专利名称：一种魔芋细胞液体培养葡甘聚糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种葡甘聚糖的制备方法，具体涉及一种采用魔芋细胞液体培养葡甘 聚糖的方法。
背景技术：
魔芋学名为Amorphophallus konjac，属单子叶植物纲，天南星科耐荫性多年生草 本植物的块茎，是我国的一大特产，广泛分布于长江流域。云南、四川产量最大，鄂西、湘西、 福建亦有生产。魔芋球茎中含有葡甘聚糖(Konjac Glucomarman，简称KGM)、淀粉、纤维、蛋 白质和灰分等营养成分，其中主要有效成分是葡甘聚糖，是由D-葡萄糖和D-甘露糖通过 3 _1，4糖苷键合的高分子多糖。它具有多种独特理化性质，如膨胀性、流变性、增稠性、胶凝 性和成膜性等。近年来，国内外研究证实，KGM是一种优良的低热量、低脂肪、高纤维素的水 溶性膳食纤维，对营养不平衡有重要调节作用。诸多学者研究表明，KGM具有降血糖、血脂 及逆转脂肪肝，通便减肥、抗癌、增强免疫功能、抗衰老等奇特的保健作用和医疗功效，在食 品、医药、化工、纺织、石油钻探等工业均有很好的应用价值。魔芋由于其来源受环境和季节 影响较大，不利于葡甘聚糖的规模化生产，关于魔芋细胞液体培养产葡甘聚糖技术尚未见 报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种材料均一、重复性好的魔芋细胞液体培养葡 甘聚糖的方法。本发明的目的是这样实现的一种魔芋细胞液体培养葡甘聚糖的方法，包括以下 步骤(1)愈伤组织的诱导用水将花魔芋块茎表面清洗干净，经过酒精浸泡、汞浸泡，最后 用灭菌水洗涤，削去表皮并切成小块，将消毒好的魔芋块茎切块移入愈伤诱导养基中，控制 愈伤诱导养基的PH为6. 0，置于暗培养室中培养后将膨大的组织再次切成小块，移入新配 置的愈伤诱导培养基进一步进行培养；(2)细胞液体培养将经过愈伤诱导培养基培养的 生长旺盛的愈伤组织切碎，接种在盛有液体培养基的容器中培养，得到培养液；(3)葡甘聚 糖制取将培养液离心处理，上清液在搅拌状态下加入乙醇，使培养液使含醇量50 %，放置 24h后，再次离心处理，得到得沉淀物，用50 %乙醇处理数次，沉淀物冷冻干燥得白色物质， 即葡甘露聚糖。步骤(1)中的愈伤诱导培养基是在1升MS培养液中加入1. Omg NAA、1. Omg 6_BA 和25g乳糖混合而成。步骤⑵中的液体培养基是在1升MS培养液中加入1. Omg 2，4-D，0. lmgKT和30g 乳糖混合而成，控制PH值为6. 0。步骤(1)置于暗培养室中培养是指在26°C的温度下培养，培养时间2个月。接种在盛有液体培养基的容器中培养条件是在光照、温度为25士 rC、110r/min 的摇床条件下振荡培养。
本发明提供的魔芋细胞液体培养葡甘聚糖的方法，提出了一种新的以魔芋细胞液 体为主要原料提取葡甘聚糖的方法，解决了魔芋由于其来源受环境和季节影响较大，不利 于葡甘聚糖进行规模化生产的问题，可实现从魔芋制取葡甘聚糖的工业化生产。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明图1悬浮液体培养基对魔芋葡甘 露聚糖含量的影响；图2不同接种量对魔芋葡甘露聚糖产生的影响；图3pH对魔芋葡甘露 聚糖含量的影响；图4不同碳源对魔芋葡甘露聚糖含量的影响；图5不同浓度乳糖对魔芋 葡甘露聚糖含量的影响。
具体实施例方式一、制备实施例(1)愈伤组织的诱导用水将花魔芋块茎表面清洗干净，再用 75%酒精浸泡lmin，0. 升汞浸泡lOmin，最后用灭菌水洗涤4次，削去表皮并切成小块， 将消毒好的魔芋块茎切块移入愈伤诱导养基中，控制愈伤诱导养基的PH为6. 0，置于暗培 养室中在26°C的温度下培养2个月后将膨大的组织再次切成小块，移入新配置的愈伤组织 诱导培养基进一步进行培养；上述愈伤诱导养基是在1升MS培养液中加入1. Omg NAA (萘 乙酸)、l.Omg 6-BA (6-苄氨基嘌呤，是一种细胞分裂素)和30g蔗糖混合而成；(2)细胞液 体培养将经过愈伤诱导培养基培养的生长旺盛的愈伤组织切碎，接种在盛有液体培养基 的容器中，在光照、温度为25 士 l°C、110r/min的摇床条件下振荡培养，得到培养液；液体培 养基是在1升MS培养液中加入1. Omg 2，4-D，0. ImgKT (6-糠基腺嘌呤，细胞分裂素)和30g 蔗糖混合而成，控制PH值为6. O。(3)葡甘聚糖制取将培养液4000r/min离心5min，上清液在搅拌状态下加95% 乙醇使含醇量50%，放置24h后，4000r/min离心5min，得沉淀物，反复用50%乙醇处理数 次，冷冻干燥得白色物质，即葡甘露聚糖。二、相关指标测定1、葡甘聚糖含量测定1-1绘制标准工作曲线依次移取浓度为 lmg/mL的葡萄糖标准溶液0. 40，0. 80，1. 20，1. 60，2. OmL于5个IOmL容量瓶中，加蒸馏水补 至2mL，然后分别加入1. 5mL3，5- 二硝基水杨酸试剂，在沸水浴上加热5min后，用蒸馏水定 容至10mL，于550nm处测定其吸光度(A)。2-2培养物中葡甘露聚糖的测定取培养液4ml，4000r/min离心5min，上清液在搅 拌状态下加95%乙醇使含醇量50%，放置24h后，4000r/min离心5min，得沉淀物，反复用 50%乙醇处理数次，冷冻干燥得白色物质，即葡甘露聚糖，测定含量。KGM含量测定将冷冻干燥得白色物质加0. 5mLddH20溶解，加0. 5mL3mo VLH2SO4 在沸水浴上水解2h，冷却加入lmL3mol/LNaOH，并加水定容至10mL，取该水解液2. OmL, 按标准葡萄糖工作曲线步骤测定KGM吸光度值A(OD55tl)15将吸光度值A代入回归方程A =-0. 019+0. 0392 -T, r = 0. 99958，计算出各吸光度值对应的葡萄糖毫克数T。KGM含量用 下式计算KGM含量=ε ？？ T 稀释倍数式中ε = 0. 9，为葡萄糖和甘露糖在葡甘露聚 糖中的残基相对分子质量与葡甘露聚糖水解后得到的葡萄糖和甘露糖相对分子质量之比T 为葡甘露聚糖水解液比色测定值，查标准曲线所得毫克数。2、不同培养基对葡甘聚糖积累的影响在添加2，4-D1.0mg/L+KT0. lmg/L+蔗糖30g/L的MS、N6、B5培养液中，以4g/100mL的接种量接入魔芋愈伤组织，在光照、温度为 25士 1°C、转速llOr/min条件下振荡培养，由图1可知，MS培养基利于葡甘露聚糖的合成， 所以选用MS培养基作为获得高产量次生代谢物葡甘露聚糖基本悬浮培养基。3、不同接种量对葡甘聚糖积累的影响在培养液MS+2，4-Dl. Omg/L+KTO. lmg/L+蔗 糖30g/L中，分别加入2、4、6g/100mL的新鲜魔芋愈伤组织，在光照、温度为(25士 1) °C、转 速llOr/min条件下振荡培养，每隔3d取一次样测定葡甘聚糖含量变化曲线，如图2所示， 当接种量为4. 0g/100mL时，第15d时葡甘露聚糖达到最大含量。4、培养基初始pH对葡甘露聚糖含量的影响调节培养基MS+2，4-D1.0mg/ L+KTO. lmg/L+蔗糖30g/L初始pH值，设置初始pH值为5. 6,5.8,6.0,6. 24个梯度，愈伤组织 接种量为4g/100mL，在光照、温度为25 士 1°C、转速llOr/min条件下振荡培养，15d后测定葡 甘聚糖含量，如图3所示，第15d，pH值为6. 0时，葡甘露聚糖含量最高达到54. 82mg/100mL。5、不同碳源对葡甘聚糖积累的影响在培养基MS+2，4-Dl. Omg/L+KTO. lmg/L中加 入不同碳源，分别为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖，不同碳源的浓度为30g/L，愈伤组织接种 量为4g/100mL，在光照、温度为(25士 1)°C、转速llOr/min条件下振荡培养，15d后测定葡 甘聚糖含量，由图4可知，乳糖是葡甘露聚糖积累的最适碳源，其葡甘露聚糖积累量可达 86. lmg/100mL。6、乳糖对葡甘聚糖积累的影响在培养基MS+2，4-D1. Omg/L KTO. lmg/L中加 入20、25、30、35g/L5种不同浓度的乳糖，愈伤组织接种量为4g/100mL，在光照、温度为 (25士 1) °C、转速llOr/min条件下振荡培养，15d后测定葡甘聚糖含量，由图5可知，乳糖浓 度为25g/L时，第15d葡甘聚糖积累量最大，达到103. 89mg/100mL。7、植物生长调节剂浓度对葡甘聚糖积累的影响分别调节液体培养基细胞分裂素 和生长素的浓度，细胞分裂素(KT和6-BA)设置浓度为0. 5，1. 0，1. 5,2. Omg/L ；生长素(2， 4-D和NAA)浓度为0. 5，1. 0,2. 0,4. Omg/L ；继代量均为4g/100mL。每处理3个重复。培 养条件为光照、温度为(25士 1)°C、转速llOr/min条件下振荡培养，15d后测定葡甘聚糖 含量，由表1可知，2，4-D在1. Omg/L时对葡甘露聚糖积累效果明显，葡甘露聚糖含量达到 76. 34mg/100mL ；细胞分裂素6-BA使葡甘露聚糖积累明显高于KT，且6-BA在1. 5mg/L时 葡甘露聚糖积累量最高，达到90. 69mg/100mL，故我们选择1. Omg/L的2，4_D和1. 5mg/L的 6-BA作为液体培养产葡甘露聚糖的最适外源激素浓度。表1不同外源激素对魔芋葡甘聚糖含量的影响
权利要求
一种魔芋细胞液体培养葡甘聚糖的方法，其特征在于包括以下步骤(1)愈伤组织的诱导用水将花魔芋块茎表面清洗干净，经过酒精浸泡、汞浸泡，最后用灭菌水洗涤，削去表皮并切成小块，将消毒好的魔芋块茎切块移入愈伤诱导养基中，控制愈伤诱导养基的pH为6.0，置于暗培养室中培养后将膨大的组织再次切成小块，移入新配置的愈伤诱导培养基进一步进行培养；(2)细胞液体培养将经过愈伤诱导培养基培养的生长旺盛的愈伤组织切碎，接种在盛有液体培养基的容器中培养，得到培养液；(3)葡甘聚糖制取将培养液离心处理，上清液在搅拌状态下加入乙醇，使培养液使含醇量50％，放置24h后，再次离心处理，得到得沉淀物，用50％乙醇处理数次，沉淀物冷冻干燥得白色物质，即葡甘露聚糖。
2.根据权利要求1所述的魔芋细胞液体培养葡甘聚糖的方法，其特征在于步骤(1) 中的愈伤诱导培养基是在1升MS培养液中加入1. Omg NAA、1. Omg 6-BA和25g乳糖混合而 成。
3.根据权利要求1所述的魔芋细胞液体培养葡甘聚糖的方法，其特征在于步骤(2) 中的液体培养基是在1升MS培养液中加入1. Omg 2，4-D，0. ImgKT和25g乳糖混合而成，控 制PH值为6.0。
4.根据权利要求1所述的魔芋细胞液体培养葡甘聚糖的方法，其特征在于步骤(1) 置于暗培养室中培养是指在26°C的温度下培养，培养时间2个月。
5.根据权利要求1所述的魔芋细胞液体培养葡甘聚糖的方法，其特征在于接种在盛 有液体培养基的容器中培养条件是在光照、温度为25士 rC、110r/min的摇床条件下振荡培养。
全文摘要
本发明提供了一种用液体培养法产葡甘聚糖的方法，对影响魔芋细胞液体培养产次生代谢物葡甘聚糖产生的几种主要因子进行了研究，结果表明，在魔芋细胞液体培养生产葡甘聚糖的过程中，MS培养基为最适培养基，第15天左右葡甘聚糖的含量达到最大值，pH为6.0时利于葡甘聚糖的合成，25g/L的乳糖为最适碳源，2，4-D在1.0mg/L时葡甘聚糖的积累效果明显，其它浓度的2，4-D和NAA对葡甘聚糖积累效果不明显，细胞分裂素6-BA使葡甘聚糖积累明显高于KT，且1.5mg/L时葡甘聚糖积累量最高。最后得到MS+2，4-D(1.0mg/L)+6-BA(1.5mg/L)+乳糖(25mg/L)为魔芋细胞培养生产葡甘聚糖的较优培养基，其最高葡甘聚糖积累量可达125.70mg/100mL。
文档编号A61P3/04GK101885784SQ201010231540
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者乐超银, 梁宏伟, 梁薇, 王健, 王玉兵, 郭政宏, 陈发菊 申请人:三峡大学