专利名称：一种7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针及其制备方法
技术领域：
本发明技术领域涉及抗癌药物新剂型的设计与制备，提供了一种7-乙基-10-羟 基喜树碱脂质体冻干粉针及其制备方法
背景技术：
7-乙基-10-羟基喜树碱为喜树碱类抗癌药物的体内主要代谢物，经研究表明有 良好的抗癌疗效，它的细胞毒性是伊利替康的200-2000倍。7-乙基-10-羟基喜树碱是脂 水不溶的化合物，而且在PBS和血浆溶液中均代谢很快。其具有在酸溶液中亲脂，在碱溶液 中亲水的特性，考虑利用这一特性制备脂质体注射剂，提高溶解度和体内稳定性。脂质体在输送至肿瘤血管时，可通过毛细管上皮组织间隙进入肿瘤组织，从而达 到一定的肿瘤组织靶向作用。脂质体载药系统的被动靶向作用，因其改变了药物的体内分 布，所以可在提高疗效的同时降低毒性，作为提高7-乙基-10-羟基喜树碱载药量的良好载 体。通过脂质体的应用，良好的解决了 7-乙基-10-羟基喜树碱溶解度低的问题，起到了降 低毒性反应，消除副反应的作用，有较高靶向分布特性，有效的提高了 7-乙基-10-羟基喜 树碱注射液的治疗指数和患者的耐受性。由于脂质体溶液的稳定性较差，所以考虑利用真 空冷冻干燥技术制备冻干粉针，提高稳定性。肿瘤是严重危害人类健康的疾病。近年来肿瘤的发病率日见增长，全世界每年有 700万癌症新病人，我国每年癌症发病人数约160万。癌症正在超过心脑血管疾病而成为第 一死亡原因。随着科技水平的提高，治疗肿瘤的手段也在不断增加，但抗肿瘤药物的研究仍 占重要的地位，人们在寻求更好的抗肿瘤药物。鉴于癌症对我国人民健康的巨大危害和7-乙基-10-羟基喜树碱良好的治疗效 果，研制开发7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针，不但可以满足临床需求，而且可以 取得较好的经济效益和社会效益。新结构的喜树碱类衍生物在治疗癌症方面已显现了巨大的潜力，国内虽有喜树 碱、10 —羟基喜树碱、伊立替康和拓扑替康，但临床用药喜树碱和10-轻基喜树碱是未经修 饰的天然产物，毒性较大，抗肿瘤活性低，在临床应用中受到了限制。FDA批准的两个喜树碱 衍生物新药伊立替康和拓扑替康虽然在我国仿制成功，但二者已在我国申请专利，限制了 它们的应用。因此在我国开发高效低毒的喜树碱类抗肿瘤新药是药学工作者的当务之急。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针及 其制备方法。本发明是通过如下技术方案实现的7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针的处方及200支用量如下7-乙基-10-羟基喜树碱1-10克，
磷脂胆固醇VE冻干保护剂有机溶剂碱性缓冲盐溶液酸性缓冲盐溶液
30-60 克， 10-40 克， 2-8 克， 100-300 克， 2000-8000 毫升， 1000-4000 毫升， 1000-4000 毫升所述的磷脂为神经鞘磷脂，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，心磷脂或它们的混合物， 或以上单一磷脂衍生物。所述的冻干保护剂为乳糖，海藻糖，蔗糖，氨基乙酸或它们的混合物。碱性缓冲盐溶液选自磷酸二氢钾_氢氧化钠缓冲液，巴比妥钠_盐酸缓冲液，碳酸 钠_碳酸氢钠缓冲液。 酸性缓冲盐溶液选自磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液，柠檬酸_氢氧化钠_盐酸，柠檬 酸_柠檬酸钠，乙酸_乙酸钠缓冲液。有机溶剂选自氯仿，乙醚，乙醇或任意两种的混合物。制备工艺如下(1)将磷脂，胆固醇，VE溶于有机溶剂中，真空旋转转移有机溶剂，真空恒温干燥 箱中放置过夜挥干残余有机溶剂，制备脂质干膜，以上操作均在无菌条件下完成。(2)将7-乙基-10-羟基喜树碱，冻干保护剂溶于碱性缓冲盐溶液(pH = 9. 9)中， 在水化温度下用上述碱性缓冲盐溶液水化脂质干膜，水化完全后用乳勻机降低粒径，即得 含药脂质体，上操作均在无菌条件下完成。(3)真空冷冻干燥得到的含药脂质体冻干粉，用酸性缓冲盐溶液(pH = 3. 8)复溶 制得的脂质体溶液，孵育后取半成品检验，定装样量。过滤除菌，再次冻干，封口，检验合格 后入库。7-乙基-10-羟基喜树碱结构中的内酯环是它的活性部位，会随pH变化发生可逆 性的开闭环变化。在碱性溶液(PH = 10)中开环，完全表现为失活形式，在酸性溶液(pH = 3)中闭环，几乎完全表现为活性形式。在研究中发现7-乙基-10-羟基喜树碱在碱性 溶液中亲水，在酸性溶液中亲脂的特性。所以利用这一特性制备脂质体，在制备过程中用碱 性溶液(PH = 10)水化脂质干膜，而冻干后用酸性溶液(pH = 3)复溶。实验证明，经酸溶液孵育一定时间后，药物转化为亲脂的活性形式，通过孵育向脂 质双层转移，最后包裹于脂质双层。包裹于脂质双层的药物由于受到了保护，在很大程度上 提高了药物稳定性同时也提高了药物的体内稳定性，制得的脂质体冻干粉针也提高了制剂 的稳定性。进入靶区前，药物包裹在脂质体内部，减轻了静注对血管的刺激，也避免了机体 的分解；进入靶区后，脂质体与细胞相互作用或被细胞内吞，经溶酶体的作用，使脂质体解 体并释放药物。通过此特性制备的脂质体。良好的解决了 7-乙基-10-羟基喜树碱溶解度 低，体内代谢快的问题，起到了降低毒性反应，消除副反应的作用，有较高靶向分布特性，延 长代谢时间，提高溶解度和生物利用度。根据以上制备过程，考察了如下内容1分别用常规脂质体制备方法本发明方法制备7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体，分别进行质量评价，有结果可知本发明方法制备7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体的包封率，粒 径，稳定性等质量评价指标均优于常规脂质体制备方法制备的脂质体。2考察7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干前的12小时稳定性和7-乙基-10-羟 基喜树碱脂质体冻干后的6个月稳定性，结果显示稳定性均良好3制备1000支7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针，进行全检，并进行6个月 长期稳定性考察和3个月加速稳定性考察。试验结果表明7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干前后稳定性均良好，脂质体工 艺的冻干粉针剂在外观，包封率，粒径，磷脂氧化指数和安全性，稳定性方面勻符合规定。4 7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)脂质体冻干粉针大鼠体内药动学研究(1)SN_38溶液剂的制备5mg SN-38加入到0. 05mol L-1L-精氨酸2mL中，60°C水浴加热搅拌，基本溶解 后，加入0. 056mol -L-lNa2HP04溶液8mL，继续搅拌至完全溶解，过0122 y m微孔滤膜，得黄 色 S-SN-38.(2)大鼠尾静脉给药健康SD大鼠6只，雄性，随机分成2组，试验期间自由进食和饮水。以10mg -kg-1 的剂量分别经尾静脉缓慢注射给药SN-38脂质体冻干粉针和S-SN-38，于给药后0. 17，0. 5， 1，2，3，5，7和llh经眼眶取血，全血置于涂有肝素的干燥EP管中，4000r .min-l离心lOmin 分离血浆，-20°C冷冻保存。(3)生物样品的处理取大鼠血浆200 ii L，加入甲酸20 ii L酸化lh，加入100 i L内标物溶液 (2mg L-1102羟基喜树碱甲醇溶液)和1. 5mL乙酸乙酯，涡旋3min，超声提取5min，再涡 旋3min，4000r min-l离心lOmin，取1. 5mL上清液，于40°C水浴N2气吹干，以100 ii L流 动相溶样，进样20iiL。(4)体内标准曲线色谱条件Hypersil2C-18分析柱(250mmX 4. 6mm, 5 u m)；流动相为甲醇2水 (53 47)；流速为1. OmL min-l ；检测波长为384nm ；柱温为25°C ；进样量为20y L。采用 内标法定量。SN-38甲醇标准液lOOiiL，于40°C水浴N2气吹干，加入大鼠空白血浆200iiL， 涡旋3min，其余按“生物样品处理方法”操作，峰面积(A)对血浆药物浓度(C，ug-L_l) 做线性回归，得方程:A = 20. 415C+238. 21，r = 0. 9999，最低检测浓度为20 u g L-l0为 85. 3%, RSD 为 2. 5%。(5)数据处理大鼠体内的药时曲线数据用中国药理学会数学药理委员会编制的3P97药动学程 序进行处理。结果显示，可知，注射用SN-38脂质体冻干粉针和溶液剂SN-38静脉注射的半衰期 tl/2 3分别为5. 885和1. 276h，前者是后者的4. 61倍；AUC前者是后者的1. 76倍，且2种 制剂的tl/2 0和AUC等药动学参数经t检验均有显著性统计学差异(P < 0. 05)。由此说 明注射用SN-38脂质体冻干粉针改变了其在大鼠体内的药物动力学行为，延长了药物在血 液中的循环时间，有长循环作用。5体内分布试验
取昆明种小鼠，体重18 229，分两组(溶液剂组和脂质体组)，于禁食12h后1 剂量尾静脉注射给药。于5、15、30、45min和1，2，4，8，12及24h (每点6只小鼠，雌雄各半) 经后眼眶静脉丛取血(置肝素化试管中，2000prm离心lOmni，取血浆0. lmL)，然后断头处死 动物，放尽血液后，取出心、肝、脾、肺、肾、胃、肠，生理盐水冲洗干净，用滤纸吸干，称重，以 0. 19组织/mL生理盐水加生理盐水，重量小于0. 19的组织，直接勻浆；重量大于0. 19的组 织，则取0. 19进行勻浆。血浆及组织样品按1中方法处理后，进行HPLC分析，根据SN-38的 峰面积，代入相应的标准曲线方程中，求出血浆及各组织中各点的药物浓度。采用P387程 序对血药浓度数据进行室模型拟合，经选择以权重系数1/C按二室模型拟合可较好表达钠 盐注射液组药时曲线，以权重系数/I (C*C)按二室模型拟合可较好表达前体脂质体组药时 曲线，药动学参数见下表。由结果可知，小鼠体内药物动力学实验结果表明SN_38溶液剂和注射用SN-38冻 干粉针均符合双隔室模型，消除半衰期分别为1. 4h7和8. 3h9，AUC分别为7. 64(pg/mL)*h 和8. 66(pg/mL)*h ；组织分布实验结果表明经基喜树碱制成前体脂质体后给药，在小鼠 肝、脾、肺、肾、肠中的滞留时间及药物量均有所增加，其中以肝组织增加最显著。前体脂质 体载药系统保护了 SN-38的内酷形式，增加了亲脂性和在体内的滞留时间，提供了一定的 靶向作用，为提高疗效，降低毒副作用提供了实验依据。
图1为本发明的工艺流程图
具体实施例方式实施例1(1)将大豆磷脂(注射级)30克，胆固醇(注射级)10克，a-生育酚2克溶于 2000ml乙醇(分析纯)中，真空旋转转移有机溶剂，真空恒温干燥箱中放置过夜挥干残余有 机溶剂，制备得脂质干膜，以上操作均在无菌条件下完成。
(2)将7-乙基-10-羟基喜树碱1.67克，蔗糖(注射级)100克溶于碳酸钠-碳酸 氢钠缓冲盐溶液(PH = 9. 9) 1000ml中，在45°C水化温度下用上述碱性缓冲盐溶液水化脂质 干膜，待水化完全后用乳勻机降低粒径至100-200nm，即得含药脂质体。以上操作均在无菌 条件下完成。(3)真空冷冻干燥含药脂质体溶液，得到黄色无定型含药冻干粉，用乙酸_乙酸钠 缓冲盐溶液(pH = 3. 8) 1000ml复溶，孵育24小时，取半成品检验，定装样量。过滤除菌，再 次冻干，得到白色无定形含药脂质体冻干粉，封口即得。检验合格，印字包装后入库。实施例2(1)将神经鞘磷脂(注射级)40克，胆固醇(注射级)10克，a _生育酚2克溶于 2000ml乙醇(分析纯)中，真空旋转转移有机溶剂，真空恒温干燥箱中放置过夜挥干残余有 机溶剂，制备得脂质干膜，以上操作均在无菌条件下完成。(2)将7-乙基-10-羟基喜树碱2克，海藻糖(注射级)200克溶于磷酸二氢钾-氢 氧化钠缓冲液(PH = 9. 9) 2000ml中，在45°C水化温度下用上述碱性缓冲盐溶液水化脂质干 膜，待水化完全后用乳勻机降低粒径至100-200nm，即得含药脂质体。以上操作均在无菌条 件下完成。(3)真空冷冻干燥含药脂质体溶液，得到黄色无定型含药冻干粉，用磷酸氢二 钠_柠檬酸缓冲液(PH = 3. 8) 2000ml复溶，孵育24小时，取半成品检验，定装样量。过滤除 菌，再次冻干，得到白色无定形含药脂质体冻干粉，封口即得。检验合格，印字包装后入库。实施例3(1)将磷脂酰胆碱(注射级)30克，胆固醇(注射级)10克，a-生育酚2克溶于 2000ml乙醇(分析纯)中，真空旋转转移有机溶剂，真空恒温干燥箱中放置过夜挥干残余有 机溶剂，制备得脂质干膜，以上操作均在无菌条件下完成。(2)将7-乙基-10-羟基喜树碱1克，乳糖(注射级)300克溶于巴比妥钠-盐酸 缓冲液(PH = 9. 9) 3000ml中，在45°C水化温度下用上述碱性缓冲盐溶液水化脂质干膜，待 水化完全后用乳勻机降低粒径至100-200nm，即得含药脂质体。以上操作均在无菌条件下完 成。(3)真空冷冻干燥含药脂质体溶液，得到黄色无定型含药冻干粉，用柠檬酸_氢氧 化钠_盐酸(PH = 3. 8) 3000ml复溶，孵育24小时，取半成品检验，定装样量。过滤除菌，再 次冻干，得到白色无定形含药脂质体冻干粉，封口即得。检验合格，印字包装后入库。实施例4(1)将磷脂酰丝氨酸(注射级)30克，胆固醇(注射级)10克，a-生育酚2克溶 于2000ml乙醇(分析纯)中，真空旋转转移有机溶剂，真空恒温干燥箱中放置过夜挥干残 余有机溶剂，制备得脂质干膜，以上操作均在无菌条件下完成。(2)将7-乙基-10-羟基喜树碱1. 67克，氨基乙酸(注射级)200克溶于碳酸钠-碳 酸氢钠缓冲盐溶液(PH = 9. 9) 4000ml中，在45°C水化温度下用上述碱性缓冲盐溶液水化脂 质干膜，待水化完全后用乳勻机降低粒径至100-200nm，即得含药脂质体。上操作均在无菌 条件下完成。(3)真空冷冻干燥含药脂质体溶液，得到黄色无定型含药冻干粉，用柠檬酸_柠檬 酸钠(pH = 3. 8) 4000ml复溶，孵育24小时，取半成品检验，定装样量。过滤除菌，再次冻干，得到白色无定形含药脂质体冻干粉，封口即得。检验合格，印字包装后入库。实施例5(1)将大豆磷脂(注射级)30克，胆固醇(注射级)10克，a-生育酚2克溶于 2000ml乙醇(分析纯)中，真空旋转转移有机溶剂，真空恒温干燥箱中放置过夜挥干残余有 机溶剂，制备得脂质干膜，以上操作均在无菌条件下完成。(2)将7-乙基-10-羟基喜树碱1. 67克，蔗糖和海藻糖(注射级)(1 1) 100克 溶于碳酸钠-碳酸氢钠缓冲盐溶液(PH = 9. 9) 1000ml中，在45°C水化温度下用上述碱性缓 冲盐溶液水化脂质干膜，待水化完全后用乳勻机降低粒径至100-200nm，即得含药脂质体。 上操作均在无菌条件下完成。(3)真空冷冻干燥含药脂质体溶液，得到黄色无定型含药冻干粉，用乙酸_乙酸钠 缓冲盐溶液(pH = 3. 8) 1000ml复溶，孵育24小时，取半成品检验，定装样量。过滤除菌，再 次冻干，得到白色无定形含药脂质体冻干粉，封口即得。检验合格，印字包装后入库。
权利要求
7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针，其特征在于，其200支的处方组成及用量如下7-乙基-10-羟基喜树碱 1-10克，磷脂 30-60克，胆固醇 10-40克，VE 2-8克，冻干保护剂 100-300克，有机溶剂 2000-8000毫升，碱性缓冲盐溶液 1000-4000毫升，酸性缓冲盐溶液 1000-4000毫升。
2.根据权利要求1所述的7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针，其特征在于，所述 的磷脂为神经鞘磷脂，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，心磷脂或它们的混合物，或以上单一磷 脂衍生物。
3.根据权利要求1所述的7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针，其特征在于，所述 的冻干保护剂为乳糖，海藻糖，蔗糖，氨基乙酸或它们的混合物。
4.根据权利要求1所述的7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针，其特征在于，所述 的碱性缓冲盐溶液选自磷酸二氢钾_氢氧化钠缓冲液，巴比妥钠_盐酸缓冲液，碳酸钠_碳 酸氢钠缓冲液。
5.根据权利要求1所述的7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针，其特征在于，所述 的酸性缓冲盐溶液选自磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液，柠檬酸_氢氧化钠_盐酸，柠檬酸_柠 檬酸钠，乙酸-乙酸钠缓冲液。
6.根据权利要求1所述的7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针，其特征在于，所述 的有机溶剂为氯仿，乙醚，乙醇或任意两种的混合物。
7.—种如权利要求1所述的7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针的制备方法， 其特征在于，将磷脂，胆固醇，VE加入有机溶剂中，转移有机溶剂，制备脂质干膜；将7-乙 基-10-羟基喜树碱，冻干保护剂加入pH = 9. 9碱性缓冲盐溶液，在水化温度下加入碱性缓 冲盐溶液水化，水化完全后真空冻干，取PH = 3. 8酸性缓冲盐溶液复溶即得。
8.根据权利要求7所述的7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针的制备方法，其特 征在于，包括以下步骤(1)将磷脂，胆固醇，VE溶于有机溶剂中，真空旋转转移有机溶剂，真空恒温干燥挥干 残余有机溶剂制备脂质干膜，以上操作均在无菌条件下完成；(2)在无菌条件下，将7-乙基-10-羟基喜树碱，冻干保护剂溶于碱性缓冲盐中，在水化 温度下用pH = 9. 9碱性缓冲盐溶液水化脂质干膜，水化完全后用乳勻机降低粒径，即得含 药脂质体，上操作均在无菌条件下完成；(3)真空冷冻干燥得到的含药脂质体冻干粉，用Ph= 3. 8酸性缓冲盐溶液复溶，孵育， 取半成品检验，定装样量，过滤除菌，再次冻干，封口即得。
9.根据权利要求8所述的7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针的制备方法，其特 征在于利用两次冻干法制备冻干粉针。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，公开一种注射用7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针及其制备方法。本发明的处方组成如下7-乙基-10-羟基喜树碱1-10克，磷脂30-60克，胆固醇10-40克，VE 2-8克，冻干保护剂100-300克，有机溶剂2000-8000毫升，碱性缓冲盐溶液1000-4000毫升，酸性缓冲盐溶液1000-4000毫升。制备方法如下将脂溶性成分溶于有机溶剂，水溶性成分溶于碱性缓冲盐，转移有机溶剂后加入碱性缓冲盐水化，真空冷冻干燥后，用酸性缓冲盐复溶，孵化后过滤灭菌，再次冻干即得注射用7-乙基-10-羟基喜树碱脂质体冻干粉针。本发明解决了7-乙基-10-羟基喜树碱溶解度低，体内代谢快的问题，起到了降低毒性反应，消除副反应的作用，有较高靶向分布特性，延长代谢时间，提高溶解度和生物利用度。
文档编号A61P35/00GK101874788SQ20101018678
公开日2010年11月3日 申请日期2010年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者叶田田, 王淑君 申请人:沈阳药科大学