专利名称：一种注射用重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种注射用重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的制备方法，具体涉 及一种以可生物降解壳聚糖为基质的制备方法。采用该方法制备的纳米粒子粒径范围可 控，载药量高，且纳米粒安全无毒，易操作。
背景技术：
注射用重组人血管内皮抑制素(恩度，Endostar)由山东先声麦得津生物制药有 限公司(先声药业控股子公司)开发，2005年获得国家食品药品监督管理局颁发的新药证 书，2006年获得生产批件，是目前全球第一个获得国家食品药品监管机构批准上市的重组 人血管内皮抑制素。重组人血管内皮抑制素通过修饰人血管内皮抑制素的核苷酸编码序列，生产出N 末端带有9个附加氨基酸序列的重组人血管内皮抑制素(ZL 00107569. 1)，其氨基酸序列 为(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLY SIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYC ETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK，其中当由大肠杆菌表达时其 N 末 端的Met有时会被部分删除。重组人血管内皮抑制素抗肿瘤机制基于美国哈佛医学院的Folkman教授提出的 “饿死肿瘤疗法”理论。研究发现一些内源性血管生成抑制因子如AngiostatiruEndostatin 能够阻碍血管在肿瘤组织中的生长，使肿瘤的生长和转移处于停滞(0’ Relly, M. S.，et al. Cell. 79 :315_328，1994 ；0，Relly, M. S.，et al. Cell. 88 :277_285，1997)。但由于 Endostatin在表达制备过程中存在着易于沉淀和复性困难等问题，限制了其在肿瘤患者中 的大规模应用。重组的人血管内皮抑制素Endostar保持了内源性Endostatin的所有生物 活性，同时解决了 Endostatin在生产过程中的难题，表达水平更高，疗效更强，并且没有因 为附加N端序列而导致体内免疫原性。但是作为外源性蛋白，重组的人血管内皮抑制素在 体内很容易被免疫系统识别，进而被降解，因此体内半衰期很短，临床使用中患者需每天注 射一次，连续14天为一个疗程，休息一周后，再继续下一疗程。由于频繁的注射给药，临床 顺应性很差。近期有研究发现动物体内小剂量持续给予Endostatin的药效要优于间歇性 给药(Minoru Kuroiwa, et al. J. Pediatr. Surg. 38 1499-1505, 2003 ；Oliver Kisker, et al. Cancer Res. 61 :7669_7674，2001)。因此，将其开发成注射一次可以持续释药的长效制 剂非常必要。缓控释靶向给药系统主要包括脂质体、微球、纳米粒等。其中可生物降解的聚合物 纳米粒，因其具有良好的生物相容性、超细粒径、合理的体内分布和高效的药物利用率而受 到广泛关注。目前所应用的药物缓释材料是一些合成的(如PEG，PVA)或天然的(如褐藻 酸钠、胶原壳聚糖等)生物可降解材料。而其中的壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可
3降解性，其带正电性使其在液态介质中可与带负电荷的聚合物、大分子甚至一些聚阴离子 相互作用，由此发生的溶胶_凝胶转变过程则可方便地用于载药纳米微粒的制备。壳聚糖 纳米粒已被认为是一类极具应用前景的药物控释载体，特别适用于具有生物活性大分子药 物的包埋。
发明内容
本发明的目的是提供一种注射用重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的制备方 法，该方法可以避免使用有机溶剂，同时获得粒径较小、分布均勻、载药量高的纳米粒。本发明所述纳米粒体系是利用壳聚糖与三聚磷酸钠发生离子交联反应而制备，该 体系可以均勻控制产物的粒径，同时获得较高的载药量。本发明的注射用重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的制备包括下列步骤(1)将壳聚糖加入醋酸溶液中，搅拌至完全溶解；(2)将含有重组人血管内皮抑制素的缓冲液加入步骤(1)配制的壳聚糖醋酸溶液 中，不断搅拌的条件下加入三聚磷酸钠，使成乳液；(3)将上述所得乳液超声分散，离心，滤除上清液，得到浓缩液或沉淀；(4)将上述浓缩液或沉淀重新分散于水中，加入冻干保护剂，冷冻干燥，即得重组 人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒。本发明中所述壳聚糖分子量范围在10000 500000道尔顿，优选为50000 200000道尔顿。本发明中醋酸溶液浓度为0. 5 2mg/mL，优选为lmg/mL，壳聚糖醋酸溶液中壳聚 糖浓度为0. 5 10mg/mL，三聚磷酸钠水溶液浓度为0. 1 10mg/mL。本发明中重组人血管内皮抑制素溶解在缓冲液中，其中缓冲液可以是醋酸盐缓冲 液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸 盐酸缓冲液中的一种，优选醋酸盐缓冲液。由于 重组人血管内皮抑制素只在一定PH值下稳定，缓冲液的pH值在2 9之间，优选4 7之 间。本发明中纳米粒的形成与壳聚糖及三聚磷酸钠的加入比例有关，壳聚糖与三聚磷 酸钠的质量比为1 1 10 1。本发明中三聚磷酸钠为离子交联剂，在搅拌过程中壳聚糖与三聚磷酸钠发生交联 而形成纳米粒，搅拌可以采用磁力搅拌、螺旋桨搅拌，搅拌转速在100 600转/分，搅拌时 间在1 120分钟。本发明中为了控制纳米粒的粒径，可以采用50W 200W功率的超声，超声时间在 O IOmin0本发明中为了分离游离药物与纳米粒，可以采用超滤离心方式，即使用截留分子 量为30000 100000道尔顿的超滤膜，离心转数控制在3000 5000转/分，离心时间在 5 30分钟，或采用冷冻离心方式，即温度控制在O 10摄氏度，离心转数控制在6000 16000转/分，离心时间在10 60分钟。本发明中获得纳米粒沉淀后需进行必要的干燥处理，干燥步骤采用冷冻干燥，采 用的冻干保护剂包括甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、蔗糖中的一种或几种，优选海藻糖，冻 干保护剂与重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的质量比为0.1 1 10 1。
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本发明中重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒中重组人血管内皮抑制素重量百 分数即载药量在wt 50% wt，纳米粒平均粒径在IOOnm 600nm之间。本发明中所述的重组人血管内皮抑制素为重组人血管内皮抑制素Endostar。本发明的优点有1、壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性，无毒，来源经济；2、制备方法中不使用有机溶剂，可以避免影响蛋白活性，同时方法操作简单；3、纳米粒粒径范围可控，形态为球形，分布均勻，载药量高。4、纳米粒可以达到持续释药的目的。
图1实施例一中纳米粒形态图。图2实施例二中纳米粒粒径分布图。图3实施例三中纳米粒粒径分布图。图4实施例四中纳米粒累积释放曲线图。图5重组人血管内皮抑制素制成纳米粒前后对HUVEC细胞增殖活性。
具体实施例方式本发明通过以下实施例作更详细的描述，但不能将其解释为限制本发明的保护范围。实施例一称取分子量为100000道尔顿的壳聚糖500mg，溶于50mL 的醋酸溶液中，得 到lOmg/mL的壳聚糖溶液。以蒸馏水配制5mg/mL的多聚磷酸钠溶液20mL。取含200mg Endostar醋酸盐缓冲液(pH5. 5)加入壳聚糖溶液中，磁力搅拌下缓慢滴加多聚磷酸钠溶 液，反应30分钟，即得重组人血管内皮抑制素纳米粒。将上述纳米粒溶液在4摄氏度，10000 转/分条件下离心30分钟，分离纳米粒。将所得纳米粒重新分散于50mL水中，加入Ig海 藻糖，冷冻干燥，得到粒径分布均勻的重组人血管内皮抑制素纳米粒。将离心分离后的上清溶液适当稀释，采用BCA方法(试剂盒来自于 ThermoScientific，名为BCA Protein Assay Kit)测定其中的蛋白浓度即游离蛋白浓度， 计算纳米粒中重组人血管内皮抑制素重量百分数即载药量。其中载药量=(加入蛋白重 量-游离蛋白重量载药纳米粒总重。将冻干后的纳米粒用蒸馏水复溶，用透射电镜观 察纳米粒形态。所得纳米粒载药量为16.3%，形态为球形，纳米粒形态见图1。实施例二称取分子量为100000道尔顿的壳聚糖500mg，溶于50mL 的醋酸溶液中，得 到lOmg/mL的壳聚糖溶液。以蒸馏水配制5mg/mL的多聚磷酸钠溶液20mL。取含200mg Endostar醋酸盐缓冲液(pH5. 5)加入壳聚糖溶液中，磁力搅拌下缓慢滴加多聚磷酸钠溶 液，反应5分钟，IOOff功率下探头超声2分钟，即得重组人血管内皮抑制素纳米粒。将上述 纳米粒溶液在4摄氏度，10000转/分条件下离心30分钟，分离纳米粒。将所得纳米粒重新 分散于50mL水中，加入Ig海藻糖，冷冻干燥，得到粒径分布均勻的重组人血管内皮抑制素 纳米粒。
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载药量测定同实施例一。将冻干后的纳米粒用蒸馏水复溶，用nanO-ZS90马尔文 粒径仪测定纳米粒粒径。所得纳米粒载药量为20. 8%，平均粒径为241nm，粒径分布见图2。实施例三称取分子量为100000道尔顿的壳聚糖250mg，溶于50mL 的醋酸溶液中，得到 5mg/mL的壳聚糖溶液。以蒸馏水配制5mg/mL的多聚磷酸钠溶液15mL。取含200mgEndostar 磷酸盐缓冲液(PH5. 0)加入壳聚糖溶液中，螺旋桨搅拌下(300转/分)缓慢滴加多聚磷酸 钠溶液，反应10分钟，IOOff功率下探头超声2分钟，即得重组人血管内皮抑制素纳米粒。将 上述纳米粒溶液用截留分子量为50000道尔顿的超滤膜，4000转/分条件下离心10分钟， 分离纳米粒。将所得纳米粒浓缩液分散于30mL水中，加入1. 5g海藻糖，冷冻干燥，得到粒 径分布均勻的重组人血管内皮抑制素纳米粒。将离心分离后的超滤液适当稀释，采用BCA方法(试剂盒来自于Thermo Scientific，名为BCA Protein Assay Kit)测定其中的蛋白浓度即游离蛋白浓度，计算纳 米粒中重组人血管内皮抑制素重量百分数即载药量。其中载药量=(加入蛋白重量-游离 蛋白重量载药纳米粒总重。将冻干后的纳米粒用蒸馏水复溶，用nanO-ZS90马尔文粒 径仪测定纳米粒粒径。所得纳米粒载药量为34. 7%，平均粒径为178nm，粒径分布见图3。实施例四称取分子量为50000道尔顿的壳聚糖250mg，溶于50mL 的醋酸溶液中，得到 5mg/mL的壳聚糖溶液。以蒸馏水配制5mg/mL的多聚磷酸钠溶液15mL。取含200mgEndostar 醋酸盐缓冲液(PH5. 5)加入壳聚糖溶液中，磁力搅拌下缓慢滴加多聚磷酸钠溶液，反应5分 钟，100W功率下探头超声2分钟，即得重组人血管内皮抑制素纳米粒。将上述纳米粒溶液在 4摄氏度，10000转/分条件下离心30分钟，分离纳米粒。将所得纳米粒重新分散于50mL 水中，加入1. 5g蔗糖，冷冻干燥，得到粒径分布均勻的重组人血管内皮抑制素纳米粒。载药量测定同实施例一。将冻干后的纳米粒用蒸馏水复溶，用nanO-ZS90马尔文 粒径仪测定纳米粒粒径。所得纳米粒载药量为32. 1%，平均粒径为143nm。取冻干后的纳米粒50mg加入5mL磷酸盐缓冲液(pH7. 4)，37度，100转下振荡 释放10天，分别于ld、2d、4d、6d、8d、10d取样，采用BCA方法(试剂盒来自于Thermo Scientific，名为BCA Protein Assay Kit)测定其中的蛋白浓度即释放的蛋白浓度，计算 累积释放率。IOd累积释放达90%，累积释放曲线见图4。实施例五称取分子量为200000道尔顿的壳聚糖lOOmg，溶于50mL 的醋酸溶液中，得到 2mg/mL的壳聚糖溶液。以蒸馏水配制2mg/mL的多聚磷酸钠溶液10mL。取含lOOmgEndostar 醋酸盐缓冲液(PH5. 5)加入壳聚糖溶液中，螺旋桨搅拌下(300转/分)缓慢滴加多聚磷酸 钠溶液，反应30分钟，IOOff功率下超声5分钟，即得重组人血管内皮抑制素纳米粒。将上述 纳米粒溶液用截留分子量为50000道尔顿的超滤膜，4000转/分条件下离心10分钟，分离 纳米粒。将所得纳米粒浓缩液分散于20mL水中，加入Ig蔗糖，冷冻干燥，得到粒径分布均 勻的重组人血管内皮抑制素纳米粒。载药量及粒径测定同实施例三。所得纳米粒载药量为41.7%，平均粒径为349nm。取复溶后的纳米粒进行Endostar的生物活性测定1、HUVEC 细胞用添加 FBS、ECGS、P/0 Solution 的 ECM 培养基于 37°C，5% CO2 的培
6养箱中培养，待细胞状态良好并进入对数生长期后进行接种。2、细胞用0. 25%胰酶消化，IOOOrpm离心5min，弃上清，用培养基重新混悬，显微 镜下用血细胞计数板计数活细胞。调细胞密度为5000个/mL，每孔加入160 μ L细胞悬液， 置37°C 5% CO2培养箱中培养。3、将Endostar原液和复溶后的纳米粒用pH7. 4的磷酸盐缓冲液预稀释至2. 5mg/ mL，按孔中终浓度为500、250、125、62· 5,31. 25、15. 625 μ g/mL，每孔加入40 μ 1药物体积， 每个梯度设3个平行，37°C 5% CO2培养箱中培养96h。4、加入5mg/mL MTT工作液，每孔20 μ L，置37°C 5% CO2培养箱中培养4h，弃去细 胞上清，每孔加入DMSO 200 μ L0放置lOmin，使用酶标仪490nm波长下测定OD值。5、根据OD值求出细胞抑制率，计算公式为抑制率(IR)=(对照组OD值均数-实 验组OD值均数)/(对照组OD值均数-空白OD值均数)。(图5)从图中可以看出，纳米粒中的Endostar与原液对细胞增殖的抑制程度相当。
权利要求
一种注射用重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于(1)将壳聚糖加入醋酸溶液中，搅拌至完全溶解；(2)将含有重组人血管内皮抑制素的缓冲液加入步骤(1)配制的壳聚糖醋酸溶液中，不断搅拌的条件下加入三聚磷酸钠，使成乳液；(3)将上述所得乳液超声分散，离心，滤除上清液，得到浓缩液或沉淀；(4)将上述浓缩液或沉淀重新分散于水中，加入冻干保护剂，冷冻干燥，即得重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述壳聚糖分子量范围在10000 500000道尔顿，壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖浓度为0. 5 10mg/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的醋酸溶液浓度为0.5 2mg/mLo
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述三聚磷酸钠可以直接加 入也可以配制成水溶液加入，配制的三聚磷酸钠水溶液浓度为0. 1 10mg/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的缓冲液可以是醋酸 盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸 盐酸缓冲液中的一种；其中缓冲液pH值在 2 9之间。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中壳聚糖与三聚磷酸钠的重 量比为1 1 10 1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中超声时间在0 lOmin，离 心可采用超滤离心或冷冻离心；冷冻离心的离心转数6000 16000转/分钟，离心时间在 10 60分钟，温度控制为0 10摄氏度；超滤离心采用截留分子量为30000 100000道 尔顿的超滤膜，离心转数在3000 5000转/分钟，离心时间在5 30分钟。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述冻干保护剂包括甘露 醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖、蔗糖中的一种或几种；冻干保护剂与重组人血管内皮抑制素壳聚 糖纳米粒的质量比为0.1 1 10 1。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的重组人血管内皮抑制素壳聚 糖纳米粒中重组人血管内皮抑制素重量百分数占wt 50% wt,纳米粒平均粒径在 IOOnm 600nm 之间。
10.根据权利要求1 9中任一项所述的方法，其特征在于所述的重组人血管内皮抑制 素为重组人血管内皮抑制素Endostar。
全文摘要
本发明涉及一种注射用重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒的制备方法，具体涉及一种以可生物降解壳聚糖为载体，选择三聚磷酸钠为离子交联剂，在不断搅拌条件下，含有重组人血管内皮抑制素的壳聚糖溶液与三聚磷酸钠溶液发生离子交联反应制备重组人血管内皮抑制素壳聚糖纳米粒。
文档编号A61P35/00GK101953796SQ20101023133
公开日2011年1月26日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者刘春晖, 李玲, 王青松, 许向阳 申请人:江苏先声药物研究有限公司