B细胞cd22胞外抑制性肽段b2285疫苗的制备的制作方法

专利名称：B细胞cd22胞外抑制性肽段b2285疫苗的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术药物和生物治疗学领域，涉及一种具有抑制B细胞效应的小 鼠B细胞表面特征性分子⑶22 (mCD22)胞外肽段B2285，应用B2285制备的疫苗或药物组合 物可用于治疗B细胞参与或主要介导的免疫性疾病，尤其是抗心肌抗体检测为阳性的免疫 性心肌病和自身抗体为阳性的系统性红斑狼疮。
背景技术：
自身免疫病是由于自身免疫失调所致，目前治疗上以对症和应用免疫抑制剂等缓 解症状为主，无特异性安全治疗方法。B淋巴细胞异常激活以及致病性自身抗体的生成是自 身免疫病的重要特征之一，以B细胞为靶点治疗B细胞异常增殖活化介导为主的疾病如系 统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎和非霍奇金淋巴瘤(NHL)等自身免疫相关性疾病已 引起人们越来越多的关注。⑶19、⑶20与⑶22均为B细胞表面特异性受体分子，在B细胞生长、分化和细胞 内信号转导过程中起重要作用，是目前应用单克隆抗体治疗B细胞异常增殖活化的疾病较 准确的靶分子。由于CD22单克隆抗体具有以下特点(1)与CD19单抗相比，CD22单抗在 异常增殖的B细胞上表达稳定，且仅表达于成熟的B细胞表面，不表达于非B细胞、骨髓细 胞、造血干细胞和非造血细胞，不会抑制新B细胞生成；(2)与⑶20单抗相比，⑶22单抗可 内化配体，在一定程度上降低抗体介导的细胞毒作用。因此，CD22已逐渐成为B细胞异常 激活疾病治疗研究的重要靶分子。虽然过去研究报道认为⑶22为B细胞抑制性受体，应用抗⑶22抗体封闭可明显 降低B细胞表面受体激活的B细胞反应阈值，然而Leonard等观察鼠源性抗CD22抗体(LL2) 和人源性抗⑶22抗体(Epratuzimab)治疗非霍奇金氏病的临床前和临床效应发现，抗⑶22 抗体可在一定程度上清除异常B细胞。最近研究证实，抗⑶22单克隆抗体(⑶22McAb)可 清除致敏的B细胞、抑制自身抗体产生，阻止或缓解SLE和类风湿性关节炎等自身免疫病的 发生发展，而且我们新近研究发现，⑶22McAb可以抑制ANT诱导的免疫性DCM小鼠B细胞 增殖和抗ANT自身抗体的产生，在疾病中期应用可在很大程度上逆转DCM的进程。在现有的治疗SLE的研究中，抗⑶22单抗Epratuzunab虽然显示了抑制B细胞功 能效应，但由于它作用时间短、给药频繁、成本高，并且在制作过程需引入外源性蛋白，对机 体仍有一定的免疫毒性，因而目前在临床治疗中难以推广。多肽治疗性疫苗因其具有化学 性质稳定、治疗特异性高、作用时间长、治疗费用低、无需反复给药、安全性高和患者依从性 好等特点，已成为近年来备受关注的新型生物治疗技术。免疫系统针对机体特定分子的不同抗原表位可以产生不同的抗体，这些抗体结合 到靶分子的不同功能表位可以产生不同的生物学效应。上述抗CD22McAb对B细胞产生截然 相反的作用让我们认识到，针对CD22分子不同抗原表位的抗CD22McAb与CD22结合后可产 生抑制/激活两种不同效应，因此，如果我们能筛选出具有抑制作用的mCD22胞外肽段制备 多肽疫苗，主动免疫患有免疫性疾病动物后将产生具有治疗效应(抑制B淋巴细胞)的抗肽抗体，既具有化学性质稳定、治疗特异性高、作用时间长、治疗费用低、安全性高等特点， 又可降低异己蛋白抗体(CD22McAb)的免疫原性，减少其毒性副作用，成为治疗自身免疫病 一种新的策略。动物医学实验都是为人类疾病的治疗服务的。由于白细胞分化抗原在进化上较保 守，小鼠和人的CD22蛋白分子具有高度同源性(经NCBI中blast数据库分析，二者评分为 1025，E值为0)，且其空间结构类似。因此，借用小鼠模型研究出的抑制性肽段在人CD22分 子上找到相对应的人源性序列，对临床治疗B细胞相关疾病具有重大社会和经济价值。

发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠B细胞mCD22胞外抑制性肽段，通过该肽段制备的 疫苗或药物组合物免疫机体，可以克服异己蛋白抗体(CD22McAb)的免疫原性，使之具有毒 性副作用少、疗效好、安全性高和使用方便等特点，对抗心肌抗体检测为阳性的免疫性扩张 型心肌病的治疗以及其他主要由B细胞介导或有B细胞参与的免疫性疾病(如系统性红斑 狼疮)等的免疫治疗及相关疫苗、药物的制备提供新的策略。为实现本发明的目的，本发明设计人将应用计算机表位预测，分析与蛋白细胞外 功能域重叠的CD22肽段序列，得到位于各个蛋白功能域的抗原表位序列，设计出不同的短 肽，将之与载体结合后免疫正常小鼠制备相应的抗mCD22胞外肽段抗体，观察各肽段抗体 对B细胞增殖、活化，以及生成自身抗体等影响，筛选出与抑制效应对应的肽段，制备B细胞 抑制性疫苗，然后通过观察B2285肽抗原疫苗对有B细胞和自身抗体参与或介导为主的自 身免疫病动物的治疗疗效，确定该B2285的有效性和安全性，为B细胞增殖活化介导为主的 自身免疫性疾病的治疗探索新的更精确靶点，并为治疗其它有B细胞参与免疫性疾病开创 新思路。本发明应用B细胞表面分子CD22胞外抑制性肽段B2285制备疫苗，该肽段选自小 鼠CD22分子氨基酸序列中由氨基端起始第85-93位连续的9个氨基酸，具体序列为Lys-Thr-Glu-Lys-Asp-Pro-Glu-Ser-Gluο一种与上述小鼠B细胞⑶22胞外抑制性肽段相似的人B细胞⑶22胞外抑制性 肽段，该肽段选自人CD22分子由氨基端起始第81-88位连续的8个氨基酸，具体序列为 Lys-Asp-Gly-Lys-Val-Pro-Ser-Glu，在空间结构上与权利要求1所述小鼠B细胞CD22胞 外抑制性肽段位于同一功能区域，具有高度同源性。应用B细胞表面分子mCD22胞外抑制性肽段B2285制备的疫苗含有生理学上可接 受的载体组合物和非特异性免疫反应增强剂。应用B细胞表面分子mCD22胞外抑制性肽段B2285制备的疫苗，其特征在于所述 的疫苗具有免疫调节治疗抗心肌抗体为阳性的免疫性心肌病和自身抗体为阳性的系统性 红斑狼疮等B细胞参与或主要介导的免疫性疾病的作用。其具体方案如下(l)mCD22胞外短肽筛选①功能性抗原表位肽段序列的选择通过计算机从Pubmed的protein数据库找到 小鼠B细胞⑶22分子氨基酸序列，序列号为P35329 ；应用国际公认的DNAStar软件对⑶22 分子的胞外氨基酸序列进行分析，依据肽段的亲水性、柔韧性、表面可及性单因素分析、主链柔性及二级结构预测来选择各项指标均较好的肽段，其中各单因素指标预测值高、二级 结构预测为转角、无规则卷曲并排除α-螺旋、β-折叠的肽段是抗原表位的可能性越 大。初步筛选出可能的抗原表位肽段后，再依氨基酸的抗原指数(表1)分别计算各肽段的 抗原指数之和，选择平均抗原指数较高的肽段作为待选肽段。由于过长肽段可能引起针对 B细胞的细胞免疫应答，因此选择长为7-9个氨基酸的肽段最为合适。通过上述方法，我们 选出3个待测肽段:Β2285、Β2287和Β2388 (表2)。
表1氨基酸的抗原指数
氨基酸抗原指数氨基酸抗原指数氨基酸抗原指数氨基酸抗原指数Gly-0192Thr0.034Glu0.116Tyr-0.116Ala-0031Cys-0184Gln-0106Trp-0.114Val-0006Met-0230His0.190Ser0. 000Leu0.034Pro0.116Lys006Asn0.048Ile-0009Asp0.065Arg0.102Phe-0. 09表2所选肽段编号、序列及平均抗原指数
肽段编号肽段序列位置氨基酸序列平均抗原指数
Β228585-93 Lys-Thr-Glu-Lys-Asp-Pro-Glu-Ser-Glu0.076
Β228787-93 Glu-Lys-Asp-Pro-Glu-Ser-Glu0.091
Β2388388-396 His-Asn-Arg-Lys-Pro-lie-Pro0.089②肽段的化学合成与鉴定首先按照上述预测的肽段序列采用化学固相合成法在 Pssm-8多肽合成仪上合成抗原多肽首先将氨基酸中的氨基用封闭基团保护起来，以氯甲 基聚苯乙烯树脂作为固相载体，将第一个氨基酸共价连接在固相载体上。在三氟乙酸的作 用下，脱掉氨基的保护基，将第一个氨基酸接到了固相载体上，然后已经被封闭氨基的第二 个氨基酸的羧基再与第一个氨基酸的氨基形成肽键，如此反复至目的肽段完全合成。然后 采用高效液相色谱法(HPLC)鉴定纯度(> 90% )，应用N/C段序列分析及蛋白酶水解法进 行氨基酸序列分析，决定合成的肽段氨基酸序列与理论值一致。(2)肽抗原疫苗的制备应用sulfo-smcc偶联法，以Qi3噬菌体病毒样颗粒(VLP，分子量为17KD)作为载 体蛋白、sulfo-smcc作为连接体，sulfo-smcc 一端与VLP的氨基相连，另一端与肽段的巯基 相连(要求所合成肽段其氨基端加半胱氨酸)，形成合成肽-Sulf0-载体结合物，其中合成 肽所需量与VLP中氨基等摩尔比例。在免疫动物前，将此含肽的结合物与弗氏佐剂(FAD) 充分混合乳化(第一次用完全弗氏佐剂，以后用不完全弗氏佐剂)。(3)具有抑制效应的肽段的鉴定①抗mCD22胞外肽段抗体制备、纯化及亲和性测定将制备好的待选肽段抗原以
5多点皮下注射法主动免疫正常近交系小鼠(湖北省实验动物中心提供)，共免疫4次(第0、 2、4、6周)，每次注射的免疫液中含肽量为50ug/只；采用ELISA法测定小鼠血清抗肽抗体 滴度，在第8周收集抗血清、应用饱和硫氨酸盐析沉淀法和免疫亲和层析法提纯抗肽抗体。②抗mCD22胞外肽段抗体对含有自身免疫病小鼠B细胞体外增殖、活化及生成自 身抗体的影响取小鼠新鲜脾脏，制备混合淋巴细胞悬液；观察在B细胞刺激剂LPS作用下 或与自身抗原肽共同作用下，抗B细胞mCD22胞外肽段抗体对混合淋巴细胞产生相对应的 特异性自身抗体的影响，亦即对B细胞生成自身抗体作用的影响。另外，新鲜取一部分混合 淋巴细胞悬液，应用流式细胞术分离悬液中的⑶19+B淋巴细胞(纯度> 98% )，然后采用 CCK8法(或CSFE法)检测抗B细胞mCD22胞外肽段抗体对B细胞增殖、活化的影响。根据上述检测结果筛选出具备抑制作用的抗肽抗体及其对应的B细胞mCD22胞外 肽段(功能性表位):B2285。(4)检测B2285肽抗原疫苗对有B细胞和自身抗体参与或介导为主的自身免疫病 动物的治疗疗效。如先进行体内实验观察所有肽抗原疫苗对疾病的治疗疗效，再行体外实验观察肽 抗原疫苗对B细胞和自身抗体的直接影响，同样可筛选出具有抑制效应抗肽抗体和对应的 肽段。本发明提供的肽段的有益效果是，应用该肽段制作的疫苗或治疗药物可以克服异 己蛋白抗体(CD22McAb)的免疫原性，具有毒性副作用少、安全性高、疗效好、制作成本低、 使用方便等特点，对有B细胞和自身抗体参与或主要由B细胞介导的免疫性疾病(如系统 性红斑狼疮)等的免疫治疗有重大社会和经济价值。


图IB细胞mCD22肽段疫苗对免疫性扩张型心肌病B细胞增殖活性的影响。*，与 对照组相比，P < 0. 05 ；#,与ANT组相比，P < 0. 05。图2各B细胞mCD22肽段疫苗对ANT诱导的免疫性心肌病小鼠左心室心肌组织和 超微结构的影响(第120天免疫后)。注A.小鼠心脏大体。B. HE染色后光镜下组织形态。 C.电镜下超微结构。图3B细胞mCD22肽段抗原疫苗诱导小鼠产生抗Bx抗体水平变化。图4抗B2285抗体和抗B2388抗体与B细胞mCD22分子的结合及内化。注A. ANT 组。B. ANT+B2285 组。C. ANT+B2388 组。D. ANT+IgG 组。E. PBS 组。图5抗Bx抗体对ANT诱导的免疫性心肌病小鼠B细胞体外增殖活性的影响。*， 与 ANT 组相比，P < 0. 05 ;#，与 PBS 组相比，P < 0. 05 ;Δ 与 ΑΝΤ+Β2285 相比，P < 0. 05。图6体外抗Bx抗体对ANT诱导的免疫性心肌病小鼠B细胞产生抗ANT抗体水平的 影响。*，与ANT组相比，P <0. 05 ；**，与ANT组相比，P <0.01 与PBS组相比，P < 0. 05 ； ##，与 PBS 组相比，P < 0. 01 ；Δ，与 ΑΝΤ+Β2285 组组相比，P < 0. 05 ；Δ Δ，与 ΑΝΤ+Β2285 组组 相比，P < 0. 01。图7Β2285免疫正常C57BL/6小鼠后产生的抗Β2285抗体水平(1 100，η = 10)图8抗Β2285抗体对MRL/lpr狼疮鼠B细胞体外活性增殖的影响。图8Α(由图8Αρ 图SA2、图SA3组成流式图)流式细胞术检测的一只小鼠3组细胞代表图。左上象限数字代表有活性的B细胞经刺激后有丝分裂所得子代⑶19+B细胞，因其用CFSE标记，所以每经过 一次有丝分裂，其荧光强度就会减少一半，在流式分析中位于原代CD19+B细胞的左侧。图 8B 3组细胞中有活性的⑶19+B细胞的平均水平，η = 10。*与LPS组相比，P < 0. 05 ；#与 抗B2285肽抗体+LPS组相比，P < 0. 05。图9抗B2285抗体对MRL/lpr狼疮鼠体外B细胞产生抗dsDNA抗体的影响。*，与 LPS组相比，P < 0. 05 ，与抗B2285抗体+LPS组相比，P < 0. 05。图10B2285肽诱导MRL/lpr狼疮鼠体内产生的抗B2285抗体。*，与同一时间点的 空载体组相比，P < 0.01。图11 B2285肽对MRL/lpr狼疮鼠体内抗dsDNA抗体生成的影响。与同一时间点 的SLE组相比，**P < 0. 01，*P < 0. 05 ，与同一时间点的空载体组相比，P < 0. 05。图12 B2285肽对MRL/lpr狼疮鼠尿蛋白的影响(mg/dl)。*，与同一时间点的SLE 组相比，P <0.01 ，与同一时间点的空载体组相比，P < 0. 05。图13 B2285肽对MRL/lpr狼疮鼠脾脏重量的影响。*，与SLE组相比，P < 0. 01 ； #，与空载体组相比，P < 0. Olo Sff 脾脏重量；BW 体重。图 14 由(图 14a、图 14b、图 14c、图 14d、图 14e、图 14f、图 14g、图 14h、图 14i 流 式图组成)流式细胞术检测的3组MRL/lpr狼疮鼠中其中一例B细胞示意图。图15 B2285肽对MRL/lpr狼疮鼠肾脏重量的影响。*，与SLE组相比，P < 0. 05 ； #，与空载体组相比，P < 0. 05。Kff 肾脏重量；Bff 体重。图16 B2285肽对MRL/lpr狼疮鼠肾脏病理学影响。A. HE染色后光镜下所见肾脏 组织病理学变化；B.免疫荧光检测的肾小球IgG型免疫复合物沉积；C.电镜下肾脏组织超 微病理学变化。
具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。实施例一 B细胞mCD22胞外抑制性肽段B2285的筛选及其对ANT诱导的免疫性扩 张型心肌病的治疗观察本发明B细胞mCD22胞外抑制性肽段的筛选及其对ANT诱导的免疫性扩张型心肌 病小鼠体内的影响1.材料与方法1.1实验动物选取近交系BALB/c小鼠40只，雄性，6周龄，体重16克左右，购于华中科技大学同 济医学院实验动物中心。实验动物均饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心清洁级 动物房。1. 2B细胞mCD22胞外肽段抗原疫苗的制备1. 2. IB细胞mCD22胞外肽段的设计从Pubmed中的protein数据库查询小鼠的B细胞表面特异性分子⑶22分子的 氨基酸序列，序列号为P35329 ；应用DNAStar软件对CD22胞外氨基酸序列进行分析，依据 肽段的亲水性，柔韧性，表面可及性单因素分析及二级结构预测选择抗原指数较高的肽段 B2285、B2287 和 B2388 (如表 2 所示)。
1. 2. 2B细胞mCD22胞外肽段的合成应用PSSM-8型多肽自动合成仪(PSSM-8型，Shimadzu公司，日本)，以固相法合 成法将准确称取的各个氨基酸合成为目的肽段，即B细胞mCD22的不同胞外肽段B2285、 B2287、B2388。采用高效液相色谱法(HPLC)鉴定纯度(> 90% )，应用N/C段序列分析及 蛋白酶水解法进行氨基酸序列分析，决定合成的肽段氨基酸序列与理论值一致。然后将合 成的各多肽用氮气吹干后，分装，-20°C保存。1. 2. 3B细胞mCD22胞外肽段抗原疫苗的制备应用sulfo-smcc偶联法，以Qb噬菌体病毒样颗粒(VLP，分子量为17KD)作为载体 蛋白、sulfo-smcc作为连接体制备肽抗原。具体步骤(1)活化sulfo-smcc 称取0. 75mg 的sulfo-smcc，溶于250ulPBS后加入0. 75ml的载体蛋白(浓度为0. 658mg/ml)，4°C反应 2h。(2)透析活化后在PH = 7. 2，含15%甘油，ImM EDTA的PBS中4°C透析过夜，换液后继 续透析4h。(3)连接短肽在500ul偶联缓冲液(PH = 7. 2，含15%甘油，ImM EDTA的PBS) 中加入短肽Img溶解充分后，加入Iml经VLP活化的smCC，4°C反应2h。(4)透析偶联后 在PH = 7. 2，含15%甘油，ImM EDTA的PBS中4°C透析过夜，换液后继续透析4h。透析后分 装，保存于-70°C。在免疫动物前，将肽抗原与弗氏佐剂(FAD)充分混合乳化(第一次用完 全弗氏佐剂，以后用不完全弗氏佐剂)。1. 3心肌腺嘌呤核苷(ANT)肽抗原的制备制备方法与B细胞mCD22胞外肽段相同。其序列为Pro-Ile-Glu-Arg-Val-Lys-L eu—Leu—Gln。1. 4实验动物免疫与分组将BALB/c小鼠随机分为五组(I)ANT组(η = 8)在实验开始的第1、14、30、60、 90、120天分别用ANT肽(10ug/g)进行多点皮下注射免疫。(2) ANT+B2285组(η = 8)在用 ANT肽各个时间点免疫的同时加用Β2285肽(2ug/g)进行免疫，方法同(1)。(3)ANT+B2287 组(η = 8)在用ANT肽免疫的同时加用Β2287肽(2ug/g)进行免疫，方法同(1)。(4) ANT+B2388组(η = 8)在用ANT肽免疫的同时加用Β2388肽(2ug/g)进行免疫，方法同(1)。 (5)对照组(η = 8)用不含肽的空白液进行免疫，方法同(1)。在第120天最后一次免疫 完后，处死所有小鼠。1. 5小鼠B细胞增殖活性的检测应用CCK-8法检测。首先采用流式细胞术，从一部分新鲜制备的单个核细胞悬液 中分离出⑶19+Β细胞，(纯度> 98% )。将分离出的B细胞以RPMI-1640调整浓度至1 X IO6 个/ml，依据CCK-8试剂盒(同仁化学研究所，日本)说明书，将B细胞移入96孔板，每孔加 CCK-810ul，37°C孵育4小时后，在酶联检测仪450nm处测定吸光度值㈧，以P/N(待测孔A 值/阴性对照A值)彡2.1为阳性。1. 6小鼠血清抗ANT自身抗体和抗B细胞mCD22胞外肽段抗体的检测每次免疫动物前均以眼眶后静脉丛取血法采小鼠静脉血，分离血清，-20°C保存， 备用。使用ELISA法检测小鼠血清抗ANT自身抗体水平将合成的ANT溶于0. lmmol/L的 碳酸缓冲液(PH为9.6)中，浓度调整为lug/lOOul，然后移入ELISA反应板中进行抗原包 被过夜；再以5%牛血清白蛋白进行封闭，37°C孵育2h ；洗涤后，加入待测血清，37°C孵育1 小时；加入预先用10%小牛血清按1 15000稀释后的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Sigma，美国)，孵育后再依次加入双氧水、显色剂四甲基联苯胺(TMB)和终止液2M H2S04。最后在在酶标仪上读取波长450nm时的光密度值(A值)。实验中设置空白对照、阴性对照和两个复孔，测A值时以空白对照调零。免疫动物 组血清与阴性血清的吸光度之比([标本A值-空白对照A值]/ [阴性对照A值-空白对 照A值])彡2.1为抗体检测阳性。在实验的第120天处死小鼠时，血清抗B细胞mCD22肽段抗体也采取上述ELISA 法检测。1. 7小鼠心脏形态学和病理学变化所有小鼠处死后立即取出心脏，置于10%的中性福尔马林液中固定。经常规脱水、 石蜡切片(厚度为约5um)、HE染色后，置于光镜观察。具体步骤如下(1)切片常规二甲苯 脱蜡，经各级乙醇至水洗二甲苯(5min) — 二甲苯(5min)—无水乙醇(2min) —95%乙醇 (Imin) —80% 乙醇(Imin) — 75% 乙醇(Imin)—蒸馏水(2min)。(2)苏木素染色 2min， 自来水冲洗。(3)盐酸乙醇分化30s。(4)自来水浸泡15min。(5)伊红染色液2min。(6) 常规脱水，透明，封片95%乙醇(Imin) —95%乙醇(Imin)—无水乙醇(Imin)—无水乙 醇(Imin) — 二甲苯(Imin) — 二甲苯(Imin)—中性树胶封固。按透射电镜超微病理标本常规取材要求，取小鼠一部分心脏左心室心尖部心肌组 织，立即用2.5%戊二醛41固定l-2h，4°C下0. IM磷酸缓冲液漂洗20min，1 %氯化锇后固 定1.5h，系列乙醇脱水，环氧树脂浸透包埋。标本在60°C下聚合18h，修块，超薄切片(Ium) 后，置于透射电镜观察、拍照。1. 8统计学分析采用SPSS13.0软件，数值变量均以均数士标准差表示，运用单因素方差分析 (One-way AN0VA)，P < 0. 05 为有统计学意义。2.结果2. IB细胞mCD22肽段疫苗对ANT诱导的免疫性扩张型心肌病小鼠B细胞增殖活性 的影响如图1所示，与对照组小鼠B细胞增值活性相比，ANT组、ANT+B2287组和 ANT+B2388组均明显增强(P均< 0. 05)，而ANT+B2285组明显减弱(P < 0. 05)；与ANT组相 比，ANT+B2285组小鼠脾B细胞增值活性明显减弱(P < 0. 01)，ANT+B2287组和ANT+B2388 组均无明显变化。2. 2小鼠B细胞mCD22肽段疫苗对ANT诱导的免疫性心肌病小鼠抗ANT自身抗体 产生水平的影响在实验过程中，对照组小鼠外周血中抗ANT抗体检测一直为阴性，余四组抗体在 第1、14、30、60、90和第120天均为阳性，并且ANT组、ANT+B2287组和ANT+B2388组抗体水 平均呈上升趋势，而ANT+B2285组初呈上升趋势，但在第90和120天时与ANT组相比，抗ANT 抗体水平有下降趋势，并且在第120天更为明显(P < 0. 05)。ANT+B2287组和ANT+B2388 组与ANT组相比一直无明显差异，如表3所示。表3mCD22肽段疫苗诱导免疫性心肌病小鼠体内产生抗Bx抗体水平及其对抗ANT 抗体生成水平的影响肽段编号
免疫方式
抗体滴度Cl 80)
抗ANT抗体
抗B；(抗体 2. 3mCD22肽段疫苗诱导免疫性心肌病小鼠体内产生抗肽抗体(抗Bx抗体)水平在实验的第120天处死小鼠时，接受mCD22肽段疫苗免疫的小鼠ANT+B2285组、 ANT+B2287组和ANT+B2388组均产生高水平的抗Bx抗体，对照组和ANT组均显示为阴性(见 表3)。2. 4B细胞mCD22肽段疫苗对ANT诱导的免疫性心肌病小鼠心脏形态学、组织病理 学及超微病理学的影响在第120天免疫后，对照组小鼠心脏无明显病理改变；与对照组相比，ANT组小鼠 心脏明显扩大，左心室心肌细胞肿胀肥大、部分溶解断裂，心肌间质纤维化并有炎性细胞浸 润，心肌超微结构中可见部分肌原纤维也溶解断裂、线粒体肿胀、空泡样变形、形态不一等 改变，类似扩张型心肌病病理变化。ANT+B2388组和ANT+B2287组小鼠心脏病变与ANT组相 似，但ANT+B2285组小鼠左心室心肌细胞肿胀较轻，未见明显心肌溶解断裂、心肌间质纤维 化及炎性细胞浸润，超微结构中心肌肌原纤维排列整齐，无溶解，线粒体形态比较均一，如 图2所示。本发明B细胞mCD22胞外肽段疫苗对ANT诱导的免疫性扩张型心肌病小鼠B细 胞体外增殖功能的影响1.材料与方法1. IANT诱导的免疫性扩张型心肌病小鼠模型的建立随机选取近交系BALB/c小鼠6只，雄性，6周龄，体重16克左右，购于华中科技大 学同济医学院实验动物中心。ANT肽抗原和免疫小鼠建立扩张型心肌病模型方法同前。在 第120天后，心肌病模型成立。实验过程中动物均饲养于华中科技大学同济医学院实验动 物中心清洁级动物房。1. 2小鼠B细胞mCD22胞外肽段抗原疫苗的制备方法同前。由于第一部分实验结果显示，B2285制备的疫苗疗效较显著，而B2287 与B2388制备的疫苗与ANT组无明显差别，因此在此部分主要制备B2285肽段疫苗，并选取 B2388作为阳性对照，观察二者对心肌病B细胞直接影响有无显著差别。1. 3抗B2285和抗B2388肽抗体的制备与提取1. 3. 1抗肽抗体的制备随机选取近交系BALB/c小鼠20只，雄性，6周龄，体重16克左右，购于华中科技大 学同济医学院实验动物中心。小鼠被平均分为两组，分别接受B2285与B2388抗原疫苗免 疫。免疫方法为皮下多点法，免疫时间为第1、14、30、60和90天。每次免疫前均经眼眶后 静脉丛取血，分离血清；采用ELISA法分别检测B2285抗体和B2388抗体滴度(方法同前)。 根据抗体滴度变化，在第90天免疫后，摘小鼠眼球取血，制备抗血清。实验过程中，另外选取6只同种小鼠作为空白对照，接受PBS免疫。1.3.2抗肽抗体的提取1.3. 2. 1饱和硫氨酸盐析沉淀法粗提抗体由于高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，破坏蛋白质表面水 化膜，使其溶解度降低而从溶液中沉淀出来，因此用不同浓度的盐溶液可沉淀各种溶解度 不同的蛋白质。应用饱和硫酸铵盐析沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白 质，将主要的免疫球蛋白从样品中分离出来。其基本步骤(1)将所制备的血清8ml与等体积生理盐水混合并在搅拌下缓慢滴入16ml饱和硫 酸铵于4°C沉淀3小时。(2) 3000rpm, 30min。用9ml生理盐水溶解沉淀，同上滴入6ml饱 和硫酸铵，4°C沉淀1小时。(3)同(2)离心后用6. 6ml生理盐水溶解后加3. 3ml饱和硫酸 铵，4°C沉淀1小时。(4)同(2)离心弃上清，PBS(PH 7.4)溶解沉淀，移入透析袋，于PBS中 透析，每6小时后换液一次，直至萘氏试纸测定透析袋外液无黄色为止。(5)收集透析袋中 溶液，分装后_70°C冰箱保存备用。1. 3. 2. 2亲和层析提纯IgG抗体葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同 IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-Si^pharose CL-4B 柱(GE公司，美国)上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清IgG抗体。其基本步骤 (1)用0. IM PH8. 0磷酸缓冲液浸泡SPA-S印haroseCL-4B凝胶，15min。按Ig干胶200ml 上述缓冲液充分洗涤凝胶(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)，装柱后用0. IM PH8. 0磷酸 缓冲液平衡。(2)标本可用硫酸铵粗提物，上样前用IM PH9. OTris液调整标本液PH至8. 1 或对平衡液透析过夜。(3)加样，一般按25 30mgIgG/g湿胶比例加样，室温作用15min， 0. IM PH8. 0磷酸缓冲液充分淋洗至淋洗液OD值为< 0. 02。(4)用不同PH的枸椽酸洗脱 液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgGl 一般用PH6. 0 ；纯化IgG2a用PH4. 0 ；纯化IgG2b用 0. IM PH3.0醋酸盐缓冲液或0. IM PH3. 0 Glycine-HCl缓冲液洗脱。本实验中检测到的IgG 亚类主要为IgG2a，用PH4. 0枸椽酸洗脱液洗脱。用PH3. 0或4. 0洗脱液洗脱时，用适量固 体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。(5)收集洗脱液，测OD值，根据实验需要透析除盐后 进行浓度、纯度和活性测定。1. 3. 2. 3免疫亲和层析法提纯目的IgG抗体将合成的B细胞胞外肽段抗原结合于亲和层析基质上，可以从血清中分离其对应 的抗体。其具体步骤(1)免疫亲和层析柱的制备按GE公司提供试剂盒说明书进行操 作。称2g预活化S印harose-4B，用约300mL lmmol/L(pH2 3)的HCl使之膨胀。分别取 30mg小鼠B细胞胞外肽段抗原溶于30ml生理盐水中，用0. lmol/L pH = 8. 3的Na2CO3缓冲 液(含0. 5mol/L NaCl)室温透析2h。将上述S印haroSe-4B与抗原混合，在室温搅动2h， 用 0. lmol/L pH = 8. 3 的 Na2CO3 缓冲液(含 0. 5mol/L NaCl)充分洗涤后，用 0. lmol/L pH 8. 0 Tris-HCl再洗1次，加IOmL同一缓冲液，于室温搅拌过夜。至此抗原-S印haroSe24B 亲和层析柱即制备成功。(2)186抗体的纯化将亲和层析柱，用0.02!1101/1 pH 7. 2的PBS 平衡后，缓慢上样，室温静置30min，然后用大量PBS流洗至流出液OD (280) ( 0. 02，然后用 0. lmol/L pH = 2 3甘氨酸-HCl缓冲液洗脱IgG抗体，流速60滴/min，分管收集，洗脱 液立即转至PH = 7. 2,0. 15mol/L的PBS中透析过夜。(3)纯化效果的判定采用紫外分光光度法测定蛋白含量，并计算出上样前后蛋白含量的比值、样品的回收量和回收率。1. 3. 3目的IgG抗体浓缩及保存采用真空冷冻干燥机(Bio-Rad，美国)将提纯的目的IgG抗体制成干粉状，贮存 于-20°C干燥处。1. 4小鼠脾脏单个核细胞的制备及分组处死已建立的免疫性扩张型心肌病小鼠模型，取小鼠新鲜脾组织，研磨后用淋巴 细胞分离液分离、制备脾单个核细胞悬液。将所得的单个核细胞用加入了 10%新生牛血清、 100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养基调节浓度至1 X IO6个/ml，然后移 Λ 24孔培养板并分组如下(I)ANT组加入ANT肽(lug/ml)，(2)ANT+B2285组加入等量 ANT肽的同时加入抗B2285抗体(10ug/ml)，(3)ANT+B2388组加入等量ANT肽的同时加入 抗B2388抗体(10ug/ml)，(4)ANT+IgG组加入等量ANT肽的同时加入非特异性羊抗小鼠 IgG(10ug/ml) (Sigma，美国)，(5)PBS组仅给予PBS作为阴性对照。以上各组均加用5ug/ ml美洲商陆(PWM) (Sigma，美国)刺激，并置于含5% CO2的37°C恒温细胞培养箱中孵育72 小时。1. 5抗Bx抗体与B细胞mCD22分子的结合及内化的观察根据抗原抗体特异性结合原理，先将已知抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记 物，通过化学反应用该荧光标记物检查细胞膜上或细胞内的相应抗体或抗原，再利用荧光 显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射发出明亮的荧光，从而确定抗体或抗原的性质及 定位。具体步骤包括将新鲜分离的淋巴细胞均勻涂在用0. 2%明胶处理过的载玻片上，以 用细胞固定液(冷丙酮无水乙醇=1 1)固定、10%正常羊血清封闭后，加入1 100稀 释的一抗，4°C过夜。洗涤后再加入1 100稀释的生物素化二抗，37°C下孵育30分钟。洗 涤后加入1 100稀释的SABC-FITC，37°C下孵育30分钟显色。最后以水溶性封片剂封片， 在荧光显微镜下观察400倍放大倍数下，每个玻片标本随机选择不出重复的5个视野，摄 像。其中ANT+B2285组，ANT+B2388组和阳性对照组的一抗分别为抗B2285抗体，抗B2388 抗体和非特异性山羊抗小鼠IgG(Sigma，美国)，以PBS代替一抗为阴性对照。1.6B细胞体外增殖活性的检测首先以流式细胞术分离新鲜制备的各组细胞悬液中的B淋巴细胞，然后采用 CCK-8试剂盒检测B细胞体外增殖活性，方法同前。1. 7单个核细胞培养上清液中抗ANT抗体的检测采用ELISA法检测，具体方法同前。每孔加入细胞上清液lOOul，每组均设3个复 ？L，以仅加PBS的淋巴细胞上清为阴性对照，在酶标仪上450nm处测定吸光度值㈧，以P/ N(待测孔A值/阴性对照A值)彡2. 1为阳性。1.8统计学分析采用SPSS13.0软件，数值变量以均数士标准差表示，运用单因素方差分析 (One-way AN0VA)，P < 0. 05 为有统计学意义。2.结果2. IB细胞mCD22胞外肽段抗原疫苗诱导小鼠产生抗Bx抗体水平变化如图3所示，在第14、30、60和90天，接受B2285和B2388肽段疫苗免疫的小鼠 抗Bx抗体检测均为阳性，且其滴度随免疫次数增加而上升；对照组小鼠抗Bx抗体一直为阴性。2. 2抗Bx抗体与B细胞mCD22分子的结合及内化如图4所示，ANT+B2285组、ANT+B2388组和ANT+IgG组细胞学图片各视野均可见 较多的结合Bx抗体而致细胞膜和/或细胞内染有绿色荧光的B细胞，并且以ANT+IgG组更 为明显；而ANT组和PBS组各视野细胞几乎未见绿色荧光。2. 3抗Bx抗体对ANT诱导的免疫性心肌病小鼠B细胞体外增殖活性的影响如图5所示，与ANT组相比，ANT+B2285组小鼠B细胞增殖活性明显下降(P < 0. 05)，而ANT+B2388组和ANT+IgG组与ANT组相比无统计学意义。2.4体外抗Bx抗体对ANT诱导的免疫性心肌病小鼠B细胞产生抗ANT抗体水平的 影响在实验过程中，PBS组细胞上清液抗ANT抗体检测为阴性，余四组均为阳性。另外， 与ANT组相比，ANT+B2285组的抗ANT抗体水平明显下降(P < 0. 05)，而ANT+B2388组和 ANT+IgG组均无明显变化，如图6所示。实施例二 B细胞mCD22胞外抑制性肽段B2285对B细胞主要介导的自发的MRL/ Ipr狼疮鼠的治疗观察本发明体外实验1.材料和方法1.1实验动物选取SPF级MRL/lpr雌性狼疮鼠6只，11-12周龄，体重36_40g，由中国科学院上 海实验动物中心提供；选取与MRL/lpr狼疮鼠同型对照的SPF级雌性C57BL/6小鼠10只， 10周龄，体重30-35g，由武汉大学医学院实验动物中心提供。实验动物均饲养于华中科技 大学同济医学院实验动物中心清洁级动物房。1. 2B2285抗原疫苗的制备方法同前。1. 3抗B2285抗体的制备与提取及其水平的检测方法同前。将B2285抗原疫苗以皮下多点注射法免疫所选取的雌性C57BL/6小鼠 (每次含B2285肽50ug/只)，时间为第0、2、4、6周；每次免疫前均经眼眶后静脉丛取血，分 离血清；第8周摘眼球取血，制备抗血清。采用ELISA法检测血清抗体滴度；应用饱和硫氨 酸盐析沉淀法和免疫亲和层析法提取血清中的抗B2285IgG抗体。1. 4MRL/lpr狼疮鼠脾脏单个核细胞的制备及分组处死MRL/lpr狼疮鼠，取小鼠新鲜脾组织，研磨后用淋巴细胞分离液分离、制备脾 单个核细胞悬液。将所得的单个核细胞用加入了 10%新生牛血清(Gibco，美国)、100U/ml 青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI-1640培养基调节浓度至2X IO6个/ml，分组如下(1) LPS 组加入 10ug/ml 的 LPS ； (2)抗 B2285 抗体 +LPS 组加入 10ug/ml 的 LPS 及抗 B2285 抗体；(4) IgG+LPS组加入10ug/ml的LPS及非特异性的抗小鼠IgG抗体(Sigma，美国)作 为阳性对照。1. 5B淋巴细胞增殖活性的检测1. 5. 1脾脏单个核细胞荧光标记及培养将羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE (Sigma，美国)溶于二甲基亚砜(DMS0，Sigma，美国)配制成浓度为2mmol/L的储存液，加入上述制备的单个核细胞中，每毫升细胞 中加入0. 5ulCFSE，使终浓度达到lumol/L。37°C染色10分钟后，用含10%新生牛血清的 RPMI-1640洗涤2遍，以每孔200ul接种于96孔板中，每组设置3个复孔，在37°C，5% C02 环境下培养72小时。1. 5. 2流式细胞学检测B细胞增殖活性72小时后取出细胞，1500rpm离心10分钟，用IOOul重悬细胞，每管加入IulPE标 记的抗小鼠CD19的抗体(eBioscience，美国)，4°C避光孵育30min。PBS洗涤2次后上流 式细胞仪，以CFSE为第一荧光(FLl)，PE为第二荧光(FL2)，先检测⑶19+B细胞数量及比 例，再以⑶19设门，计算PE-⑶19和CFSE双阳性细胞的平均荧光强度。1. 6脾单个核细胞培养上清液抗dsDNA抗体水平检测采用间接ELISA法检测抗体水平，操作过程按小鼠抗dsDNA的ELISA检测试剂盒 (ADI，美国)说明进行。以细胞培养液为空白对照。1.7统计学分析应用SPSS11.0软件，数值变量均以均数士标准差表示，运用单因素方差分析 (One-way AN0VA)，P < 0. 05 为有统计学意义。2.实验结果2. 1B2285免疫正常C57/b6小鼠后产生的抗B2285抗体水平如图7所示，与免疫前相比，第2、4、6和8周时小鼠体内产生的抗肽抗体进行性增
^^ ο2. 2抗B2285抗体对MRL/lpr狼疮鼠体外B细胞活性增殖的影响如图8所示，与LPS组相比，抗B2285抗体对MRL/lpr狼疮鼠体外B细胞活性增殖 有明显抑制作用(P < 0. 05)，而非特异性IgG干预的阳性对照组B细胞活性增殖较LPS组
无显著性差异。2. 3抗B2285抗体对MRL/lpr狼疮鼠体外B细胞生成抗dsDNA抗体的影响如图9所示，与LPS组相比，抗B2285抗体明显抑制MRL/lpr狼疮鼠体外B细胞生 成抗dsDNA抗体(P < 0. 05)，而非特异性IgG干预的阳性对照组B细胞生成抗dsDNA抗体 水平较LPS组无显著性差异。本发明体内实验1.材料和方法1.1实验动物SPF级MRL/lpr雌性狼疮鼠18只，11-12周龄，体重36_40g，由中国科学院上海实 验动物中心提供，饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心清洁级动物房。1. 2B2285抗原疫苗的制备方法同前。1.3免疫干预和分组根据不同干预条件将MRL/lpr狼疮鼠随机平均分为三组(1)B2285组以皮下多 点注射法给予B2285抗原疫苗进行免疫干预，时间为第0、2、4、6、8周，每次每只小鼠注射疫 苗中B2285肽含量为50yg。(2)空载体组给予不含B细胞胞外肽段的载体VLP蛋白干 预，干预方法同(1)。(3) SLE组给予无菌生理盐水干预，干预方法同(1)。每次免疫前记录小鼠体重，收集尿液及眼眶静脉血；在实验第10周处死各组小鼠，留取脾脏及肾脏标本， 并测量标本体积及重量。1. 4血清抗B2285抗体和抗ds_DNA抗体的检测均采用ELISA方法检测(血清抗ds_DNA抗体ELISA检测试剂盒购自美国ADI公 司)，具体步骤同前。1.5尿蛋白的检测应用考马斯亮兰法(Bradford法)测定小鼠尿蛋白浓度，具体步骤如下(1)按考马斯亮兰蛋白检测试剂盒(Fluka，美国)说明书绘制标准曲线。(2)样品 测定将待测蛋白样品用双蒸水稀释至适当浓度，取10 μ 1样品，加入100 μ 1 2xBradford 染色液和90 μ 1的双蒸水，混勻后放置5-10分钟，测定样品吸收值Α595。(3)根据测得的 吸收值，在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。(4)计算蛋白浓度以查得的蛋白含量除 以样品体积10 μ 1，再乘以相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。1. 6Β细胞表面⑶19、⑶22及⑶38分子的表达的检测采用流式细胞术检测。处死小鼠时，立即取狼疮鼠新鲜脾组织，研磨后用淋巴细胞 分离液(天津TBD公司)分离、制备脾单个核细胞悬液。调整单个核细胞浓度为106/ml，取 lml，PBS重悬，离心1500rpm，IOmin0弃上清，lOOulPBS重悬细胞，各标本分别均加入藻红蛋 白(PE，eBioscience公司，美国)标记的小鼠抗⑶19抗体Iul检测B细胞表面⑶19的表 达情况，用异硫氰酸荧光素(FITC，eBioscience公司，美国)标记的CD19，PE抗小鼠CD22 抗体各Iul检测B细胞表面CD22的表达情况，用PE标记的CD19，PECy5 (eBioscience公 司，美国)标记的抗小鼠⑶38抗体各Iul检测B细胞表面⑶38的表达情况，混勻后4°C避 光孵育30min。各组均设置同型对照(eBioscience公司，美国)。用PBS洗涤后，300ulPBS 重悬细胞。流式细胞仪(FACS2calibur型，BD公司，美国)上应用Cell Quest软件进行分 析。1.7.狼疮鼠肾脏病理学变化1.7.1光镜下组织病理学变化所有狼疮鼠处死后取肾脏，置于10%的中性福尔马林液中固定，经常规脱水，石蜡 切片(厚度为约5um)，HE染色后，光镜观察。1. 7. 2免疫荧光检测抗小鼠IgG抗体在肾脏中的表达将冰冻切片机(Leica，德国)预冷至_15 20°C，各组狼疮鼠处死后立即取肾脏， 固定后切取5um后的冰冻切片，丙酮固定后用10%小牛血清孵育30min。再加入1 500 稀释的FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Ivitrogen，美国)孵育lh，在荧光显微镜下观察。1. 7. 3电镜下肾脏组织超微结构变化按透射电镜超微病理标本常规取材要求取肾皮质组织，立即用2.5%戊二醛41 固定l-2h，4°C下0. IM磷酸缓冲液漂洗20min，氯化锇后固定1. 5h，系列乙醇脱水，环氧 树脂浸透包埋。标本在60°C下聚合18h，修块，超薄切片(Ium)。透射电镜观察、拍照。1. 8狼疮鼠心、肺等其他重要组织器官病理学变化应用上述相同方法，检测小鼠心脏和肺脏等其他重要组织器官的病理学变化。1.9统计学分析应用SPSS11.0软件，数值变量均以均数士标准差表示，运用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P < 0. 05 为有统计学意义。2.实验结果2. 1B2285诱导MRL/lpr狼疮鼠体内产生的抗B2285抗体水平如图10所示，B2285组和空载体组均有抗B2285抗体产生，且呈逐渐上升趋势但 B2285组产生的抗肽抗体水平明显高于空载体组(P < 0. 01)。SLE组无抗肽抗体生成。2. 2B2285对MRL/lpr狼疮鼠体内抗dsDNA抗体的影响如图11所示，B2285免疫的MRL/lpr狼疮鼠体内抗dsDNA抗体水平呈进行性下降 趋势，至第10周时，其含量明显低于SLE组(P <0.01)和空载体组(P<0. 05)。2. 3B2285肽对MRL/lpr狼疮鼠尿蛋白的影响如图12所示，SLE组和空载体组小鼠尿蛋白浓度呈逐渐升高趋势，且以SLE组更 明显；而B2285肽免疫的MRL/lpr狼疮鼠尿蛋白浓度初呈上升趋势，自第6周始水平下移， 至第10周明显低于SLE组(P值< 0. 01)和空载体组(P值< 0. 05)。2. 4B2285对MRL/lpr狼疮鼠脾脏的影响2. 4. 1B2285对MRL/lpr狼疮鼠脾脏大体和重量的影响如图13所示，在实验的第10周，B2285组狼疮鼠脾脏明显小于SLE组和空载体组； 其重量与体重比值(SW/BW)显著低于SLE组和空载体组，P均< 0. 01。2. 4. 2B2285对MRL/lpr狼疮鼠脾脏B细胞的影响如图14及表4所示，第10周处死小鼠时，B2285免疫的MRL/lpr狼疮鼠⑶19+总 B细胞、⑶19+⑶22+B细胞和能产生效应的⑶19+⑶38+的活化B细胞数较SLE组和空载体组 均明显降低(P均< 0. 01)，而空载体组和SLE组各有关B细胞数之间均无显著差异。表4B2285免疫MRL/lpr狼疮鼠后脾脏B细胞比例(％，η = 6)
分组CD19+B 细胞 CD19+CD38+B 细胞 CD19+CD22+B 细胞
B2285 组25.25士5.62*#6. 23 土 3.47**9. 62±3. 82*#空载体组30..68+8.,4317.08 土 5.6617. 19± 4.96SLE组31..77士6.,9817.47 土 7.9517. 11士 7. 12*与SLE组相比，P < 0.01 ；#与空载体组相比，P < 0.01ο2. 5Β2285对MRL/lpr狼疮鼠肾脏的影响2. 5. 1B2285对MRL/lpr狼疮鼠肾脏重量的影响如图15所示，B2285组狼疮鼠肾脏重量与体重的比值(KW/BW)明显高于SLE组和 空载体组，P均< 0.01。2. 5. 2B2285对MRL/lpr狼疮鼠肾脏病理学影响如图16所示，SLE组狼疮鼠肾脏组织在光镜下可见肾小球体积增大、细胞增多、血 管内皮细胞增生、毛细血管扩张和充血，并有明显炎症细胞浸润，局部甚至有坏死；免疫荧 光检查显示肾小球有IgG型免疫复合物沉积；电镜下超微结构显示肾小球基底膜弥漫性增 厚、轴突弥漫性融合。而B2285组狼疮鼠肾小球和肾小管病变减轻，肾小球IgG型免疫复合 物沉积少于SLE组，肾小球基底膜轻度增厚、轴突轻度融合。空载体组病变与SLE组相似， 但略轻于SLE组。
2. 6B2285对MRL/lpr狼疮鼠心脏和肺脏病理学影响与未接受B2285免疫的MRL/lpr狼疮鼠相比，接受B2285免疫的小鼠心脏和肺脏
组织病理学改变均无明显差异。
权利要求
一种B细胞CD22胞外抑制性肽段B2285疫苗的制备，该肽段选自小鼠CD22分子氨基酸序列中由氨基端起始第85 93位连续的9个氨基酸，具体序列为Lys Thr Glu Lys Asp Pro Glu Ser Glu，其特征在于可应用所述小鼠CD22胞外抑制性肽段B2285作为半抗原制备疫苗。
2.一种与权利要求1所述小鼠B细胞CD22胞外抑制性肽段空间结构位于同一功能区 域，具有高度同源性的人B细胞CD22胞外抑制性肽段，其特征在于该肽段选自人CD22分 子由氨基端起始第81-88位连续的8个氨基酸，具体序列为LyS-ASp-Gly-LyS-Val-Pr0-S er-Glu0
3.根据权利要求1所述的B细胞CD22胞外抑制性肽段B2285疫苗的制备，其特征在 于所述疫苗含有生理学上可接受的载体组合物和非特异性免疫反应增强剂。
4.根据权利要求1所述的B细胞CD22胞外抑制性肽段B2285疫苗的制备，其特征在 于所述的疫苗具有免疫调节治疗抗心肌抗体为阳性的免疫性心肌病和自身抗体为阳性的 系统性红斑狼疮等B细胞参与或主要介导的免疫性疾病的作用。
全文摘要
本发明提供了一种B细胞CD22胞外肽段B2285疫苗的制备，它选自小鼠CD22分子氨基酸序列中由氨基端起始第85-93位连续的9个氨基酸，具体序列为Lys-Thr-Glu-Lys-Asp-Pro-Glu-Ser-Glu。该序列与人CD22分子氨基酸序列中由氨基端起始第81-88位连续的8个氨基酸的序列Lys-Asp-Gly-Lys-Val-Pro-Ser-Glu相似，在空间结构上位于同一功能区域，具有高度同源性。应用含有B2285所制备的疫苗或药物组合物具有抑制B细胞增殖、活化和产生自身抗体的功能，可用于抗心肌抗体检测为阳性的扩张型心肌病和自身抗体为阳性的系统性红斑狼疮等B细胞参与或主要介导的免疫性疾病的治疗。
文档编号A61P9/00GK101897961SQ20101015434
公开日2010年12月1日 申请日期2010年4月20日 优先权日2010年4月20日
发明者余淼, 廖玉华, 张丽华, 曹爱林, 林琼雯, 王敏, 袁璟 申请人:华中科技大学同济医学院附属协和医院