeStern印迹分析结果表明，在转染后48h，各Plkl siRNA转染组 的Plkl蛋白质表达几乎100%完全受到抑制，而对照组无明显效应，同时Actin内参对照基 因的表达没有变化，说明各组siRNA均能有效抑制Plkl在蛋白质水平上的表达。实施例4 倒置生物显微镜观察各组Plkl siRNA对肿瘤细胞生长增殖的抑制效应1、转染实验参见实施例2。2、细胞生长增殖观察使用尼康公司的倒置生物显微镜，分别在转染后的Mh、 48h和7 观察Plkl表达抑制后对肿瘤细胞生长分裂和细胞形态的影响。3、结果见图3，在转染后Mh，对照siRNA转染组中的肿瘤细胞仍为正常的贴壁生 长，而各Plkl SiRNA转染组中大量细胞呈现规则的圆形，并脱离培养皿底壁，漂浮于培养液 中。这表明，Plkl的表达被有效抑制后，肿瘤细胞的正常生长分裂受到显著抑制，被有效阻 滞于有丝分裂期。在转染后48和72h，对照siRNA转染组中的细胞仍为正常的贴壁生长，并 表现为密集汇合的生长特点，而各Plkl siRNA转染组中大量细胞开始死亡、裂解，在显微镜 下可观察到大量死亡的细胞碎片。说明各组Plkl siRNA能有效抑制肿瘤细胞的生长增殖 并诱发细胞死亡和/或凋亡。实施例5:Plkl siRNA在制备抗肿瘤治疗药物中的应用本发明所得的四组Plkl siRNA序列的可用于设计和制备抗肿瘤治疗药物。用于人 类体内给药，可单独使用或与其它药物联合使用。在具体实施时，可以参照目前通用的RNAi 基因治疗方案进行设计和实施。目前主要有两种设计和制备策略，简述如下第一种，直接合成法。即根据本发明提供的Plkl siRNA序列，直接采用化学合成 的方法合成相应的Plkl siRNA双链分子。其中正义链和反义链自5'端开始的19个核苷 酸为靶向PlklmRNA的序列，必须使用；而正义链和反义链自3'末端的游离的两个连续的 脱氧核苷酸(TT)悬垂修饰则可以替换为两个连续的尿嘧啶核苷酸(UU)。另外，为了增加 Plkl siRNA双链分子在细胞内和体内的稳定性，可进一步使用常用的siRNA修饰方法对其 进行修饰。第二种，载体介导法。即根据本发明提供的Plkl siRNA序列的正义链和反义链自 5'端开始的19个核苷酸序列(注该序列即靶向Plkl mRNA的序列)，进一步设计相应的 短发夹样核苷酸序列，插入相应的各种基因治疗载体，制备能表达Plkl shRNA的基因治疗 药物。
权利要求
1.四种抑制Plkl表达的siRNA，其序列分别为 Plkl-siRNA-607 的序列正义链5' -AUGAAGAUCUGGAG⑶GAATT-3 ‘，反义链5' -UUCACCUCCAGAUCUUCAUTT-3 ‘；Plkl-siRNA-778 的序列正义链5' -AUACCUU⑶UAGUGGGCAATT-3 ‘，反义链5' -UUGCCCACUAACAAGGUAUTT-3 ‘；Plkl-siRNA-838 的序列正义链5' -GGAUCAAGAAGAAUGAAUATT-3 ‘，反义链5' -UAUUCAUUCUUCUUGAUCCTT-3 ‘；Plkl-siRNA-484 的序列正义链5' -GGAGGAAAGCCCUGACUGATT-3 ‘，反义链5' -UCA⑶CAGGGCUUUCCUCCTT-3 ‘。
2.如权利要求1所述的任意一种PlklsiRNA序列，其序列特征为正义链和反义链的 长度均为21个核苷酸，两条链的5'端的19个核苷酸序列互补配对，3'末端均为游离的两 个连续的脱氧核苷酸(TT)悬垂修饰，其中正义链和反义链自5'端开始的19个核苷酸为靶 向Plkl mRNA的序列。
3.如权利要求1和2所述的任意一种PlklsiRNA序列及其自5'端开始的19个核苷 酸序列在设计和制备抗肿瘤治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了四种siRNA序列，它们能抑制Plk1基因的表达，并显著抑制肿瘤细胞的生长增殖。根据本发明公开的四种Plk1 siRNA序列，其用途是可用于设计与制备抗肿瘤基因治疗药物。
文档编号A61K48/00GK102102101SQ20101011835
公开日2011年6月22日 申请日期2010年3月5日 优先权日2010年3月5日
发明者兰欢, 卜友泉, 宋方洲, 朱江, 杨正梅 申请人:重庆医科大学