一种青蒿素衍生物及其应用的制作方法

专利名称：：一种青蒿素衍生物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于药物化合物领域，涉及一种青蒿素衍生物及其应用，具体涉及青蒿素衍生物作为肿瘤放射增敏药物的应用。
背景技术：
：世界上恶性肿瘤，心血管疾病和艾滋病是严重威胁人类健康的三大疾病。随着我国居民的生活方式和居家环境的改变，我国的癌症新增病例数逐年在上升，一些恶性肿瘤的发生率和死亡率呈明显上升趋势。目前国际上大多数恶性肿瘤还没有根治的方法，用于肿瘤治疗的主要手段有手术、放疗、化疗、生物治疗和其他(内分泌治疗、中医中药治疗、热疗和射频消融治疗)治疗等。肿瘤放射治疗(简称放疗)就是用放射线治疗癌症。放疗已经历了一个多世纪的发展。在伦琴发现X线、居里夫人发现镭之后，很快就分别用于临床治疗恶性肿瘤，直到目前为止放疗仍是恶性肿瘤重要的治疗方法。大约70%的癌症病人在治疗癌症的过程中需要用放疗，约有40%的癌症可以用放疗根治。有的肿瘤经过放疗甚至可以治愈或代替手术治疗，如鼻咽癌、食管癌、淋巴瘤等。更多的癌症病人化疗后都需要放疗加以巩固和提高疗效，即辅助性放疗。因此，放疗在肿瘤治疗中的作用和地位日益突出。放疗已成为治疗恶性肿瘤的主要手段之一。放疗机制包括(1)直接损伤效应，即主要由射线直接作用于有机分子而产生自由基引起DNA分子出现断裂、交叉；和(2)间接损伤效应，即主要由射线对人体组织内水发生电离，产生自由基，这些自由基再和生物大分子发生作用，导致不可逆损伤。两种效应有同等的重要性。虽然放疗在治疗恶性肿瘤中的作用十分显著已毫无疑问，但也要看到放射反应和损伤的存在。高剂量射线在杀灭癌细胞同时也会严重损伤到肿瘤周围的正常组织和器官，病人就会出现不同程度的不良反应，如血细胞减少、呕吐、不同组织或器官炎症。因此，怎样使放疗既能最大限度地抑制和杀灭肿瘤细胞，又要尽可能减少或不产生对正常组织和细胞的损伤是制定肿瘤放疗计划的目也是放疗研究界重要的课题之一。放射增敏药物(一种使肿瘤细胞或组织对放疗更加敏感的药物)是近年来肿瘤放疗研究领域的一个新的热点。开发新的抗肿瘤药物已成为国内外备受关注的热门的肿瘤研究领域，也符合我国当前的研究方向，对提高我国基础和应用医学研究水平具有一定的意义。目前基础研究和临床应用对放射增敏概念的使用上有些混乱，把凡是放疗的同时使用另一种(或多种)药物，疗效增加了，就说是增敏了。这其实是混淆了放射增敏的学术概念。药物与射线叠加在一起的生物效应，大致有三种情况，即相加、加强或增敏。相加是两种生物效应的简单相加，1+1=2。加强或增强，指的是射线的生物效应为1，药物的生物效应小于1，两者相加的最后生物效应为2，1+<1=2。真正学术意义的增敏指的是射线的生物效应为1，药物的生物效应为0(或很小)，两者相加后的生物效应为2，1+0=2。因此真正意义上的放射增敏药，必须具备两个特点(1)本身无(或几乎无)对肿瘤的治疗作用；(2)仅对肿瘤细胞有增敏作用。一个增敏药物要通过专家和药政部门的审评，必须要提供这两个特征的研究数据。目前国际上放射增敏药物领域的研究主要集中在(1)针对肿瘤乏氧细胞的放射增敏剂的研究，如硝基咪唑类放射增敏剂和甘氨双唑钠等。因为肿瘤细胞常常是在乏氧环境下；(2)抑制辐射产生的DNA损伤修复的放射增敏剂的研究，如gemcitabine和甘氨双唑钠；(3)细胞周期调节的放射增敏剂的研究，如UCN-Ol和caffeine；(4)调节细胞基因的药物和蛋白抗体应用的研究，如Cos-2抑制剂；(5)针对放疗有关肿瘤抑制基因调控等方面的研究，如将p53，pTEN等肿瘤抑制基因直接导入到肿瘤而产生放射增敏的研究；(6)现有肿瘤临床化疗药物与放疗联合应用所产生放射增敏的研究。如环磷酰胺、氟尿嘧啶、VP-16、博来霉素、丝裂霉素C、(羟基)喜树碱、紫杉醇、阿霉素等；和(7)其它的研究，包括光敏剂Photofrin与多种其他卟啉放射增敏效应的研究等等。针对乏氧细胞的放射增敏剂的硝基咪唑类放射增敏剂是目前国内外研究较为成熟并具有发展前景的一类抗肿瘤放射增敏药。细胞周期调节的抗肿瘤放射增敏药物UCN-Ol已进入I或II期临床实验。由我国第二军医大学研究人员研制出的具有自主知识产权的国家一类抗癌新药一甘氨双唑钠也发现有非常好的肿瘤放疗增敏效果。虽然有些放射增敏剂已经进入I期或者II期临床试验中，但在III期临床随机对照试验结果表明，大多数试验是失败的，主要原因是毒性(包括神经毒性)限制了使用剂量，致使肿瘤中药物浓度达不到增敏的足够浓度。另外，大部分放射增敏药物研究基本都未能提供增敏作用两大基本特征的实验证据，即单独使用没有杀伤细胞的作用和只对肿瘤细胞有增敏作用。因此，即便证明化疗药物与放射治疗有相互增加杀伤细胞的作用，最多也只能是一种相加或加强的作用，是否是学术意义的增敏作用尚待提供实验证据。另外，现有的大多数放射增敏药物的肿瘤选择性、肿瘤特异性都不高或对机体有一定的毒性作用，这些都限制了现有放射增敏药物在临床上的广泛应用。因此，寻找肿瘤选择性高、特异性强和细胞毒性小或无细胞毒性的放射增敏药物是国内外肿瘤放射治疗界的重要课题。
发明内容本发明目的是提供一种青蒿素衍生物。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种青蒿素衍生物，其化学结构式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>上述技术方案中，所述青蒿素衍生物的分子式为C24H41O9N,该晶体易溶在丙酮、醋酸乙酯、氯仿、苯、冰醋酸、乙醇、甲醇、乙醚、石油醚及水；熔点为143-144°C。对上述技术方案中所述青蒿素衍生物的进一步研究发现(1)药理毒理，根据体外细胞培养实验数据显示所述青蒿素衍生物仅仅在高剂量(>250μΜ)显示出对不同类型的肿瘤细胞(乳癌、结肠癌白血病、淋巴瘤、子宫内膜癌、脑神经瘤、胰腺癌、肝癌、胃癌和食道癌)生长产生抑制作用，即毒性剂量，这些剂量是所述青蒿素衍生物表现出肿瘤细胞放射增敏剂量的240-250倍；同时，对正常细胞而言，剂量的所述青蒿素衍生物的剂量大于560μM时才显示出细胞生长抑制作用；(2)所述青蒿素衍生物具有广谱放射增敏作用其SD5tl(增加50%放疗敏感度所需增敏剂的浓度)在不同的肿瘤细胞系(46种不同类型的人类肿瘤细胞株，参见表1)大约为0.9-2.5μΜ之间，这些剂量也仅仅是所述青蒿素衍生物细胞毒性剂量的0.1-0.5%；同时，在大多数肿瘤细胞中达到同样的放射增敏效果，本发明所述青蒿素衍生物所用的剂量仅为青篙素和其它青篙素衍生物(包括青篙琥酯，篙甲醚、蒿乙醚、双氢青篙素)剂量的1/5；(3)本发明所述青蒿素衍生物可增加X-线辐射诱发的细胞凋亡，并且显现为剂量依赖型；(4)采用三种不同的肿瘤模型(自发性肿瘤模型，诱发性肿瘤模型和人类肿瘤细胞裸小鼠移植瘤模型)完成了本发明所述青蒿素衍生物的动物体内放疗增敏试验，结果表明本发明所述青蒿素衍生物在这三种动物模型均显示出非常有效的放疗增敏效果。因此，本发明同时要求保护上述青蒿素衍生物在制备肿瘤放射增敏药物中的应用；本发明同时要求保护一种肿瘤放射增敏药物，所述肿瘤放射增敏药物的活性成分为本发明所述青蒿素衍生物。优选的技术方案中，肿瘤放射治疗增敏剂中青蒿素衍生物浓度小于等于5μmol/L，进一步优选的技术方案中，肿瘤放射治疗增敏剂中青蒿素衍生物浓度为2μmol/L5μmol/L。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1、本发明所述青蒿素衍生物作为肿瘤放射增敏剂的活性成分时，在相同的剂量比青蒿素的放疗增敏效果又高出5-8倍；使用低剂量的该青蒿素衍生物单独处理对细胞生长不产生任何的影响，即无任何细胞毒性；并且，更可喜的是，和肿瘤细胞相比较，该青蒿素衍生物需要高出10-15倍以上的剂量才能在正常细胞看到其放射增敏效果，因此，该青蒿素衍生物完全符合放射增敏药的两大基本特征，即单独使用(正常的作为肿瘤放疗增敏剂的剂量)没有杀伤细胞的作用和只对肿瘤细胞有增敏作用。2、本发明所述青蒿素衍生物具有广谱的肿瘤放疗增敏效果。3、本发明所述青蒿素衍生物的母物青蒿素已经在临床上应用了几十年，证实其副作用极少，是一非常安全的药物。因此，与现有放射增敏药物相比，本发明所述青蒿素衍生物有着它的非常强的临床应用优势。图1为实施例四中人类乳癌MDA-MB-231细胞放射增敏诱发的细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳图；图2为实施例五中自发肿瘤的放疗后大小差异图；图3为实施例五中化学致癌物DMBA诱发的乳癌放疗后大小差异图4为实施例五中小鼠乳头状瘤放疗后大小差异图；图5为实施例一所得青蒿素衍生物的分子结构图。具体实施方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例一将0.284g(Immol)双氢青蒿素溶于20mL无水二氯甲烷中，加入2.OOg(IOmmol)聚乙二醇500，然后在冰盐浴冷却下，加入0.Olg(0.07mmol)无水AlCl3(三氯化铝)，片刻后撤去冰浴，室温搅拌。用薄板色谱检测反应进程(GF2硅胶板，香兰醛，硫酸溶液显色)。待反应基本完成，反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液(20mLX3)、水(20mLX2)、饱和氯化钠溶液(20mLX3)洗涤至呈中性，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸去溶剂，残余油状物经硅胶柱层析分离(石油醚_乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱)，减压浓缩后得0.5g无色油状化合物，进一步提纯、结晶得无色晶体(参考张建新，王峻霞，张瑜，等.具有免疫抑制作用的含有聚乙二醇基的青蒿素衍生物的合成.药学学报，2006，41(1):65-7)。鉴定上述无色晶体，得其分子式为C24H41O9N,该晶体易溶在丙酮、醋酸乙酯、氯仿、苯、冰醋酸、乙醇、甲醇、乙醚、石油醚及水；熔点为143-144°C。该晶体的分子结构式参见图5。注以下实施例中青增素1号代表实施例一所得青篙素衍生物。实施例二，药理毒理测试选用了46种不同类型的人类肿瘤细胞株和5种不同类型的人类正常细胞株，按常规细胞培养法进行指数培养。将不同浓度(0-600μM)的实施例一所得青蒿素衍生物加到指数生长的细胞的培养液中。24小时后使用四氮唑盐[3-(4，5-dimethylthiaZ0l-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide,MTT]还原法测定细胞的生存。根据上述体外细胞培养实验数据显示实施例一所得青蒿素衍生物仅仅在高剂量(>250μΜ)时才显示出对不同类型的肿瘤细胞生长产生抑制作用，即毒性剂量。但对正常细胞而言，当实施例一所得青蒿素衍生物剂量大于560μM时才显示出细胞生长抑制作用。实施例三选用了46种不同类型的人类肿瘤细胞株和5种不同类型的人类正常细胞株，按常规细胞培养法进行指数培养。在X-射线照射之前24或者48小时，采用不同浓度(0_150μΜ)的青篙素或其衍生物(包括青篙琥酯，篙甲醚、蒿乙醚、双氢青篙素和实施例一所得青蒿素衍生物)或其它已报导的放射增敏药物加到指数生长的细胞的培养液中。相对量的乙醇(用来溶解青篙素和其衍生物)或其它溶剂也直接地加到细胞培养液中作为阴性对照，这些溶剂并不对细胞的放射敏感性产生任何的影响。然后细胞接受不同剂量的X-射线照射(O-IOGy)。24小时后使用四氮唑盐[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide,MTT]还原法测定细胞的生存。采用LOGIT法计算增加50%放疗敏感度的浓度SD5tl值，试验至少重复三次，实验的平均SD5tl作为评价体外放疗敏感性的最终评价指标。结果如表1所示，在不同肿瘤细胞和正常细胞，不同放射增敏药物显示出不同的放射增敏效果。在所有的检测的肿瘤细胞，青篙素和这里检测的所有青篙素衍生物都显示出非常好的放射增敏效果，SD5tl明显比这里检查的其它放射增敏药物的剂量要小。青篙素和这里检测的所有青篙素衍生物的放射增敏剂量对细胞都不产生任何的毒性影响。在所有青篙素和青篙素衍生物中，实施例一所得青篙素衍生物的SD5tl剂量最小，换句话说，实施例一所得青篙素衍生物的放射增敏效果是最好。并且，实施例一所得青篙素衍生物表现出广谱的放射增敏效果，其SD5tl在不同的肿瘤细胞系也比较一致，大约0.9-2.5μM之间。这些剂量也仅仅是实施例一所得青篙素衍生物细胞毒性剂量的0.1-0.5%。同时，在大多数肿瘤细胞中达到同样的放射增敏效果，实施例一所得青篙素衍生物所用的剂量仅为青篙素和其它青篙素衍生物剂量的1/5。表1.不同放疗增敏药物增敏效果的比较，以SD5tl(增加50%X-射线放疗效果的剂量，平均值(μΜ)士平均差，所有实验至少重复三次)为比较指标<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>NHEK62+4.645+4.545+6.258+4.547+1.382+3.245+3.180+1.450+4.3HUVEC59+7.237+3.646+4.549+6.049+0.773+1.952+4.251+2.639+2.9NHME53+4.523+2.344+5.249+4.363+0.658+2.779±3.967+1.948+3.8注CAF，caffeine；GEM,gemcitabine。HUVEC为正人脐带静脉内皮的细胞；NHME为正常人支气管上皮细胞；HMEC为正常人乳腺上皮细胞；NHEK为正常人表皮角化细胞。实施例四实施例一所得青篙素衍生物增加辐射所诱发的细胞凋亡为了测定实施例一所得青篙素衍生物放射增敏效果是否由于增加辐射所诱发的细胞凋亡。采用DNA琼脂糖凝胶电泳分析方法，分析了在不同剂量的实施例一所得青篙素衍生物存在条件下，放射增敏诱发的细胞凋亡的结果。如图1所示，在人类乳癌MDA-MB-231细胞接受5Gyχ-射线辐射前，实施例一所得青篙素衍生物24小时的预处理可以明显增加随后X-射线辐射诱发的细胞凋亡，即可见长度不等的DNA片段电泳条带程度明显增加。而且，实施例一所得青篙素衍生物增加χ-射线辐射诱发的细胞凋亡也显现为剂量依赖型。实施例五青增素1号的体内放疗增敏试验体内肿瘤放疗增敏试验结果是评价侯选放疗增敏药物有效性的最重要指标。动物移植性肿瘤试验是筛选抗肿瘤新药中最常用的模型。因此，我们分别采用了三种不同的肿瘤模型(自发性肿瘤模型，诱发性肿瘤模型和人类肿瘤细胞裸小鼠移植瘤模型)完成了实施例一所得青篙素衍生物的动物体内放疗增敏试验以积累临床前实验数据为临床实验作好准备。试验结果表明实施例一所得青篙素衍生物在这三种动物模型均显示出非常有效的放疗增敏效果。详情的结果描述如下。在所有实验中，同一批实验中动物的性别都保持相同，且不同批次的实验都采用同一品系的小鼠。所有实验至少重复两次，但绝大多数实验至少重复了三次。(1)自发性肿瘤模型实验动物种群中不经有意识的人工实验处置而自然发生的一类肿瘤称之为自发性肿瘤。选用自发性肿瘤型为对象进行研究的优点是自发性肿瘤通常比用实验方法诱发的肿瘤与人类所患的肿瘤更为相似，有利于将动物实验结果推用到人，但不可能在短时间内获得大量肿瘤学材料，观察时间可能较长和实验用到人，但不可能在短时间内获得大量肿瘤学材料，观察时间可能较长和实验耗费较大。我们采用了自发瘤模型应用最多的C3H小鼠自发乳癌。C3H小鼠出生后有高的乳腺癌发生率(自发瘤可高达70%)。我们随机地将小鼠分成四组无处理或照射的对照组，χ-线辐射照射组，青增素1号组和青增素1号加χ-线辐射组。每组10个小鼠。所有动物耳朵将被标记以便跟踪鼠个体肿瘤的生长历史。在我们喂养的C3H小鼠大约在九个月可见乳腺部位肿瘤发生。乳腺肿瘤的发展和生长在各个组别中未见明显的有差异。当肿瘤生长到大小约200mm2后，青增素1号组和青增素1号加x_线辐射组接受一周三次50mg/kg青增素1号静脉注射共两周，而无处理或照射的对照组和χ-线辐射照射组则静脉注射生理盐水。Χ-线辐射照射组和青增素1号加Χ_线辐射组然后接受一周两次7Gy的)c-射线定位照射。在照射期间，青增素1号组和青增素1号加χ-线辐射组继续接受一周三次的50mg/kg青增素1号静脉注射直至实验结束(照射后两周)。实验结束时，仔细测量每个小鼠的肿瘤大小并记录。肿瘤大小的测量为每周2-3次，每次测量时称鼠重。肿瘤体积的计算公式为V=π/eXaXbXc，其中a、b和c分别表示长、宽和高。并采用非参数曼惠特尼U-检验办法来检验实验组之间肿瘤大小的差异。P<0.05定为有明显差异。每次测量时称鼠重，计算相对体重(RWT)=测试时体重/试验开始时体重。如图2所示，肿瘤在青增素1号组小鼠生长的肿瘤大小和无处理或照射的对照组小鼠生长的肿瘤大小无明显差别(P>0.05)。和这些对照组相比，χ-线辐射照射组(ρ<0.01)和青增素1号加χ_线辐射组小鼠肿瘤(P<0.005)则明显减小，但青增素1号加χ-线辐射组小鼠肿瘤比χ-线辐射照射组小鼠肿瘤更小。青增素1号加χ-线辐射组小鼠肿瘤和X-线辐射照射组小鼠体重并无明显差别。这些数据表明青增素1号可以明显增加自发肿瘤的放疗敏感性。(2)诱发性肿瘤模型用化学致癌物、射线或病毒均可在各类动物中诱发不同类型的肿瘤。从病因学角度分析，它与人体肿瘤较为近似，故此模型常用于特定的深入研究。现在已有非常成熟的诱发性肿瘤模型，如强化学致癌物二甲基苯蒽(DMBA)和甲基胆蒽可诱发乳癌。因此我们采用DMBA诱发雌性大鼠乳癌试验来检测青增素1号放疗增敏效果。2月鼠龄大小的Sprague-Dawley雄鼠，单次灌喂DMBA20微克/总共3次，一周内完成。两月后乳房部位可见肿瘤生长，成功率为75%左右。大约四月肿瘤长到170mm2大小后按以上自发性肿瘤模型中描述的实验方案进行分组和处理。每组10个大鼠。实验结束时，仔细测量每个大鼠的肿瘤大小并记录。并采用非参数曼惠特尼U-检验办法来检验肿瘤大小的差异。正像图3所示，青增素1号加χ-线辐射组大鼠肿瘤比未处理或青增素1号单独处理的对照组的肿瘤要明显小(P<0.005)，也比χ-线辐射照射组的肿瘤(ρ<0.01)来得小。这些数据表明青增素1号可以明显增加化学致癌物DMBA诱发的乳癌放疗敏感性。我们也采用DMBA诱发乳头状瘤模型。既用丙酮溶解DMBA150微克在雄性大鼠二侧背部皮肤各涂一处，共涂21天，第3周后用巴豆油0.5mg在同一部位每周涂2次共34月。当瘤>5mm2大小后开始按以上自发性肿瘤模型中描述的实验方案进行癌块大小动物分组和处理。每组10个小鼠。实验结束时，仔细测量每个鼠的肿瘤大小并记录。并采用非参数曼惠特尼U-检验办法来检验肿瘤大小的差异。正像图4所示的肿瘤生长的大小，青增素1号加χ-线辐射组小鼠的肿瘤是最小的，有些肿瘤都已测定不到了。这些实验数据表明注射了青增素1号的小鼠乳头状瘤对χ-线放疗更加敏感，肿瘤生长明显地受到了抑制。权利要求一种青蒿素衍生物，其特征在于，所述青蒿素衍生物化学结构式为FSA00000125142300011.tif2.权利要求1所述青蒿素衍生物在制备肿瘤放射增敏药物中的应用。3.—种肿瘤放射增敏药物，其特征在于有所述肿瘤放射增敏药物的活性成分为青蒿素衍生物。全文摘要本发明属于药物化合物领域，涉及一种青蒿素衍生物及其制备方法和应用，所述青蒿素衍生物的分子式为C24H41O9N，该青蒿素衍生物完全符合放射增敏药的两大基本特征，即单独使用(正常的作为肿瘤放疗增敏剂的剂量)没有杀伤细胞的作用和只对肿瘤细胞有增敏作用，而且具有广谱的肿瘤放疗增敏效果。文档编号A61P35/00GK101830945SQ201010179468公开日2010年9月15日申请日期2010年5月24日优先权日2010年5月24日发明者樊赛军申请人:苏州基莫夫药物开发有限公司