专利名称：密码子优化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的Hiv-lgpl20基因共有序列及 gp 120核酸疫苗。
背景技术：
A^^&^f-^'MM (human immunodeficiency virus,HIV)(envelop,Env) 病毒，每个病毒包膜的表面镶嵌由糖蛋白gpl20和gp41形成的三聚体刺突。根据Env不同， HIV-I分为M，N和0三群。M群在全世界流行最广，根据全基因组被继续分9种亚型(A、B、 C、D、F、G、H、J、K)，并呈现出地理上的区域分布特征。其中B亚型是最主要的流行亚型(主 要发现于北美和欧洲)，A、D亚型主要流行于非洲，C亚型则分布于非洲和亚洲，这些亚型形 成了代表HIV-IM群的系统进化树上的不同分化枝。我国的优势亚型(95%以上)为ThB亚 型、B/C重组亚型和A/E重组亚型。ThB亚型主要流行区是河南和河北，A/E和B/C重组体 主要流行区是广西和云南及新疆，B/C重组体也流行于四川省。在同一亚型/重组体内，不 同的病毒株的Env，尤其是gpl20，仍然呈现高度变异性。Gpl20的高度变异以及由此导致的 中和抗体免疫逃逸是HIV疫苗研制的重大挑战。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供中国HIV-I流行病毒株包膜蛋 白gpl20共有氨基酸序列。本发明的另一目的是提供经密码子优化的的编码中国HIV-I流行病毒株包膜蛋 白gpl20共有氨基酸序列的基因序列。本发明的又一目的是提供一种包含上述密码子优化的gpl20基因序列的核酸疫
田ο我们从Genebank上收集了中国的HIV-1包膜蛋白gpl20的氨基酸序列。应用ThB 亚型、B/C重组亚型或者A/E重组亚型中不同病毒株的gpl20进行多序列比对，获得针对每 一个亚型的共有氨基酸序列。本发明的技术方案是中国HIV-I流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gpl20 共有氨基酸序列，序列为SEQ ID NO. 1,SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3。其中SEQ ID NO. 1为 HIV-I病毒株A/E重组亚型包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列，SEQ ID N0. 2为HIV-I病毒株 B/C重组亚型包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列，SEQ ID N0. 3为HIV-I病毒株ThB亚型包膜 蛋白gpl20共有氨基酸序列。经密码子优化的编码中国HIV-I流行病毒株包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列的基 因序列，序列为SEQ ID N0. 4,SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6。其中SEQ ID NO. 4为经密码子 优化的编码中国HIV-I病毒株A/E重组亚型包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列的基因序列， SEQ ID N0. 5为经密码子优化的编码中国HIV-I病毒株B/C重组亚型包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列的基因序列，SEQ ID NO. 6为经密码子优化的编码中国HIV-I病毒株ThB亚型 包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列的基因序列。Hiv-lgpl20核酸疫苗，该疫苗含有经密码子优化的编码中国HIV-1流行病毒株包 膜蛋白gpl20共有氨基酸序列的基因序列和真核表达载体。所述的经密码子优化的编码中国Hiv-I流行病毒株包膜蛋白gpl20共有氨基酸序 列的基因序列为在SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6的5，端和3，端分别插入限 制性内切酶NheI和BamHI粘性末端的基因序列。所述的真核表达载体为经内切酶NheI和BamHI切割pJW4303得到的载体片段。本发明提供的基于中国HIV-I流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚 型)包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列核酸疫苗的构建包括如下步骤(1)中国HIV-I流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白 gpl20共有氨基酸序列分析与获得我们从Genebank上收集了中国的HIV-I包膜蛋白gpl20的氨基酸序列。应用ThB 亚型、B/C重组亚型或者A/E重组亚型中不同病毒株的gpl20进行多序列比对，获得针对每 一个亚型的共有氨基酸序列。(2)密码子优化的编码中国HIV-I流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB 亚型)包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列的基因序列的设计和合成应用基因软件MacVector 7. 2分析中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重 组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列，推导相应的编码基因序列。由于野生 型gpl20共有氨基酸编码序列不符合哺乳动物和大肠杆菌密码子使用偏好，发明人通过筛 选，设计出密码子优化的gpl20共有氨基酸序列的基因序列，并经过基因公司的化学合成 得到了密码子优化的gpl20共有氨基酸序列的基因序列。密码子优化后gpl20基因中哺乳 动物细胞偏爱的密码子频率及大肠杆菌细胞偏爱的密码子频率高于野生型gpl20基因(见 图2)。此密码子优化的序列所编码的蛋白质氨基酸序列与原始的氨基酸序列保持一致。(3)疫苗构建将步骤⑵得到的基因片段克隆到真核表达载体PJW4303中，得到重组质粒 pJW4303/gpl20. AE. cons,pJW4303/gpl20. BC. cons 和 pJW4303/gpl20. ThB. cons。经对重组 质粒的纯化、酶切和测序鉴定后，确定得到了编码共有氨基酸序列的gpl20核酸疫苗。本发明的有益效果 1、中国HIV-I流行病毒株包膜蛋白gp 120共有氨基酸序列，与原始序列比较，降低 了 gpl20的变异。用抗原的共识序列可减少其与野生型基因免疫原之间的遗传距离，并能 诱导机体产生较广谱的中和抗体和细胞免疫反应。2、经密码子优化的编码中国HIV-I流行病毒株包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列 的基因序列选用了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好的密码子，可以高效的在真核 (哺乳动物细胞)和原核(大肠杆菌)表达。虽然由基因的核苷酸序列可以准确的推断出其编码的氨基酸序列，但根据蛋白质 的氨基酸序列而推断的核苷酸序列并不唯一，正是由于绝大多数密码子的兼并性(绝大多 数氨基酸均对应于二个以上的密码子，例如与亮氨酸、丝氨酸对应的密码子分别有6个)， 因此编码某一小肽的核苷酸序列可以有成千上万种。越来越多的研究结果表明，特定的蛋白多肽在细胞内的表达水平通常不是取决于其氨基酸序列，而是取决于相对应的核酸编码 序列在宿主细胞内的复制、转录、翻译效率及其在宿主细胞内的稳定性等因素。因此，不同 的核酸编码序列(虽然它们编码的氨基酸序列相同)在各种宿主细胞中的表达效率往往存 在显著差异。通过对野生型gpl20的基因序列分析，发明人认为由于自然界生物体存在密码子 的偏好性，从病原体来源的gpl20基因克隆在异源宿主体内难以高效表达，因此就不能有 效的刺激宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫保护作用。为了提高异源基因在哺乳动物 和大肠杆菌中的表达效率，往往需要对核苷酸编码序列进行优化。由于目前对核苷酸序列 的优化尚没有统一的标准或原则，因此针对氨基酸序列，不同的研究人员完全会设计出不 同的核苷酸序列用于目标多肽的表达和制造，相应地表达效率也可能存在差异。根据我们 优化的核苷酸编码序列，克服了上述缺陷，提高了 gpl20蛋白表达水平，以及由该基因构建 的核酸疫苗的免疫原性。3、应用真核表达载体PJW4303制备的经密码子优化的中国HIV_lgpl20共有序列 核酸疫苗能显著有效的刺激宿主的免疫系统，使之产生良好的免疫应答。
图1对基因库中已知的中国HIV-1AE、BC和ThB亚型的gpl20氨基酸序列进行分 析。A :HIV-1A/E重组亚型gpl20共识序列与从HIV-I感染者分离的HIV-1A/E重组亚 型的氨基酸序列进化树的分析。圈中所示为本研究设计的HIV-1A/E重组亚型gpl20共识 序列；B :HIV-1B/C重组亚型gpl20共识序列与从HIV-1感染者分离的HIV-1B/C重组亚 型的氨基酸序列进化树的分析。圈中所示为本研究设计的HIV-1B/C重组亚型gpl20共识 序列。C =HIV-IThB亚型gpl20共识序列与从HIV-1感染者分离的HIV-IThB亚型的氨基 酸序列进化树的分析。圈中所示为本研究设计的HIV-IThB亚型gpl20共识序列。图2野生型与密码子优化的gpl20基因中哺乳动物细胞偏爱密码子频率的比较 指数> 1为哺乳动物细胞所偏好，纵坐标表示偏好指数，横坐标表示核苷酸序列位置。左图 为野生型gpl20基因，右图为密码子优化的gpl20基因。图3密码子优化的核酸疫苗的鉴定应用BamHI和NheI酶切质粒；1 :AE. gpl20 ； 2 :AE. gpl20 经 BamHI+Nhel 双酶切；3 :BC. gpl20 ；4 :BC. gpl20 经 BamHI+Nhel 双酶切；5 ThB. gpl20 ；6 :ThB. gpl20 经 BamHI+Nhel 双酶切。图4转染293T细胞内gpl20蛋白表达的Western blot分析结果。图5应用ELISA检测新西兰白兔血清gpl20抗体应答时间曲线，箭头表示免疫时 间点，各点所用的兔血清稀释度为1 1000。图6应用Western-blot检测新西兰白兔血清gpl20抗体应答。图7检测假型病毒SF162的TCID50，TCID50/ml是28000，说明假型病毒制备成功。图8应用兔免疫血清中和来自B亚型的假型病毒株SF162的中和试验结果。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。实施例1.中国HIV-1AE、BC和ThB亚型的gpl20氨基酸序列分析对基因库中已知的中国HIV-1AE、BC和ThB亚型的gpl20氨基酸序列进行分析。 根据序列排列的结果和遗传进化树的分析结果(图1)，设计了中国HIV-1AE、BC和ThB亚 型的gpl20氨基酸共识序列。实施例2.编码共有氨基酸序列的密码子的设计和合成首先用基因软件MacVector 7. 2分析编码中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、 B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列的基因序列，找出其密码子使用 偏好以及原始序列中密码子使用偏好与哺乳动物密码子使用偏好和与大肠杆菌密码子使 用偏好不同的密码子位点。对于其中哺乳动物和大肠杆菌密码子使用偏好相同的氨基酸， 用哺乳动物和大肠杆菌都偏好的密码子替代原始序列中编码该氨基酸的密码子，分别设计 了密码子优化的编码AE、BC及ThB亚型gpl20蛋白的基因序列，序列分别为SEQ ID NO. 4、 SEQ IDN0. 5及SEQ ID NO. 6。密码子优化后gpl20基因DNA序列有所变化，但gpl20蛋白 氨基酸序列不变。密码子优化后gpl20基因由人工化学合成(Geneart公司，德国)，构建成 重组质粒pGA4/AE. gpl20、pGA4/BC. gpl20和pGA4/ThB. gpl20。经测序证实合成的序列正 确。实施例3. gpl20DNA疫苗构建将质粒pJW4303 和 pGA4/AE. gpl20 (或者 pGA4/BC. gpl20,或者 pGA4/ThB. gpl20) 用Nhe I和BamH I分别进行双酶切。酶切反应体系为10XBuffer TangoTM 4μ L, 10父85六4“1^，质粒2(^1^他61 1 μ L，BamHI 1口1^，补水至401^。酶切产物经7g/L的琼脂 糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0，大连宝 生物公司)分别回收纯化约HOObp的目的片段和线性化的PJW4303。将电泳后琼脂糖凝胶置于紫外检测仪下，切下含目的DNA的凝胶，分析天平称胶 块的质量，按Img = 1 μ L计算胶块的体积。加入3倍体积的DR-I Buffer,置于75°C水浴 中加热融化胶块，每隔2min混勻一次，直至胶块完全融化，加入DR-I Buffer 1/2体积的 DR-II Buffer，充分混勻溶液。将离心吸附柱安置在收集管上，转移混合溶液至吸附柱中， 静置 2min，3600rpm，离心 lmin。弃滤液，加入 500 μ L Rinse A 液，3600rpm，离心 30s。弃滤 液，加入700 μ L Rinse B液，3600rpm，离心30s，重复洗涤一次。空柱12000rpm，离心lmin, 将吸附柱安置在Ep管上，让乙醇完全挥发干净。在吸附膜的中央，加入25 μ L洗脱缓冲液， 静置60s。12000rpm，离心lmin，此时Ep管中的洗脱液即为目的DNA溶液。测定DNA溶液 的浓度，用10g/L琼脂糖凝胶电泳分析割胶纯化效果，洗脱液保存在-20°C冰箱中备用。用T4DNA连接酶将约1400bp的目的片段和线性化的pJW4303连接，构建pJW4303/ gpl20重组表达质粒。即为本文结果中提及的gpl20DNA疫苗AE. gpl20、BC. gpl20和ThB. gpl20。连接反应体系为10XT4 DNA Ligase Buffer 1 μ L，线性化的 pJW43031 μ L，纯化 目的片段7yL，T4DNALigase 1 μ L，混勻，16°C放置16h。连接物转化HBlOl感受态细胞。实施例4编码共有氨基酸序列的核酸疫苗的鉴定4. 1 gpl20DNA 疫苗 AE. gpl20、BC. gpl20 和 ThB. gpl20 转化 HB101 感受态细胞1)将10 μ L连接物加入到装有100 μ L ΗΒ101感受态细胞的Ep管中，轻轻拍动管壁数次，充分混勻，冰浴30min。2)将Ep管置于42°C水浴中90s，立即转至冰浴，静置2min。3)向Ep管中缓慢加入LB培养基0. 5mL, 37°C，80rpm振摇，培养45min。4)将菌液涂布在含氨苄霉素(0. lg/L)的LB平板上，37°C，培养过夜。4. 2筛选阳性克隆随机挑取5个单菌落，分别接种于5只培养试管(含0. lg/L氨苄霉素的LB培养 基)中，37°C，250rpm振摇，培养过夜。4. 3小量提取gpl20的重组DNA疫苗质粒(质粒小量提取试剂盒QIAGEN Plasmid Mini Kit (50)，Qiagen 公司)1)将4. 2中摇过夜的细菌在无菌超净台中缓慢吸到1. 5ml离心管中，培养试管中 剩下少量均液保存于4°C。2)离心管中菌液，常温下6000g，离心lOmin，弃上清，收集细菌。3)加入250 μ 1重悬缓冲液于细菌沉淀，反复振摇，直至看不到细菌团块，细菌全 部重悬于溶液中。4)加入250 μ 1裂解缓冲液到上述菌体重悬液体中，温和颠倒5-6次，溶液呈均勻 蓝色，静置5min。5)加入350 μ 1平衡缓冲液于⑷中得到的液体中，温和颠倒5-6次，蓝色溶液消 失，溶液分层，上层为结实的乳白色团块，下层为清亮液体，室温静置2min。6) 12000g，离心lOmin，吸取上清，转移至另一离心管。该条件下离心lOmin。7)将上清液加入到离心吸附柱中，12000g，离心lmin，弃滤液。8)吸附柱再12000g，离心lmin，弃去滤过液体。9)向离心吸附柱中加入洗涤缓冲液25 μ 1，12000g，离心lmin，收集滤液。10)再将步骤9重复操作1次。11)两次收集的液体中即含有质粒。4. 4小量提取gpl20的重组DNA疫苗质粒进行酶切鉴定质粒用Nhe I和BamH I进行双酶切，双酶切总反应体系(10 μ L) =IOXBuffer Tango l μ L, IOXBSA 1 μ L，质粒(0. 22mg/mL) 2 μ L，Nhe I O. 25 μ L，BamH I 0. 25yL，补水 至10 μ L。37°C孵育lh，加入1 μ L 10 X Loading buffer终止酶切反应，10g/L琼脂糖凝胶 电泳观察结果(图3)，酶切正确细菌划三次平板，保存两个单克隆细菌。实施例5.核酸疫苗的大量制备(质粒大提试剂盒为QIAGEN Plasmid Mega Kit (5) ,Qiagen 公司)1)吸取鉴定正确的细菌保存液5μ L接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养液中， 37°C，200rpm，过夜生长。2)按1 500将1)中培养菌液接种于1000ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C， 200rpm，过夜生长。3)第二天将细菌移到250ml离心瓶中，4°C、6000g离心15min，弃上清，收集细菌。4) 50ml缓冲液Pl重悬细菌沉淀，反复振摇，直至看不到细菌团块，细菌全部重悬 于溶液中。5) 50ml缓冲液P2加入重悬液体于离心瓶，温和颠倒5_6次，溶液呈均勻蓝色，静置5min。6) 50ml缓冲液P3加入上述混合液体中，温和颠倒5_6次，蓝色溶液消失，溶液分 层，上层为结实的乳白色团块，下层为清亮液体，冰上放置30min。7) 4°C，20000g,离心30min，保留上清，转移至另一离心瓶。该条件下再将上清液离 心 IOmin08)平衡缓冲液QBT35ml湿润平衡提取柱。9)将(7)中得到的上清加入提取柱，自然过柱，弃去滤过液体。10)加入洗涤缓冲液QC200ml，自然过柱，弃去滤过液体。11)加入洗脱缓冲液QF35ml，自然过柱，收集滤过液体。12)向收集液体中加入24. 5ml异丙醇，4°C，15000g，离心30min，弃上清。13)用7ml 70%乙醇重悬离心管中沉淀，常温15000g离心lOmin，弃去上清。14)将有沉淀的离心管于超净台自然晾干，Iml生理盐水溶解。15)紫外分光光度法(波长260nm 280nm)定量质粒含量。16)加入洗脱缓冲液QF35ml，再将柱子洗脱1次。17)为提高吸附柱的利用率，第二天用自配的溶液按1-15的步骤再进行1次质粒
大量提取。18)将两次提取的质粒混合，进行限制性内切酶酶切鉴定。实施例6.细胞转染293T细胞用含10%胎牛血清的含双抗DMEM高糖培养基37°C ,5% CO2饱和湿度培 养箱内培养至对数生长期，用2. 5g/L胰酶消化后，以1. OX IO6个细胞(6mL)接种于60mm培 养皿中，待生长至80 %融合时开始转染。依据PEI转染方法进行细胞转染，取PEI 50 μ L，加 入到930 μ L含双抗DMEM高糖培养基中，另取8. O μ g重组质粒加入到上述培养液中，轻轻 混勻，室温，孵育15min，然后将Iml PEI/DNA复合物加到培养瓶中并轻轻摇动使混合均勻， 同时以PJW4303空质粒转染细胞作为阴性对照，IOh后可更换不含血清含双抗的DMEM培养 液。继续培养72h后进行Western blot分析。分析结果如图4所示。图中显示gpl20的 重组DNA疫苗质粒转染293T细胞后可在上清和裂解产物中检出特异性蛋白的表达，其分子 量约为120kDa，阴性对照空载体PJW4303转染293T细胞的上清和裂解产物中没有特异性蛋 白存在。转染细胞收获吸取细胞上清液，2500rpm，室温，离心lOmin，吸取上清_20°C冻 存。用PBS (浓度10mM，pH7. 2)将细胞从培养皿中洗脱，收集细胞悬液，2500rpm，室温，离 心 lOmin，弃上清，加入裂解液(50mM Tris-HCl Ph7. 6,150mM NaCl，1 % Triton，用前加入 2% IOOmM PMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育20min, 12000rpm，4°C，离心60min,收集上清 液，-20°C冻存。实施例7. gpl20核酸疫苗的免疫原性的研究方法在编码共有氨基酸序列的核酸疫苗构建和表达成功后，通过对试验动物家兔进行 核酸疫苗免疫，检测核酸疫苗的免疫原性。用ELISA和Western blot等方法，检测gpl20 抗原特异的抗体免疫应答。通过病毒中和试验，测定该核酸疫苗诱导产生的抗体对HIV感 染的保护作用。由于免疫家兔可以产生大量的免疫血清，可以足够进行抗体检测的研究。因此，在
8本发明涉及免疫保护的研究中，将用家兔免疫作为动物模型。新西兰兔免疫，实验设计见表1 表1 gpl20疫苗和空载体免疫家兔和分组 肌肉注射、活体基因导入方式免疫，保证针头插入深度2mm，注射后立即于注射部 位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内电转染(技术参数电压100V，脉冲次数正反各6 次，波宽60ms，频率60Hz)，以兔子腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于每次免疫前和末 次免疫后两周采血及收集血清。用ELISA方法和Western-blot法检测血清中gpl20特异 的抗体反应，评价gpl20核酸疫苗在家兔动物模型中诱导产生体液免疫的能力。实施例8.免疫应答检测8. IELISA检测血清中gpl20特异性抗体ConA(50y g/ml) 100 μ 1包被ELISA板，室温孵育lh，PBST (磷酸盐缓冲液加.05% Tween-20)洗5遍；用转染DNA的293T细胞上清液100 μ 1 (1 10， lug/ml)包被ELISA 板，室温孵育lh，PBST洗5遍；5%脱脂奶粉4度封闭过夜，PBST洗5遍；加适当稀释的免 疫兔血清100 μ 1 37°C孵育lh，PBST洗5遍；生物素标记的羊抗兔IgG(l 2000)，37°C孵 育 lh, PBST 洗 5 遍；HRP 标记链亲和素(1 8000)，37°C孵育 lh, TMB 显色 3. 5min ；2mol/ LH2SO4 50ul终止显色。450nm处读取吸光度(A)值。应用ELISA检测新西兰白兔血清gpl20抗体应答时间曲线如图5所示。图5中显 示gpl20核酸疫苗和空载体PJW4303分别免疫3只新西兰兔，于0，2，4，8周免疫，免疫前和 免疫后2周收集血清。箭头表示免疫时间点。由图可知，gpl20疫苗在第2次免疫后两周 即可检测到gpl20特异性抗体，第4次免疫后两周gpl20特异性抗体水平达到最高，表明 gpl20重组质粒疫苗可以有效的诱导免疫应答，且随着多次免疫，免疫应答强度提高。8. 2ffestern blot检测血清中特异性gpl20抗体1) gpl20核酸疫苗转染293T细胞裂解及上清，pJW4303转染293T细胞裂解及上清 20ul，加入5x上样缓冲液5μ 1，100°C，煮沸IOmin。2)首先制备10%的分离胶(4ml蒸馏水，5ml 30%丙烯酰胺溶液，5. 7ml IMTris/ ClpH8. 8,150μ 1 10% SDS,150y 1 10%过硫酸氨，6μ1 TEMED)，灌胶，液面顶端加入水，室 温下聚合20 30min。3)倒弃水，再制备5%的积层胶(4. Iml蒸馏水，Iml 30%丙烯酰胺溶液， 750ullMTris/Cl pH 6. 8,60μ 1 10% SDS,60y 1 10%过硫酸氨，6μ1 TEMED)，在积层胶上 插入梳齿，待胶完全凝聚后，拔下梳齿。
4)将上述处理好的样品加入15%胶中进行电泳，20mA，lh，40mA，2h。5)胶上的蛋白转到PVDF膜上，100v，2h。6)转好的膜用5%脱脂奶粉封闭，37°C，lh。7)用IxPBST洗膜两次。8)将膜浸在1 500稀释的血清中，4°C，过夜。9)弃掉血清，用IxPBST洗膜6次，每次lOmin。10)弃掉洗液，加入1 10000稀释HPR标记的羊抗兔IgG，37°C，lh。11)弃掉二抗，用IxPBST洗膜6次，每次lOmin。12)发光剂加到膜上，暗室显影。应用Western-blot检测新西兰白兔血清gpl20抗体应答，如图6所示。由图可知， gpl20重组疫苗质粒AE. gpl20或者BC. gpl20或者ThB. gpl20诱导的兔免疫血清可以交叉 识别gpl20重组疫苗质粒AE. gpl20或者BC. gpl20或者ThB. gpl20的转染产物，表明虽然 AE. gpl20或者BC. gpl20或者ThB. gp 120虽然来自不同的进化分支，但是含有相同/相近的
抗原决定基。实施例9.病毒中和试验实验研究9.1假型病毒的构建1)第一天上午293T细胞传代至细胞培养皿，3*106个细胞，6ml培养基。2)第二天上午观察293T生长至50% 80%，进行转染。3)取 7ug SF162-Env 和 14ug pSG3_dEnv 加到 1. 5mlEp 管中，加入 900ul 的 DMEM， 加入105ul的转染试剂PEI，震荡混勻，室温静置20min ；转移至细胞培养皿；轻轻晃勻；细 胞培养箱培养4 6h后，弃去培养液，更换9ml新培养液，继续培养48h。4)第四天上午吸取细胞培养上清，加入Iml FBS,0. 45um滤器过滤，4度保存；细 胞培养皿中加入9ml新培养液，继续培养24h。5)第五天上午吸取细胞培养上清，加入Iml FBS，0.45um滤器过滤；与第4天的 滤液混勻，分装，每Ep管1ml，冻存在-80度；TCID50待测。9.2TCID50 检测1)取7支1.5ml的Ep管，编号1 7，每管加入480ul的培养基。2)在1号Ep管中加入120ul的假型病毒，振荡器充分混勻。3)从1号Ep管中取120ul至2号Ep管，振荡器充分混勻。4)依次至6号Ep管，振荡器充分混勻，吸弃120ul。5)应用EDTA-胰酶消化溶解TZM-BL细胞，制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度至 lX105/ml。6)在1 7号Ep管中，每管加入480ul的TZM-BL单细胞悬液，振荡器充分混勻。7)从1号Ep管吸取200ul加至IA ID ；从2号Ep管吸取200ul加至2A 2D ； 从7号Ep管吸取200ul加至7A 7D。8)将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中。9)培养48h后取出培养板，轻轻甩干，去掉培养基。10)每孔加入90ul不含血清的DMEM。11)每孔加入 90ul Bright-Glo Luciferase。
12)2min后用排枪吸取96孔中的液体至白板中。13)上机检测，获得包括cell control在内的每个样品孔的RLU (Relative Light Unit)。14)以 cell control 对照的 RLU 的 2. 5 倍作为 cutoff，按照 SPEARMAN-KARBER 法 计算 TCID50。如图7所示，表达SF162-Erw的HIV-1假型病毒的TCID50/ml是28000，说明假型 病毒制备成功。9. 2病毒中和试验1)96孔细胞培养板，A3 AlO中加入67. 5ul培养基含10% FBS和P/S (青 霉素 100U/ml，链霉素 0. lmg/ml)的高糖 DMEM(Hyclone)添加 DEAE-dextran (40ug/ml)。2)A3 A4中加入7. 5ul来自AE. gpl20免疫的灭活兔血清，混勻；A5 A6中加入 7. 5ul来自BC. gpl20免疫的灭活兔血清，混勻；A7 A8中加入7. 5ul来自ThB. gpl20免疫 的灭活兔血清，混勻；A9 AlO中加入7. 5ul来阳性对照血清(UMASSserum)，混勻。3)在 B3 B10、C3 C10、D3 D10、F3 F10、G3 G10、H3 HlO 中加入 50ul 的培养基。4)从A3 AlO中吸取25ul至B3 B10，混勻，更换tip头，依次至H3 H10，弃 去 25ul。5)在第1纵孔(1A 1H)中加入IOOul的培养基；在第2纵孔(2A 2H)中加入 50ul的培养基。6)稀释假型病毒至4000TCID50/ml，在第2纵孔(2A 2H)至第10纵孔(10A 10H)中加入50ul的假型病毒稀释液。7)置于细胞培养箱中孵育60min。8)制备TZM-BL单细胞悬液，调整至lX105/ml。9)孵育结束后，取出96孔细胞培养板，每孔加入IOOul的TZM-BL单细胞悬液。10)置于细胞培养箱中孵育48h。11)孵育结束后，取出96孔细胞培养板，轻轻甩干，去掉培养基。12)每孔加入90ul不含血清的DMEM。13)每孑L力口入 90ul Bright-Glo Luciferase。14)2min后用排枪吸取96孔中的液体至白板中 15)上机检测，获得包括cell control在内的每个样品孔的RLU。16)计算每个稀释度的抑制效率=1-(sample-Cell control)/(Virus controI-Ce11control)。如图8所示，阳性对照UMASS serum可以中和SF162假型病毒；与UMASS serum比 较，BC. gpl20和ThB. gpl20免疫血清也可以中和SF162，但是AE. gpl20免疫血清不能中和 SF162。由于SF162是来自B亚型的病毒，因此上述血清中和能力的差异反应了 Env蛋白的 变异对中和作用的影响，也说明了 AE. gpl20、BC. gpl20和ThB. gpl20诱导的免疫应答的有 效性(具有中和作用)和特异性(中和作用具有亚型上的差别)。本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。实施例中所涉及的试剂信息如下表
Taq酶Promega 公司
T4DNA连接酶Promega 公司
DNA marker(DL 3000)大连宝生物公司
限制性内切酶BamH I，Pst I和Sac IFermentas 公司
DNA凝胶回收试剂盒大连宝生物公司
DMEM高糖培养基Hyclone 公司
RPM1640细胞培养液Hyclone 公司
胎牛血清Gibico公司
质粒小量提取试剂盒Qiagen公司
粒大量提取试剂盒Qiagen公司
PEIInvitrogen 公司
HRP标记的链亲和素SouthernBiotech 公司
HRP标记的羊抗兔IgGSouthernBiotech 公司
生物素标记的羊抗兔IgGSouthernBiotech 公司
TMB片剂Sigma公司
权利要求
中国HIV-1流行病毒株包膜蛋白gp120共有氨基酸序列，序列为SEQ ID NO.1、SEQID NO.2或SEQ ID NO.3。
2.经密码子优化的编码中国HIV-I流行病毒株包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列的基因 序列，序列为 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6。
3.HIV-lgpl20核酸疫苗，其特征在于该疫苗含有权利要求2所述的经密码子优化的编 码中国HIV-I流行病毒株包膜蛋白gpl20共有氨基酸序列的基因序列和真核表达载体。
4.根据权利要求3所述的核酸疫苗，其特征在于所述的真核表达载体为经内切酶NheI 和BamHI切割质粒pJW4303得到的载体大片段。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗。本发明应用多序列比对分析，获得中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gp120共有氨基酸序列；应用人工合成的方法制备编码共有氨基酸序列的gp120基因片段，该基因经密码子优化，兼顾了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好；在此基础上，构建了由gp120基因和真核表达载体pJW4303组成的HIV-1gp120核酸疫苗。该核酸疫苗可以应用于动物和人体免疫，也可以应用于gp120蛋白的表达和生产。
文档编号A61P31/18GK101885760SQ20101012614
公开日2010年11月17日 申请日期2010年3月16日 优先权日2010年3月16日
发明者卢山, 张明顺, 王世霞, 黄祖瑚 申请人:王世霞;张明顺;黄祖瑚;卢山