专利名称：一种重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，涉及一种重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的制备方法及其用途
背景技术：
过敏性哮喘是危害严重的公共卫生问题，其发病率及死亡率呈持续上升趋势。据 WHO估计，全世界现有3亿的哮喘患者，其中50%以上的成人和至少80%的儿童患者均由过敏因素诱发，每年有25万以上的患者死于哮喘，哮喘已不仅是发达国家的公共卫生问题， 几乎所有国家都深受其害。统计报道，我国大陆哮喘的发病率尚较低，为2.1% (不包括香港6. 2%和台湾2. 6% )，但我国哮喘患者的死亡率却高达36. 7/10万，位居全球第一。此外，我国哮喘的发病在各地区之间的差异可达10倍，以重庆最高，西藏最低，并且在未来十年内，哮喘的发病将持续上升，由于我国人口基数大，哮喘的发病率上升2个百分点，将增加2千万以上的发病人数。研究显示，过敏性哮喘可以由多种因素诱发，其中环境中存在的各种变应原是其主要诱发原因。这些变应原包括尘螨、动物的皮屑、花粉和霉菌等。在温湿环境中，霉菌是引起过敏性疾病的主要诱因。据报道，在美国的南部，30%的过敏患者对多种霉菌敏感。多主枝孢霉(Cladosporium herbarum)就是一种主要引起过敏性疾病的霉菌，它不仅是一种主要的室内过敏原，也是夏秋两季的主要室外过敏原。多主枝孢霉含有多种变应原蛋白，其中Cla h8变应原蛋白是其主要变应原蛋白。 57%以上多主枝孢霉过敏患者血清中的IgE抗体可以特异性的识别Cla h8变应原蛋白。皮肤点刺实验结果显示Cla h8可以引起患者出现皮肤的红肿。目前临床上对多主枝孢霉过敏患者的诊断和特异性抗原免疫治疗采用的是传统的多主枝孢霉浸出液，其含有多种抗原成分，且相对效价和特异性抗原水平存在明显的差异，很难进行标准化定量，容易引起患者出现诊断或治疗性过敏反应，因此限制了对其诊治应用。而重组的多主枝孢霉变应原蛋白不仅产量高，生产条件恒定，有利于进行标准化，更适合进行临床诊断与治疗。
发明内容
本发明的目的在于针对多主枝孢霉变应原浸出液进行过敏性疾病的诊断与治疗中的不足，提供一种重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的制备方法及其用途。本发明通过基因工程手段，从多主枝孢霉的组织中提取其主要变应原蛋白Cla h8 的编码基因，构建表达载体，在大肠杆菌中诱导表达重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8，本发明制得的重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8可用于多主枝孢霉引起的过敏性疾病的诊断与治疗。具体而言，本发明提供了重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8的表达方法，其特征在于，其包括如下步骤(1)从培养的多主枝孢霉菌体中提取总RNA，通过RT-PCR合成cDNA ；(2)合成引物:Cla h8-S 5-CCCATATGCCTGGCCAGCAAGCAA-3Cla h8-as 5-CGGGATCCTTATCTGGTGGTGTAACCA-3(3)以cDNA为模板，通过PCR获得多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8编码基因片段； 所述的Cla h8编码基因如SEQ ID No 1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No :2所示；(4)将编码基因克隆入表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌，然后诱导其表达目的蛋白；(5)采用缓冲液对rCla h8包涵体进行洗涤，将其提纯后，采用谷胱甘肽还原系统对其复性，从而获得重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8 ；(6)免疫学方法鉴定重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8免疫原性。本发明中，所述的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述cDNA基因重组，形成适宜表达质粒。本发明优选表达载体为原核表达载体；本发明更优选原核表达载体为 pET19b。本发明中，所述的宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。本发明优选宿主菌为大肠杆菌BL21MarTM(DE;3)pLySS，培养基为LB液体培养基，培养温度为20 37°C，培养时间6 16小时。本发明中，步骤(5)所述诱导剂为IPTG。培养的菌体达到合适的浓度后以IPTG进行诱导表达，诱导条件为IPTG浓度为0. 1 ImM，诱导温度为20 37°C，诱导时间为2 16小时。本发明中，步骤(6)所述的纯化方法为将多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8表达工程菌在37°C诱导3小时后，离心收集菌体，置于冰上超声裂解，然后加入溶菌酶30°C振摇30 分钟，离心，收集包涵体蛋白沉淀，以Novagen公司的refolding kit对包涵体蛋白进行提纯与复性后，HOOOrmp离心20分钟，收集上清，冰箱保存。本发明中，采用Dolt bolt与Wfestern blot法检测rCla h8的免疫原性。本发明中，采用的表达载体、宿主细胞均为市购。本发明与现有技术相比较，具有如下优点本发明从培养的多主枝孢霉中提取总RNA，扩增出多主枝孢霉主要变应原蛋白Cla h8的编码基因，从而构建表达载体。转入大肠杆菌诱导后，重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达，经过简单的洗涤后，可以获得高纯度的蛋白。以谷胱甘肽还原系统对其进行复性后，可获得具有生物学活性的可溶性重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8，可用于多主枝孢霉引起的过敏性疾病的诊断和治疗，本发明避免了天然提取物的非单一性及标准化难的障碍。
图1，PCR扩增多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白编码基因电泳图。图2，多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白表达载体pET19b_cla h8的Hind III单酶切鉴定电泳图。图3，多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白表达载体pET19b_cla h8的BamHI与NdeI双酶切鉴定电泳图。图4，多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白编码基因与AY191816序列对比。图5，多主枝孢霉变应原ClahS蛋白氨基酸序列对比。图6，重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白在大肠杆菌中表达检测SDS-PAGE电泳结果，其中，M为低分子蛋白marker，1为未诱导的细菌裂解液，2为经ImM的IPTG 37°C 诱导3小时后，细菌裂解液。图7，纯化后重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白包涵体蛋白SDS-PAGE检测电泳结^ ο图8重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白包涵体蛋白复性重构后SDS-PAGE检测电泳结果。图9，重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白抗原特异性Dolt blotting检测其中，1为CBB染色，2为与多主枝孢霉过敏病人血清IgG反应结果，3为多主枝孢霉过敏病人血清IgE反应结果。图10，重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋western blot检测，其中，M为低分子量蛋白marker，1为重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白经CBB染色，2，3，4分别为重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白与多主枝孢霉过敏病人血清中IgE反应结果。
具体实施方案实施例1多主枝孢霉培养将保存的多主枝孢霉(Cladosporiumherbarum)菌株(ATCC 6056)接种于 IOOml YPD 培养基(10g/L yeast extract, 20g/L peptone, 20g/L glucose), ρΗ6· 0 6. 5), 25
培养6天，离心去上清，PBS缓冲液洗涤菌体三次，-80°C保存备用。实施例2多主枝孢霉变应原Cla h8编码基因获得按照foieasy Total RNA试剂盒的使用说明，提取多主枝孢霉菌体的总RNA，使用GeneAmp RNA PCR Kit进行RT-PCR，获得cDNA。根据GeneBank公布的多主枝孢霉变应原Cla h8的mRNA序列(AY191816)，设计引物并加入NdeI和BamHI酶切位点Cla h8_S 5-CCCATATGCCTGGCCAGCAAGCAA-3 和 Clah8_as 5-CGGGATCCTTATCTGGTGGTGTAACCA-3 以 cDNA 为模板，PCR扩增编码多主枝孢霉变应原Cla h8成熟肽段的基因片段，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，其大小为804bp(图1)。实施例3重组表达质粒pET19b_Cla h8的构建以 QIAquick PCR Purification Kit 提纯 PCR 扩增产物，再以 NdeI 和 BamHI 酶切 PCR扩增产物插入pET19b载体中。转入大肠杆菌JM109，将菌液涂布于LB琼脂板(含氨苄青100 μ g/ml，氯霉素34 μ g/ml)，37°C过夜培养后，挑取克隆，抽提重组质粒进行双酶切鉴定，结果显示目标条带与Cla h8基因片段的PCR产物大小一致，说明成功构建了多主枝孢霉变应原Cla h8的重组质粒pET19b-Cla h8(图2，图3)由上海英俊生物有限公司对该重组质粒进行测序鉴定，并采用Vector NTI 10软件，推定氨基酸序列，并与Genebank中公布的序列(AY191816)进行比对。rClahS的核苷酸序列缺少N末端的前序列(由51个核苷酸组成)和C末端非编码区(由63个核苷酸组成)，并有9个核苷酸位点与AY191816不同， 但未引起氨基酸残基的改变(图4，图5)。实施例4重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的表达重组质粒pET19b_Cla h8转化大肠杆菌BL21Mar (DE3)pLysS后，涂布于LB琼脂板(含氨苄青100yg/ml，氯霉素34yg/ml)，37°C温箱中培养过夜。挑选单一菌落入800ml LB培养液(含氨苄青50 μ g/ml，氯霉素34 μ g/ml)中，37°C 220rmp振摇，培养至0D600约为0. 5时，加入ImM的IPTG，37°C诱导3小时，4°C 8000rpm离心10分钟，弃上清，收集细菌沉淀。，经12. 5%的SDS-PAGE检测，IPTG诱导的菌液在分子量大约37kD处出现目的蛋白表达条带(图6)。实施例5重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的重新折叠本发明的多主枝孢霉变应原Cla h8以包涵体的形式表达。细菌沉淀中，加入40ml IB wash buffer和40 μ 1 IM PMSF，冰上超声后，加入溶菌酶(终浓度为200 μ g/ml)混勻后，30°C IOOrmp振摇30分钟后，再次冰上超声，离心lOOOOrmplO分钟；弃上清，加入40ml IB wash buffer重新悬浮后，IOOOOrmp离心10分钟，重复该步骤，直至沉淀的颜色一致。 经12. 5%的SDS-PAGE检测，多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的包涵体纯度可达到98%以上 (图 7)。将悬浮后的包涵体转入一个已知重量的50ml离心管中，IOOOOrmp离心20分钟； 弃上清，并擦净壁上残余的液体，称量后，加入适量的IB solubilizationbuffer,使其终浓度为20mg/ml ；用吸管反复吹打直至包涵体蛋白全部溶解后，室温静置15分钟；室温 IOOOOrmp离心10分钟；将其上清转入透析袋中，进行透析。将透析袋放入含有0. ImM DTT的Dialysis buffer中，4°C透析3小时后，重复该透析过程一次；更换不含DTT的Dialysis buffer，4°C透析3小时后，更换Dialysis buffer 后，4°C透析过夜；将透析袋放入Redox refolding buffer中，继续4°C透析8小时以上，室温再透析1小时后，4°C冰箱保存。经12. 5%的SDS-PAGE检测，复性重构的多主枝孢霉变应原Clah8蛋白分子量为37KDa，纯度可达到98%以上(图8)。实施例6重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白含量的测定使用DC Protein Assay试剂盒检测重组蛋白含量。牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白，以 PBS 分别配制不同浓度 BSA 标准液(1. 5mg/ml，lmg/ml，0. 5mg/ml，0. 25mg/ml，0mg/ ml)，建立BSA蛋白浓度标准曲线。根据标准曲线，计算重组蛋白浓度为1.8mg/ml。每升细菌可制备22. 5mg多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白。实施例7重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白抗原特异性Dolt blotting检测分别将多主枝孢霉浸提物2 μ g和重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白2 μ g加样于硝酸纤维素膜上，室温干燥后，加含3% BSA的PBS，湿盒内室温封闭1小时；吸弃封闭液， 分别加对多主枝孢霉过敏的哮喘病人血清(1 2稀释和1 100稀释)，4°C孵育过夜； PBST 洗膜，30 分钟；分别加 HRP-Mouse Anti-Human IgE 抗体(1 250 稀释)和 HRP-Mouse Anti-Human IgG抗体(1 250稀释)，室温孵育1小时；PBST洗膜，30分钟，以Konica Immunostaining HRP-100显色，20min后终止反应。Dolt blotting结果显示多主枝孢霉过敏的哮喘病人血清中的IgE抗体和IgG抗体可以与多主枝孢霉浸提物和重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白发生特异性结合，说明重组多主枝孢霉变应原ClahS蛋白与天然蛋白具有相同的免疫活性(图9)。实施例8重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白抗原特异性flfestern blotting检测取6yg多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白，加等体积样品缓冲液、1/10体积β-巯基乙醇，混勻后95°C变性5分钟，HOOOrpm离心10分钟，上清用于SDS-PAGE上样。电泳结束后，将蛋白电转到PVDF膜上。电转结束后，PBST洗膜30分钟后，加含5%脱脂奶的PBS， 湿盒内室温封闭1小时；吸弃封闭液，加对多主枝孢霉过敏的哮喘病人血清(1 2稀释)， 4°C孵育过夜；PBST洗膜，30分钟；加HRP-Mouse Anti-Human IgE抗体(1 250稀释)，室温孵育 1 小时；PBST 洗膜，30 分钟，以 Konica Immunostaining HRP-100 显色，20min 后终止反应。Westernblot结果显示3个对多主枝孢霉过敏的哮喘病人血清中的IgE抗体都与多主枝孢霉变应原ClahS蛋白发生不同程度的反应，其中2号病人反应性最强(图10)。
权利要求
1.一种重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤1)从培养的多主枝孢霉菌体中提取总RNA，通过RT-PCR合成cDNA；2)合成引物Cla h8-S 5-CCCATATGCCTGGCCAGCAAGCAA-3 Cla h8-as 5-CGGGATCCTTATCTGGTGGTGTAACCA-33)以cDNA为模板，通过PCR获得多主枝孢霉变应原蛋白Clah8编码基因片段；4)将编码基因克隆入表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌，然后诱导其表达目的蛋白；5)采用缓冲液对rClah8包涵体进行洗涤，将其提纯后，采用谷胱甘肽还原系统对其复性，获得重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8 ；6)免疫学方法鉴定重组多主枝孢霉变应原蛋白Clah8免疫原性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，Clah8编码基因如SEQID No 1所示；所编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述cDNA基因重组，形成适宜表达质粒。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为原核表达载体。
5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为pET19b。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的宿主菌不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21Star (DE3) pLysSo
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，宿主菌的培养基是LB液体培养基，培养温度是20 37°C，培养时间6 16小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，菌体达到合适的浓度后用IPTG诱导表达，诱导条件为IPTG浓度为0. 1 ImM，诱导温度为20 37°C，诱导时间为2 16小时。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤幻中的纯化方法为将多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8表达工程菌在37°C诱导3小时后，离心收集菌体，置于冰上超声裂解，然后加入溶菌酶30°C振摇30分钟，离心，收集包涵体蛋白沉淀，以Novagen公司的 refolding kit对包涵体蛋白进行提纯与复性后，HOOOrmp离心20分钟，收集上清，冰箱保存。
11.权利要求1的方法制得的重组多主枝孢霉变应原蛋白Clah8在制备诊断与治疗多主枝孢霉引起的过敏性疾病制剂中的用途。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的制备方法及其用途。本发明从培养的多主枝孢霉提取RNA，通过PCR获得多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的编码基因后，构建变应原Cla h8蛋白的表达载体pET19b-Cla h8。经表达纯化及鉴定，证实制得的重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白可与多主枝孢霉过敏患者的血清中IgE和IgG抗体特异性结合，具有与天然多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白相同免疫活性。本发明方法制得具有生物学活性的可溶性重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白，能避免天然提取物的非单一性及标准化难的障碍。制得重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白可制备诊断和治疗多主枝孢霉引起的过敏性疾病的制剂。
文档编号A61P37/08GK102212531SQ201010141209
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月2日 优先权日2010年4月2日
发明者付永锋, 冯萌, 程训佳 申请人:复旦大学