专利名称：结肠直肠细胞采样设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于从人类对象的结肠直肠黏膜的表面采集脱落的细胞的样本的设 备，涉及包括所述设备的套件和使用所述设备采样结肠直肠细胞的方法。
背景技术：
散发的结肠直肠癌(CRC)是侵袭西方发达国家的人的肿瘤疾病中发生得最频繁 的和最致命的之一。它主要是侵袭年龄在50岁以上的人。较早地诊断CRC的严重的障碍为在大多数情况中没有较早地、容易地识别的临床 表现。仅在疾病的晚期的阶段，当较大的肿瘤已经形成，导致疼痛、出血和堵塞症状时，能够 容易地诊断该疾病。然而，疾病的晚期也与扩散性的或转移性的肿瘤相关。从而，在疾病的 晚期阶段之前检测结肠直肠的肿瘤将大大地增加成功的外科手术介入的可能性和总的生存率。在没有较早地、容易地识别的临床表现的情况下，对于适合的CRC筛选方法的研 究已经持续了几十年。不幸地，当前还没有结合低侵入、简单和低成本与高灵敏度和特异性 的CRC筛选技术。用于CRC的两种筛选方法为柔性的结肠镜检查/乙状结肠镜检查和粪便 潜血测试(FOBT)Rennert，G. Recent Results Cancer Res. 2003 ； 163 :248_253，Atkin， ff. Scand. J. Gastroenterol. (Suppl. )2003 ；237 :13-16,ffalsh, J. M.禾口 Terdiman，J. P. JAMA 2003 ；289 :1288-1296。然而，全部这些方法具有重大的缺点。柔性的结肠镜检查/乙状结肠镜检查被认为是精确的和可靠的诊断过程。然而， 其侵入、成本和需要熟练的和有经验的专业人员执行过程使得其在日常的筛选中不实用。 对于最近提出的计算机断层结肠镜照相(虚拟的结肠镜检查)也存在同样的问题。F0BT便宜并且简单，然而，其产生不能接受的高比率的假阴性和假阳性结果。尽管 存在这些限制，F0BT目前是精选的筛选方法。已经研究基于肿瘤存在的直接指示器的诊断CRC的替代的方法。已经确定 的一个指示器为分析脱落的结肠细胞。结肠细胞的脱落(即，细胞从结肠黏膜的有 序地有组织的上皮层自发地脱离)为人类内脏内的重要的细胞更新机制Eastwool， G. L. Gastroenterology 1977;41:122-125。对从结肠的或直肠的洗涤物(即，通过冲洗 结肠直肠黏膜)获取的结肠细胞的细胞学的分析在大约50年以前执行Bader，G. M.和 Papanicolau,G. N. Cancer 1952 ；5 :307_14。此工作示出了能够在CRC病人体内检测到形 态学上特殊的脱落的肿瘤的细胞。然而，获取这些样本的方法(侵入的结肠灌洗过程)存 在与乙状结肠镜检查/结肠镜检查相同的缺点，并且需要对获取的样本立即进行详细地细 胞学分析。普遍的获取脱落的上皮细胞的样本的途径为将它们从人类粪便离析。人类粪便被确定为这样的细胞的来源，因为结肠上皮的脱落的细胞能够与其它排泄物一起排泄。大约15年以前，P. P. Nair和他的同事开始首次尝试使用从人类粪便中离析的结 肠细胞用于诊断和研究目的。他们自称能够使用基于密度梯度离心法Iyengar，V.等人， FASEB J 1991 ;5 :2856-2859，Albaugh，G.P.等人，Int. J. Cancer 1992 ;52 :347_350的离 析过程从数克分散的粪便材料中回收数千个“能活的”脱落的细胞。然而，由于在诸如在粪 便中发现的腐蚀性的厌氧的环境中存在保存得好的结肠细胞的低可能性，已经对这些热望 的声称的真实性产生怀疑。此外，在他们1991年的参考资料中提出的形态学的证据是不足 以令人相信的。P.P. Nair和他的团体中的成员坚持他们的途径的有效性Nair，P.等人， J. Clin. Gastroenterol. 2003 ；36 (5Suppl.) S84-S93，但是没有基于他们的研究的结果产 生任何实际的进展。然而，尽管P. P. Nair和他的同事缺乏实际的进展，使用人类大便用于诊断和研 究的目的仍然是活跃的研究领域，因为它不与任何侵入的介入相关。许多团体已经着手 尝试从人类大便样本中离析源自结肠细胞的遗传物质(DNA)，以便开发利用恶性肿瘤的分 子的生物标志的诊断过程。虽然直接从均质化的粪便离析的DNA能够被增强并且分析是 否存在与癌相关的基因改变，但没有用于癌的高度可靠的单分子生物标志导致使用反映 已知以相对高的频率存在于恶性细胞内的许多基因改变的多分子标志。已经描述了与微 伴行静脉标志分析结合的数个提议同时检测APC，K-ras和p53基因内的多个变异的途径Ahlquist，D. A.等人，Gastroenterology 2000 ；119 1219-1227, Dong, S. M.等人，J. Natl. Cancer Inst. 2001 ；93 858-865, Rengucci, C.等人’ Clin. CancerRes. 2001 ；93 858-865, Traverso, G.等人，N. Engl. J. Med. 2002 ；346 :311-320。粪便DNA内的甲基化变化也已经 被认为是可能的诊断标志Muller，H.M.等人，Lancet 2004;363:1283-1285。虽然通过 多目标分子化验检测结肠直肠肿瘤好像是可行的，但由于高成本和涉及的实验室过程的相 对复杂，用于筛选目的的这些方法的有效性仍然是有问题的。对于从均质化的大便样本内析取的DNA内的CRC分子标志的搜索已经超过了脱落 的结肠细胞的最初的采集/离析的重要性。然而，很明显，对于人类DNA析取，均质化的大 便是困难的材料。特别是，粪便内的丰富的细菌能够干扰结肠细胞DNA回收过程，并且在存 在人类结肠的厌氧的细菌区系的情况下，发生迅速的哺乳动物DNA损伤和降解。基于脱落的结肠细胞离析的途径的发展缓慢，部分原因在于对正常生理情况和疾 病中的内脏中的细胞脱落的知识的惊人的缺乏。当前对结肠细胞脱落的观点仍然受到老 的并且未经证明的假设的影响，该假设的意思是在从结肠腺管移动到鲁米那上皮时，几乎 全部分化的结肠细胞“强制性地”脱落(即，假设因为结肠上皮的细胞增殖速率高并且全 部细胞最终脱落，在粪便物中存在上百万的结肠细胞)。然而，正在认识到，在现场的循序 渐进式的细胞死亡或调亡至少和脱落一样重要Hall，P. A.等人，J. Cell Sci. 1994 ；107 3569-3577，Barkla，D. H.和 Gibson，P. R. Pathology 1999 ；31 230-238,Ahlquist,D. A.等 人，Hum. Pathol. 2000 ；31 :51_57。从结肠黏膜移除细胞的这两种主要机制之间的关系可 以在结肠直肠瘤形成中经历重大的变化Ahlquist，D.A.等人(上文)。的确，现在已 经证实导致细胞调亡的正常的控制通路在恶性肿瘤中严重地被撤消控制Bedi，A.等人， Cancer Res. 1995；55 :1811_1816，LaCasse, E. C.等人，Oncogene 1998 ；17 :3247_3259， Jass, J. R. Gastroenterology 2002 ；123 :862_876，Oren, M. Cell Death Differ. 2003 ；10
4431-442，Boedefeld, W. Μ. 2nd 等人，Ann. Surg. Oncol. 2003 ；10 :839_851 ，导致癌细胞调亡 的可能性大大减小。同时，已知当癌发展时瘤细胞附着力显著地减小Yamamoto，H.等人， Cancer Res. 1996 ；56 :3605_3609，Haier, J.和 Nicolson, G. L. Dis. Colon Rectum2001 ； 44 :876-884，Leeman, M. F.等人，J. Pathol. 2003 ；201 :528_534。后面的现象对于转移性 的传播更加重要，然而，在结肠直肠的瘤形成中，对调亡和细胞内的附着力/交流的降低的 结合的抑制大大增加恶性的细胞从正在生长的瘤的表面脱离的可能性。如果是这种情况， 其中的一些可能能够保持增殖能力的脱落的瘤细胞应该和它们的正常的(非瘤的)脱落 的对应物在以下方面不同i)由于容易从瘤表面脱落，量更加大；及ii)具有强得多的“生 存”能力，特别是由于对缺乏氧气的更高的抵抗力Graeber，T.G·等人，Nature 1996 ；379 88-91。一旦脱落，这些细胞进入相对良好地充氧的“粘细胞层”，
“粘细胞层”从内脏的粪便内容物分开结肠黏膜并且永久地与粪便流一起向远侧 运动[Ahlquist, D. A.等人(上文)。直到最近，在结肠直肠黏膜和内脏的粪便内容物之间提供分界面的粘细胞层的 重要性才被理解。实验性的研究指示能够容易地从老鼠粪便的表面获取质量良好的DNA 并且将其用于更进一步的增强和基因突变分析Loktionov，Α.和0，Neill, I. K. Int. J. Oncol. 1995 ；6 :437_445。这些较早的实验认为由从人类大便表面(大便表面能够被 认为是与粪便一起排泄的粘细胞层的一小部分)离析的结肠细胞析取的DNA能够用于分 子的分析。已经开发出通过从冷却的粪便的表面洗刷掉细胞并且通过免疫的磁性分离过 程收集他们来从人类完整的大便样本离析脱落的细胞的方法Loktionov，Α.等人，Clin. Cancer Res. 1998 ；4 :337_342。虽然在此方向的工作开始计划为用来开发用于CRC的分 子诊断化验，但是发现对来自人类大便表面的源自结肠细胞的DNA的简单的定量分析能够 用于CRC诊断和筛选，因为CRC病人体内的相对的DNA的量远高于健康个体。其他作者 也已经报告了更大量的在从CRC病人获取的分散的或均质化的大便样本内的脱落的细胞 [Dutta, S. K.等人，Gastroenterology 1995 ;108 (Suppl.) ；A463或 DNA [Villa,E.等人， Gastroenterology 1996 ；110 1346-1353，然而，在那些研究中观察到的健康人和癌症病 人之间的差异不足够大以被认为是诊断上有效的。相反，Loktionov等人(上文)能够利 用与从大便表面离析的细胞析取的DNA的量与大便重量有关的计算的指标(大便DNA指标 或SDNAI)示出在CRC病人和健康个体之间的显著差异的存在。基于SDNAI的诊断方法在美国专利号6，187，546中描述。虽然其开始的试验的技 术和结果明显地突出了用于CRC筛选的非常有效的、简单的并且便宜的途径，其具有许多 阻碍其商业化和彻底地引入临床实践的本质上的缺点(处理完整的大便的明显的困难并 且特别是过程标准化的不可能性)。还明白了使用此技术能够从人类大便表面获取相对小 量的保存良好的细胞Bandaletova等人，APMIS 2002 ；110 :239_246。这些问题、标准化 的困难至关重要，导致对关于使用从大便样本离析的脱落的结肠细胞用于大规模的CRC筛 选的严重的怀疑。存在大量指示覆盖人类直肠黏膜的粘细胞层特别富于保存良好的脱落的结肠细 胞的证据。另外，在CRC病人体内，此层的细胞内容物呈现远高于健康个体体内，这主要是 由于大大增加的高度抵抗恶性的结肠细胞的存在。因此，在更适应于自主的存在的CRC病 人的瘤细胞中，应该在直肠的脱落的细胞池中在数量上占优势。数个描述远侧地(例如，肛门地)培植来自移除的结肠直肠瘤的持久的脱落的细胞的最近的报告Jermer，D. C.等 人，Dis. Colon Rectum 1998 ；41 1432-1434，Wind, P.等人，Dis. Colon Rectum 1998 ；41 1432-1434，Isbister, ff. H. Dig. Surg. 2000 ；17 :81_83，Hyman, N.和 Kida, M. Dis. Colon Rectum 2003 ；46 :835_836，Abbasakoor，F.等人，Ann. R. Coil. Surg. Engl. 2004 ；86 :38_39
强有力地证实此假设。可能通过使用检查者的戴手套的手指进行的常规的手指直肠检查直接进入直肠 黏膜。然而，虽然能够通过利用此简单的操作实现与直肠的粘细胞层接触，在从直肠移除手 指期间，材料的显著的损失和同时发生的被肛管的不相关的鳞状上皮污染是不可避免的。 从手套制备的用于直肠检查的涂片已经示出保存良好的结肠细胞，同被鳞状上皮的细胞高 度污染相结合。从而，非常需要在没有在从直肠移除细胞采集表面阶段材料损失和被其它组织成 分严重污染的问题的情况下从直肠黏膜表面直接采集脱落的上皮细胞。这样的细胞不仅能 够用于定量的细胞和DNA分析，还能够用于探查附加的癌生物标志(例如，蛋白质)的存在 并且最终免疫组织化学地和细胞学地评估。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供了结肠直肠细胞采样设备，包括具有远侧的插入端部、近侧的端部和可关闭的内部腔的结肠直肠插入构件；具有外部细胞采样表面和内部表面的柔性的隔膜，其中，所述隔膜密封地接附到 所述插入构件的远侧的插入端部并且被保持在内部腔内；使得，使用中，施压内部腔到至少第一提高的压力导致隔膜从所述插入构件的远 侧的端部发出以与结肠直肠黏膜表面接触，并且施压内部腔到第二减小的压力导致隔膜反 向并且返回所述插入构件的内部腔。该设备通过在插入和撤回时将柔性的隔膜保持在插入构件内克服手指采样的困 难，使得没有材料损失并且样本不会被来自其它表面(例如，鳞状上皮)的细胞污染。通过直接采样黏膜表面，该设备克服与完整的大便采样有关的困难，包括工作的 使人不愉快的性质，能够获取的细胞的低浓度，被排泄物的高度污染(特别是细菌)，并且 特别是与这样的问题有关的方法标准化的困难，例如，大便尺寸和稠度的大的可变性。虽然该设备为侵入的，其侵入远小于当前用于结肠镜检查/乙状结肠镜检查的设 备，并且不需要由熟练的和受过良好训练的操作者操作。该设备甚至可以自己操作。减小 的侵入等级和没有并发症风险可能导致更多的病人接受。这些优点又允许执行更多采样， 并且以更低的成本。在本发明的优选的实施例中，柔性的隔膜是可扩展的并且由弹性的材料构造。更 优选地，柔性的隔膜由基于腈、乳胶或橡胶的物质构造。在本发明的优选的实施例中，插入构件的可关闭的内部腔关闭。在本发明的优选的实施例中，细胞采样设备还包括用于施压内部腔的装置，其中， 所述装置接附到插入构件的近侧的端部。优选地，所述用于施压内部腔的装置经由存在于插入构件的近侧的端部处的阀 (例如，自密封的阀)接附到细胞采样设备。
应当理解，用于施压内部腔的装置可以包括适合于将流体(例如，液体或气体)施 加到柔性的隔膜的任何装置。优选地，用于施压内部腔的装置包括压缩空气源、注射器或泵 (例如，球状物)。优选地，用于施压内部腔的装置包括包含能够将预先限定的量的第一提高的压力和第二减小的压力输送到细胞采样设备的机械设备的压缩空气源。此实施例具有准确地调 节插入构件内的压力的优点，并且机械设备具有与无限数量的一次性的结肠直肠细胞采样 设备一起重复使用的优点。更优选地，用于施压内部腔的装置包括注射器。注射器的使用允许简单的操作和 将固定体积的空气泵送到柔性的隔膜内(优选地至少增加存在于柔性的隔膜内的空气的 体积的十倍)。例如，在本发明的实施例中，100毫升注射器接附在插入构件的近侧的端部， 所述注射器的柱塞可以初始设定在70-90毫升标记处。因此能够通过将柱塞推到其最大 程度(例如，到0毫升刻度)施加预先限定的量的第一提高的压力，这将填充柔性的隔膜 70-90毫升空气体积。随后能够通过将注射器的柱塞向后拉到其最大程度(例如，到100毫 升标记)施加预先限定的量的第二减小的压力，这将隔膜拉到插入构件的内部腔内。在本 发明的优选的实施例中，注射器可以提供有一个或多个保持特征部(例如，卡扣位置)以标 记在使用期间的每个阶段的注射器的柱塞位置(例如，一个插入前的位置，一个插入期间 的位置和一个撤回后的位置)。用于施压内部腔的装置为注射器的优点为结肠直肠细胞采 样设备可以适合于装配到普通的通用的和一次性的实验室和医院装备上。在本发明的优选的实施例中，所述柔性的隔膜的外部细胞采样表面的表面积是可 复现地可控制的。这允许使得固定的表面积与要采样的结肠直肠黏膜表面接触，由此提供 与存在于结肠直肠黏膜表面上的脱落的细胞的量关联的对脱落的细胞的能够定量的采集。 优选地，通过用于施压内部腔的装置控制表面积。这允许使得固定的表面积与要采样的黏 膜表面接触。在本发明的优选的实施例中，插入构件适合与直肠进入管接合。此实施例具有允 许首先插入直肠进入管和密闭器，诸如橄榄形密闭器(连结的直肠进入管和密闭器通常已 知为直肠镜)，以打开直肠腔，随后在插入本发明的采样设备之前撤回密闭器的优点。采样 设备能够随后与直肠进入管一起保留在适当的位置持续获取样本所需要的任何一段时间。 一旦移除采样设备，随后把密闭器放回原处并且密闭器和直肠进入管将被一起撤回。在本发明的优选的实施例中，插入构件构造为允许自己插入。在这样的实施例中， 插入构件与直肠进入管一起插入并且因此消除对密闭器的需要(例如，插入构件具有倒圆 的远侧的插入端部)。此实施例提供本发明的采样设备可以自己操作的优点，例如，病人将 能够容易地从他们的直肠黏膜采样脱落的细胞。在此实施例中，预想插入构件和直肠进入 管一起插入并且一起移除并且仅在移除后分开。在本发明的优选的实施例中，当被保持在所述插入构件的内部腔内时，柔性的隔 膜形成接收器，使得可以添加流体。本发明的此实施例将允许在已经获取样本以后将试剂 添加到采样设备，不需要将样本传递到另外的接收器由此从样本损失一些材料。在本发明的优选的实施例中，插入构件的内部腔提供有附着装置。本发明的此实 施例具有一旦已经获取样本并且第二减小的压力的施加已经将柔性的隔膜拉入插入构件 的内部腔内时，朝向插入构件的内部腔的壁拉柔性的隔膜的效果。此特征具有当用液体填充时提供稳定的接收器的优点。在本发明的优选的实施例中，插入构件适合与密封装置接合以密封所述接收器。 这将允许在对样本执行更进一步的分析之前存储并且传送包含样本的采样设备。优选地，密封装置为有螺纹的帽。有螺纹的帽具有密封接收器以防止样本损失并 且还允许移除以用于更进一步的分析的优点。在细胞采样设备包括用于施压内部腔的装置的实施例中，所述装置优选地能够从 插入构件分离。这具有将采样设备转化为小型化验小瓶的优点，其可以与用于随后的筛选 反应的许多其它小型化验小瓶一起方便地传送和存储。在本发明的第二个方面，提供了用于从人类对象的结肠直肠黏膜表面采集样本的 套件，其包括如在这里限定的结肠直肠细胞采样设备和直肠进入管并且选择地包括密闭
ο直肠进入管的使用提供为用于采样设备的更加舒服的插入和防止采样设备和除 了要采样的黏膜表面以外的任何表面接触。除直肠进入管之外，密闭器的使用可以减轻插 入直肠进入管的不适。在本发明的优选的实施例中，该套件可以附加地包括润滑剂，诸如凝胶润滑剂 (例如，K-Y凝胶)。这具有在插入本发明的密闭器或细胞采样设备期间提供更强的舒适度 的优点。在本发明的优选的实施例中，在连结的密闭器和直肠进入管插入直肠腔以后，密 闭器从直肠进入管脱离。在本发明的优选的实施例中，该套件还包括密封装置，诸如有螺纹的帽，以与插入 构件接合。在本发明的优选的实施例中，该套件还包括一种或多种试剂，诸如缓冲剂。缓冲剂 的使用允许在更进一步的分析之前准备好样本。在本发明的优选的实施例中，缓冲剂可以存在于有螺纹的帽内(例如，作为泡 包)，使得将帽固定到插入构件将缓冲剂释放到接收器内(例如，通过刺破泡包)以在更进 一步的分析之前悬浮存在于柔性的隔膜的采样表面上的细胞。在本发明的优选的实施例中，缓冲剂为细胞溶解缓冲剂，具有在DNA析取之前提 供关键步骤的优点。在本发明的替代地优选的实施例中，缓冲剂为具有允许在结果的细胞 样本上进行增强的细胞学的、生物化学的和免疫组织化学的分析的优点的细胞保存介质。 优选地，细胞保存介质补充以一种或多种细胞培养组分(例如，营养物和抗生素)。本领域中的普通技术人员还应当理解，任何前面描述的设备或套件适合于从人类 结肠直肠黏膜表面采样脱落的上皮组织(例如，结肠细胞)。在本发明的第三个方面，提供了在不通过接触其它身体表面污染样本的情况下从 人类对象的结肠直肠黏膜表面定量地采样脱落的细胞的方法，包括以下步骤在之前不与任何其它身体表面接触的情况下将包括隔离的细胞采样表面的采样 设备接近要采样的结肠直肠黏膜表面；使得细胞采样表面与结肠直肠黏膜表面接触，使得 从黏膜表面获取样本；及在隔离的细胞采样表面或样本不与任何其它身体表面接触的情况下从接近黏膜 表面移除采样设备和样本。
8
此方法拥有从黏膜表面直接采样脱落的细胞的关键步骤，并且确保不会因为细胞 采样隔膜与其它身体表面接触污染样本。通过隔离采样表面避免污染，其中，隔离可以限定 为在使得采样表面接触结肠直肠黏膜表面之前或在从结肠直肠黏膜表面采集细胞以后隔 绝或分开采样表面。在本发明的第四个方面，提供了从人类对象的结肠直肠黏膜表面采样脱落的细胞 的方法，包括以下步骤在柔性的隔膜的外部细胞采样表面不会在之前与任何其它身体表面接触的情况 下将根据本发明的结肠直肠细胞采样设备插入直肠腔并且将所述设备接近结肠直肠黏膜 表面；施压内部腔到至少第一提高的压力，使得柔性的隔膜从采样设备的远侧的端部发 出；用所述隔膜的外部细胞采样表面接触结肠直肠黏膜表面，使得从结肠直肠黏膜表 面获取脱落的细胞的样本；将第二减小的压力施加到内部腔，使得柔性的隔膜反向并且存在于所述隔膜的细 胞采样表面上的样本返回细胞采样设备的内部腔；及在隔膜或样本不与任何其它身体表面接触的情况下从接近直肠结肠黏膜表面移 除细胞采样设备并且从直肠腔撤回所述设备。应当理解，细胞采样设备可以附加地需要单独的或与密闭器一起的直肠进入管。从而，在本发明的优选的实施例中，该方法附加地包括以下步骤将连结的根据本发明的结肠直肠细胞采样设备和直肠进入管插入直肠腔；并且从直肠进入管移除所述采样设备和样本。在本发明的优选的实施例中，该方法附加地包括以下步骤将连结的直肠进入管和密闭器插入直肠腔；在插入采样设备之前从直肠进入管撤回密闭器；移除采样设备和样本；经由直肠进入管把密闭器放回原处；及从直肠腔撤回连结的直肠进入管和密闭器。在本发明的第五个方面，提供了从人类对象的结肠直肠黏膜表面采样脱落的细胞 的方法，包括以下步骤经由肛管将直肠进入管和密闭器插入直肠腔；从直肠进入管撤回密闭器；在采样设备的柔性的隔膜不与任何其它身体表面接触的情况下经由直肠进入管 将根据本发明的结肠直肠细胞采样设备插入直肠腔；施压内部腔到至少第一提高的压力，使得柔性的隔膜从采样设备的远侧的端部发 出；用所述隔膜的外部细胞采样表面接触结肠直肠黏膜表面；从结肠直肠黏膜表面获取脱落的细胞的样本；将第二减小的压力施加到内部腔，使得柔性的隔膜反向并且存在于所述隔膜的细 胞采样表面上的样本返回细胞采样设备的内部腔；
在采样设备的柔性的隔膜不接触任何身体表面的情况下经由直肠进入管从直肠腔撤回细胞采样设备；经由直肠进入管将密闭器放回原处；及
经由肛管从直肠撤回直肠进入管和密闭器。应当理解，在直肠进入管保持插入直肠腔的同时，可以将另一个本发明的细胞采 样设备引入直肠腔。例如，可以引入包括细胞溶解缓冲剂的第一细胞采样设备以允许对任 何采样的细胞进行DNA析取和分析(例如，定量)。此后，可以引入包括细胞保存介质的第 二细胞采样设备以允许对任何采样的细胞进行细胞学的、生物化学的和免疫组织化学的分 析。在本发明的替代的方面，提供了用于从定位在对象的直肠腔内的黏膜表面采集样 本的采样设备，包括在远侧的端部具有打开腔并且在近侧的端部具有可关闭的腔的大致圆柱形的主 体；保持在大致圆柱形的主体内并且形成分开打开的远侧的腔和可关闭的近侧的腔 的密封件的柔性的隔膜；该隔膜的两个表面为近侧的表面和远侧的表面；及用于充气和放气的装置，其中当关闭时，用于充气的装置能够增加可关闭的近侧的腔的内部流体压力，导致隔 膜从大致圆柱形的主体的远侧的端部外翻，直到隔膜的远侧的表面接触要采样的黏膜表 面；及在隔膜的远侧的表面已经接触要采样的黏膜表面以后，用于放气的装置能够降低 关闭的近侧的腔的流体压力，导致隔膜反向，使得隔膜被保持在大致圆柱形的主体内。在本发明的优选的实施例中，放气装置为阀。本发明的此实施例特别适合与弹性 的隔膜一起使用，其中可关闭的近侧的腔内的内部压力大于腔外部的压力。在本发明的优选的实施例中，放气装置包括连接到阀的注射器。在本发明的第二个替代的方面，提供了从定位在人类对象的直肠腔内的黏膜表面 采样脱落的细胞的方法，包括以下步骤在之前采样隔膜不与任何其它身体表面接触的情况下将根据本发明的采样设备 接近黏膜表面；增加关闭的近侧的腔的内部压力，使得柔性的隔膜从采样设备的远侧的端部外 翻；用隔膜的远侧的表面接触黏膜表面，使得从黏膜表面获取脱落的细胞的样本；降低关闭的近侧的腔的内部压力，使得柔性的隔膜反向，并且其和样本被保持在 打开的远侧的腔内；及在隔膜或样本不与任何其它身体表面接触的情况下从接近黏膜表面移除设备和 样本。在本发明的优选的实施例中，该方法包括以下步骤将压缩空气源接附到阀，并且通过打开阀增加关闭的近侧的腔的内部压力；或将注射器接附到阀并且通过插入柱塞增加关闭的近侧的腔的内部压力。在本发明的优选的实施例中，该方法包括以下步骤
通过打开阀降低关闭的近侧的腔的内部压力；或通过撤回柱塞降低关闭的近侧的腔的内部压力。在本发明的优选的实施例中，该方法包括以下步骤将细胞溶解缓冲剂或细胞保存介质添加到采样设备的打开的远侧的腔；及密封采样设备的打开的远侧的腔。在本发明的第三个替代的方面，提供了从定位在人类对象的直肠腔内的黏膜表面 采样脱落的细胞的方法，包括以下步骤经由肛管将直肠进入管和密闭器插入直肠腔；从直肠进入管撤回密闭器；在采样设备的柔性的隔膜不与任何其它身体表面接触的情况下经由直肠进入管 将根据本发明的采样设备插入直肠腔；将采样设备连接到用于充气的装置；增加关闭的近侧的腔的内部压力，使得柔性的隔膜从采样设备的远侧的端部外 翻；用采样表面的固定的表面积接触直肠黏膜；从直肠黏膜的表面获取脱落的细胞的样本；降低关闭的近侧的腔的内部压力，使得柔性的隔膜反向，并且其和样本被保持在 打开的远侧的腔内；在采样设备的柔性的隔膜不接触任何身体表面的情况下经由直肠进入管将采样 设备从直肠腔撤回；经由直肠进入管将密闭器放回原处；经由肛管将直肠进入管和密闭器从直肠腔撤回；将细胞溶解缓冲剂或细胞保存介质添加到打开的远侧的腔；及密封采样设备的打开的远侧的腔。在本发明的第四个替代的方面，提供了筛选和诊断结肠直肠癌的方法，包括任何 上面陈列的方法，并且还包括回收从采样设备采集的样本并且对样本执行分析。在本发明的优选的实施例中，分析从DNA定量、DNA析取继之以其定量和可选的分 子分析、细胞学/细胞化学试验和生物化学测试中选择。应该注意，通过任何这些方法的筛 选的准确性将通过提供从被采样的结肠直肠黏膜表面取得的具有低污染等级和高浓度的 细胞的样本得到改进。
接下来将参考附图仅作为示例描述本发明，其中图1示出了本发明的细胞采样设备的截面图。图2示出了本发明的细胞采样设备的略图，其中用于施压的装置包括注射器。图3示出了本发明的细胞采样设备的略图，其中用于施压的装置包括压缩空气 源。图4示出了从人类对象的结肠直肠黏膜表面采样脱落的细胞所需要的部件。图5示出了使用图1-4所示设备中的任何设备从人类对象的结肠直肠黏膜表面采
11样脱落的细胞的方法的示例。图6示出了可以跟随图5所示方法的步骤的示例。
具体实施方式
细胞采样实施例描述图1所示细胞采样设备设计为用于插入直肠腔。该设备包括大致圆柱形的插入构 件1，插入构件1具有内部腔3，内部腔3在远侧的插入端部2通过柔性的和有回弹力的隔 膜4关闭，隔膜4在远侧的端部2处密封地接附到构件1。在图1所示位置中，隔膜4被保 持在腔3内，并且适合在通过装置7 (在图2中更加详细地示出)施压腔3时从腔3发出。 隔膜4具有细胞采样表面5，在图1所示的静止位置，细胞采样表面5为内表面，但是当隔膜 发出时，细胞采样表面5为外表面，并且相反的表面6在静止位置为外表面，但是当隔膜发 出时变成内表面。隔膜由基于腈、乳胶或橡胶的物质构成。在近侧的端部34，通过自密封的 阀18关闭腔3，施压装置7适合接附到自密封的阀18。图2示出了用于施压内部腔的装置7为集成的注射器的本发明的实施例，图2 还示意性地示出了从人类对象的结肠直肠黏膜表面采样脱落的细胞所必需的步骤(图 2A-2D)。图2A示出了插入直肠腔之前的细胞采样设备。注射器7大致如图1所示地接附 到插入构件1。注射器具有沿注射器7的筒32密封地滑动以改变注射器7的内部腔室33 内的体积的柱塞23。注射器7的柱塞23设定为使得70毫升空气存在于注射器7的腔室 33内。图2B示出了一旦插入直肠腔的细胞采样设备。注射器的柱塞23已经被完全地压 下，导致柔性的隔膜4充气到70毫升体积。充气的柔性的隔膜4随后与人类对象的结肠直 肠黏膜表面接触，使得任何脱落的细胞被传递到柔性的隔膜4的外表面上。图2C示出了一旦脱落的细胞已经被采样并且在从直肠腔移除之前的细胞采样设 备。注射器7的柱塞23缩回，使得80毫升空气存在于注射器7的腔室内。因此，这在腔室 内产生减小的压力，导致柔性的隔膜4被拉回插入构件1的内部腔内并且牢固地附着到插 入构件1的侧壁。减小的压力的量可以通过两个卡扣配合保持特征部24(图2C中仅示出 了其中一个)的存在预先定量。卡扣配合特征部24为定位到注射器7的筒32上的孔内的 存在于注射器7的柱塞23上的臂。卡扣配合特征部24的目的为防止从注射器7撤回柱塞 23。图2D示出了从直肠腔移除以后并且在细胞分析之前的细胞采样设备。插入构件 1的远侧的插入端部提供有适合接收20毫米直径的有螺纹的螺帽8的螺纹。帽8可以具 有包含缓冲剂的泡包，使得在将帽8旋到插入构件1时，将缓冲剂释放到由放气的柔性的隔 膜4形成的接收器内。在帽8已经被旋到插入构件1以后，注射器7可以从插入构件1分 离以允许将插入构件1转化为小型的试验小瓶，其与多个其它小瓶一起包装并且发送到用 于细胞分析的实验室。图3示出了用于施压内部腔的装置7为压缩空气源的本发明的实施例。此图示意 性地示出了机械设备9，机械设备9为通过电动马达(没有示出)操作的泵，在触发器14触 发时，机械设备9能够输送重复的剂量的第一提高的压力和随后的第二减小的压力。机械设备9能够通过与插入构件1上的定位突出部17合作的存在于机械设备9上的棘爪配合 定位器16接附到大致如图1和2所述的插入构件1。自密封阀18存在于插入构件1上以 确保在从机械设备9断开时维持插入构件1内的压力。插入构件1包括设计为与直肠镜接 合的叶片19并且在远侧的插入端部具有螺纹20以便接收具有包含缓冲剂的泡包21的有 螺纹的帽8。机械设备9意图为用电池供电并且可以通过电源通过充电插座12充电。机械 设备9包括空气进气过滤器25、涂橡胶的手柄13并且还具有通断开关15和指示设备9何 时准备好和第一和第二压力施加周期何时完成的发光二极管10和11。使用中，使用者通过涂橡胶的手枪型手柄把手13握住机械设备9并且将机械设备 9接附到插入构件1。随后将插入构件插入直肠腔，其中插入构件1使用叶片19与直肠镜 接合，这使得能够改进穿透的一致性。使用者通过压触发器14施加第一提高的压力，导致 将空气通过空气进气过滤器25抽入机械设备9，其随后被压缩并且导致柔性的隔膜从插入 构件1的远侧的端部发出以与结肠直肠黏膜表面接触。使用者随后通过第二次压触发器14 施加第二减小的压力，导致柔性的隔膜返回插入构件1的内部腔。一旦细胞采样完成，插入 构件1从直肠镜脱离并且机械设备9从插入构件1脱离并且通过自密封阀18维持插入构 件1内的压力。可以随后将具有包含缓冲剂的泡包21的有螺纹的帽8旋到插入构件1上 的螺纹20，导致缓冲剂被释放到通过放气的柔性的隔膜形成的接收器内。随后可以通过接 附到后来的插入构件1重复使用机械设备9。接触印刷(touch-print)细胞采样技术所需要的部件从人类对象的结肠直肠黏膜表面采样脱落的细胞所需要的部件在图4中呈现。i)进入直肠黏膜能够通过使用直肠进入管29实现，直肠进入管29能够为对用于 直肠检查的现有的器械(例如，直肠镜22)的修改。直肠进入管29包括装备有密闭器30 的刚性管(具有手柄)，密闭器30提供橄榄形端部和连续的表面以促进将直肠进入管29通 过肛管引入直肠。ii)图4所示的细胞采样设备1大致如图1所示并且具有与肛门进入管的内部直 径相容的外部直径，即，在15-20毫米的范围内。iii)压缩空气源7用来提供用于施压内部腔的装置。用于施压的装置7可以包括 注射器(如图2所述)、空气泵(如图3所述)或压缩空气的小型容器(小型钢瓶)。能够 通过使用固定的空气体积(简单的注射器解决方案)或通过达到固定的空气压力等级(为 此目的需要精确阀)限制/控制细胞采样设备内部的空气压力。iv)具有特定的缓冲剂35 (不同的缓冲剂用于不同的目的，诸如DNA或RNA析取或 用于更进一步的分析的细胞离析/分离)的瓶或管。v)用于细胞采样设备的密封的盖8 (如果执行立即DNA或RNA析取，细胞/蛋白质 溶解反应需要，如果不是立即使用，例如从手术室/门诊部传送到实验室，细胞离析过程并 且特别是材料的存储/传送需要)。过程需要的部件可以开发为用作一次性的套件，包括全部列出的部件，除了可以 重复使用的压缩空气源。接触印刷细胞采样技术(直肠操作)描述图5示出了使用图1-4所示的任何设备从人类对象的结肠直肠黏膜表面采样脱落 的细胞的接触印刷细胞采样技术的示例。此过程简单并且操作者执行该过程不需要对直肠病学或内窥镜检查法的专门的培训。此过程可以由任何合格的医疗专业人员(GP、护士等 等)在当地的手术室或病人家里执行，或者此过程甚至可以由病人自己操作。
图5A示意性地示出了人类直肠28、肛管26和结肠直肠粘细胞层27的解剖学结构 的截面。应该注意，细胞采样设备与肛管的鳞状上皮的任何接触能够导致材料损失和样本 被肛管的鳞状上皮污染。过程从将在适当的位置具有密闭器30的直肠镜状的直肠进入管29引入直肠 28(图5B)开始。适当的润滑剂可以用于引入过程以促进引入过程并且减小可能由过程的 此初始阶段导致的病人的不适。一旦已经引入直肠进入管29(图5C)并且移除密闭器30，实现直接进入直肠黏膜 并且粘细胞层27打开。将插入构件1引入直肠进入管29，使得插入构件的上边缘正好定位在直肠进入管 的边缘上方(图5D)。施加第一提高的压力充气柔性的采集隔膜，以便使得隔膜接触直肠粘细胞层27， 以提供接触印刷细胞采样(图5E)。设备留在此位置大约10-15秒以实现粘细胞层的脱落 的细胞和源自细胞的材料更好地附着到采集隔膜。图5F示出了施加第二减小的压力放气柔性的隔膜并且导致其与外部细胞采集表 面上的采集的材料31 —起返回其初始位置。插入构件1从直肠进入管29移除并且用于更进一步的操作和分析。密闭器30 (能 够使用新的重新加润滑剂的密闭器30)被重新安装到直肠进入管29内，并且管29从直肠 28移除(图5G)。整个过程(直肠操作)应该占用不超过数分钟。采集的细胞处理图6示出了可以跟随上面对于图5A-5G示出的方法的步骤的示例，这些步骤应该 在细胞采集以后立即完成以避免细胞采集隔膜变干。步骤(a)示出了在细胞采集以后脱落 的细胞31在柔性的细胞采集隔膜上的细胞采样设备1。细胞采样设备的顶部隔室填充有溶 解或悬浮脱落的细胞的固定的体积的特定的缓冲剂35 (步骤(b))。不同的细胞溶解缓冲剂 或细胞保存介质能够用于DNA或RNA析取过程，特殊的缓冲剂/介质用于需要细胞离析的 应用。通过用有固定螺纹的帽8密封地关闭细胞采样设备(步骤(C))，细胞采样设备准备 好用于样本传送或存储，但是应当理解，当有螺纹的帽具有包含缓冲剂的泡包时，能够省略 步骤(b)。该设备能够随后被存储或传送用于筛选/诊断和/或研究目的的更进一步的下 游过程(步骤(d))。样本分析应该强调，与其它现有途径相比，本技术提供高得多的标准化程度。具有标准的空 气压力/体积、标准的充气的采集隔膜的面积(与直肠粘细胞层接触的面积可能变化，但是 与其它获取脱落的细胞的方式例如基于大便的技术相比，此变化可以忽略)的标准的设备 的使用和在细胞采样过程以后添加的标准的量的缓冲剂产生对细胞数量或源自细胞的物 质(例如，DNA)的量的比较的分析非常有利的条件。(a)为了结肠直肠癌筛选对样本的分析结肠直肠癌筛选意味着大范围地基于人群(限定的年龄)评估未出现不适的个体 以显露疾病的无症状的(在多数情况中为早期)病例，对这些病例的及时治疗能够减小由这些病症导致的死亡率。该方法的一个必要条件为其同时适用于数以千计/数以百万计的 人。 i)假设与无肿瘤的个体相比，有在结肠直肠癌病人的直肠粘细胞层内的结肠细胞 和源自结肠细胞的DNA的量显著较高的强的指示，很可能直接采样脱落的结肠细胞和源自 结肠细胞的材料的技术能够提供基于对从细胞析取的DNA的量的直接定量的对于结肠直 肠癌的简单的筛选测试。对于此途径，紧接细胞采样之后使用的初始缓冲剂应该为用于选 择的DNA析取过程的细胞溶解缓冲剂。缓冲剂的添加应该提供有效的细胞溶解和在传送到 专用的实验室期间和(可能地)一些存储时期期间对包含DNA的材料的保存。DNA析取方 法的选择应该基于其对高吞吐量分析的适用性，即，其应该与多通道液体处理机器人系统 相容。限定测试结果的“阳性”、“阴性”和“不确定”的DNA数量的准确值应该在临床试验 中确定。ii)DNA析取的相似的初始步骤能够适用于分析结肠直肠癌的分子标志。与当前 利用的从大便样本析取DNA的技术相比，通过接触印刷过程采样的细胞可以提供质量好得 多的DNA。能够在不精确定量其量的情况下进行对此DNA的PCR增强。在结肠直肠癌筛选 中，多目标分子分析被认为是一种选择，然而与直接定量分析相比，其更耗时间并且更加昂 贵。同时在对数量上“阳性”或“不确定”的情况的更进一步的诊断分析中，析取的用于直 接定量的DNA无疑能够用于PCR增强。
iii)在需要从其它类型的细胞中特定地离析结肠细胞的情况中，能够应用分离方 法(例如，免疫的磁性的或密度梯度分离)来获得用于分析的更高纯度的结肠细胞群体。为 此，能够施加一些包含抗生素(一些细菌存在于采集的材料内不可能避免)和粘液溶解试 剂的细胞保存介质。离析的结肠细胞能够随后用于不同类型的分析，诸如DNA析取和定量、 DNA析取继之以PCR增强、癌分子的和生物化学的标志分析、细胞学的/细胞化学的评估、和 直接细胞计数(由于低速度和高成本，在筛选方面有问题)。(b)结肠直肠癌诊断测试的诊断的用途集中在呈现一些特定症状或已经确定为遭受某种病症的个体。 病人的目标群体远小于对于筛选目的预期的目标群体。i)直接DNA定量能够应用于呈现指示可能的结肠直肠病症的症状的个体。ii)DNA析取继之以PCR增强和分子分析能够用于初始诊断的确认和高级的诊断 过程(对于癌侵略性的评估、用于转移性的瘤的化学疗法的敏感性和预测等等)。iii)细胞离析能够用于更进一步的分子的/生物化学的分析和细胞学试验(具有 特定的形态学特征的瘤细胞)在CRC病人体内的脱落的结肠细胞中能够被容易地发现。
权利要求
一种结肠直肠细胞采样设备，其包括具有远侧的插入端部、近侧的端部和内部腔的结肠直肠插入构件；具有外部细胞采样表面和内部表面的柔性的隔膜，其中，所述隔膜密封地接附到所述插入构件的远侧的插入端部，并且被保持在内部腔内，以形成向所述插入构件的插入端部开放的袋；以及用于密封所述插入端部以形成关闭腔的装置，所述关闭腔由所述袋和所述密封装置限定。
2.根据权利要求1所述的设备，其中，柔性的隔膜为弹性的并且由基于腈、乳胶或橡胶 的物质构成。
3.根据权利要求1所述的设备，其中，所述插入构件的内部腔被关闭。
4.根据权利要求1所述的设备，其还包括用于对内部腔施压和降压的装置，其中，所述 装置构造成对所述内部腔施压到至少第一提升压力，使得所述隔膜从所述插入构件的插入 端部发出；且对所述内部腔降压至第二减小压力，以使得所述降压的程度大于所述施压的 程度，从而致使所述隔膜反向并且返回所述插入构件的内部腔中。
5.根据权利要求4所述的设备，其中，所述用于对内部腔施压的装置接附到位于所述 插入构件的近侧的端部处的阀上。
6.根据权利要求4所述的设备，其中，所述用于对内部腔施压的装置包括压缩空气源 或注射器。
7.根据权利要求1所述的设备，其中，所述插入构件适合与直肠进入管接合。
8.根据权利要求1所述的设备，其中，流体可添加到由所述柔性的隔膜形成的所述袋中。
9.根据权利要求1所述的设备，其中，所述插入构件的内部腔提供有附着装置。
10.根据权利要求1所述的设备，其中，所述密封装置包括带有螺纹的帽，其与所述插 入构件的插入端部上限定的螺纹相啮合。
11.根据权利要求4所述的设备，其中，所述用于对内部腔施压的装置可从所述插入构 件中脱离。
12.一种用于从人类对象的结肠直肠黏膜表面采集样本的套件，其包括根据权利要求 1所述的结肠直肠细胞采样设备和用于对所述细胞采样设备的内部腔施压和降压的装置， 所述装置构造成对所述内部腔施压到至少第一提升压力，使得所述隔膜从所述插入构件的 插入端部发出；且对所述内部腔降压至第二减小压力，以使得所述降压的程度大于所述施 压的程度，从而致使所述隔膜反向并且返回所述插入构件的内部腔中。
13.根据权利要求12所述的套件，其中，所述密封装置包括带有螺纹的帽，其与所述插 入构件的插入端部上限定的螺纹相啮合。
14.根据权利要求12所述的套件，其还包括试剂。
15.根据权利要求12所述的套件，其还包括试剂，所述试剂存在于所述带有螺纹的帽内。
16.根据权利要求12所述的套件，其还包括直肠进入管。
17.根据权利要求16所述的套件，其还包括密闭器。
全文摘要
本发明提供了一种结肠直肠细胞采样设备，其包括具有远侧的插入端部、近侧的端部和内部腔的结肠直肠插入构件具有外部细胞采样表面和内部表面的柔性的隔膜，其中，所述隔膜密封地接附到所述插入构件的远侧的插入端部，并且被保持在内部腔内，以形成向所述插入构件的插入端部开放的袋；以及用于密封所述插入端部以形成关闭腔的装置，所述关闭腔由所述袋和所述密封装置限定。本发明还提供了一种用于从人类对象的结肠直肠黏膜表面采集样本的套件。
文档编号A61B17/00GK101869491SQ20101023100
公开日2010年10月27日 申请日期2005年7月6日 优先权日2004年7月7日
发明者A·H·勒维林, A·洛克蒂奥诺夫, C·G·费雷特, H·G·G·利伍德, R·C·G·利伍德, T·班达尔托瓦 申请人:科隆尼克斯有限公司