专利名称：重组人白介素15在治疗恶性腹水瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组人白介素15(rhIL_15)在制备具有缓解和治疗恶性腹水瘤药物 中的应用，属于生物制药领域。
背景技术：
恶性腹水是晚期癌症患者常见的并发症，不仅影响患者的生活质量，也不利于进 一步治疗，病人病情重、进展快、生存期短，其中消化道恶性腹水平均生存期仅为2-12个 月，常见的治疗方法包括全身或腔内局部化疗，使用硬化剂，穿刺抽液或置导管引流以及 胸、腹腔分流等，这些方法虽然有一定的疗效，但有的易复发，有的副反应严重，不易为患者 接受，近年来，临床上积极开展拥古生物效应调节剂治疗恶性胸、腹水，文献报道逐年增多， 如孙燕(孙燕，张弘刚，彭民.重组人白细胞介素_2治疗实体瘤及胸腹水III期临床研 究.中国新药杂志，1998，7 (3) 171-174)等报道重组人白介素2的III期临床试验，共治 疗90例恶性腹水患者，总有效率可达76. 7% ；杨晓红(杨晓红.重组人白介素_2治疗52 例恶性腹水的观察.重庆医学，2003，32(1) 96用重组人白介素2治疗52例恶性腹水时， 观察发现，腹腔内注射重组人白介素-2，治疗后，腹水及腹水中弘细胞均明显减少，部分病 人癌细胞转阴，但部分病人有较为严重的副反应。白细胞介素15(IL_15)是Grabstein等人于1994年发现的一种约为12_14kD的 细胞因子，与大多数细胞因子相似，IL-15可在机体正常的免疫应答中发挥作用，如促进T 细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞的发育等，IL-15还可对免疫系统外的多种组织和细胞 发挥广泛而多效的作用。体外研究显示IL-15与IL-2由于共有的受体组分共有几种生物 学活性，在T细胞上存在的IL-15受体包括一种特有的α链，IL-15Ra，但是与IL-2R共 有β链和Y链，结果，两种受体都利用相同的Jak/STAT信号传递元件，不过，基于IL-2 和IL-15及其受体的复杂调控和不同表达，已经报道了体内功能的显著差异(Kirman等， 1998 ；Waldmann and Tagaya, 1999 ；Waldmann 等，2001)。IL-15 和 IL-2 的抗肿瘤效应应受 到重视，比较IL-15与IL-2对肺腺癌转移模型的疗效时，它诱导的NK杀伤活性比IL-2诱 导的高3-4倍，此外，6倍剂量的IL-15才能引起肺血管渗漏等毒副作用的出现，在大鼠的结 肠癌模型中也发现，IL-15能显著降低化疗英气的胃肠道毒性，增强药物的最大耐受剂量。 朱法良等(朱法良，孙讷，田志刚，等· rhIL-15和rhIL-2诱生的LAK细胞特性比较·中国 免疫学杂志[J]. 2002，18 (4) 252-258)在研究重组人白细胞介素15和重组人白介素2诱 导的粘附性自然杀伤细胞(LAK)时发现，rhIL-15诱生的LAK细胞杀伤K562细胞的能力强 于rhIL-2诱生的LAK细胞，同时，rhIL-15诱生的LAK细胞的⑶3XD56+细胞、⑶94+细胞百 分率均要高于rhIL-2诱生的LAK细胞，证明rhIL-15在体内对NK细胞功能可能具有较强 的调节作用。
发明内容
本发明研究人员发现，rhIL-15在治疗恶性腹水瘤方面，如艾氏腹水瘤、卵巢癌腹水、恶性肝癌腹水瘤等，具有一定的治疗和缓解作用，可明显延长腹水小鼠的生存期。本发明的目的在于提供重组人白细胞介素15在制备具有治疗和缓解恶性腹水瘤 药物中的应用。本发明的再一目的在于提供一种含有重组人白细胞介素15的药物组合物在制备 具有治疗和缓解恶性腹水瘤药物中的应用。本发明中，含有重组人白细胞介素15的药物组合物，是指，除含有重组人白细胞 介素15外，还包括一些其它药物，如白细胞介素2、IFN-a、抗血管内皮生长因子(VEGF)、索 拉非尼、5-FU、吉西他滨、紫杉烷、钼类(如顺钼、奥沙利钼、卡钼等)等其它抗癌药物的任意 一种或多种。本发明的一个优选实施例中，提供了一种制备rhIL-15的方法，本发明制备方法 通过一系列基因克隆的构建策略，合成目的基因IL-15，并将目的基因IL-15克隆到表达载 体上，再将含有目的基因的表达载体转化至大肠杆菌，构建工程菌发酵制备rhIL-15。本发明的一个优选实施例中，提供了 rhIL-15对Ehrlich腹水瘤小鼠的治疗作用， 艾氏腹水小鼠给予有效量的rhIL-15，可显著抑制肿瘤细胞的有丝分裂指数，而胸腺淋巴细 胞有丝分裂指数显著增长生长。本发明的还一优选实施例中，提供了 rhIL-15对卵巢癌U15腹水瘤小鼠的治疗作 用，小鼠腹水增长显著受到抑制，死亡率也明显降低。在本发明的又一实施例中，提供了 rhIL-15对恶性肝癌H22腹水瘤小鼠的治疗作 用，荷肝癌H22小鼠在40天内均死亡，但给予重组人白介素15治疗后，其生存期得到明显 延长。
图1左为rhIL-15的诱导表达情况电泳图，右为rhIL_15的样品和标准品 WesternBlot杂交图，从图中可以看出在大约13kDa的位置出现明显的目的蛋白条带， Western Blot试验表明该目的条带出现明显的印迹反应，说明白介素15获得了正确高效 表达。图2为rhIL-15样品纯化前、后的电泳情况图，纯化后的重组rhIL_15经 Tricine-SDS-PAGE电泳检测，结果在大约13kDa的位置出现一条带。图3为纯化后的rhIL-15样品的高效液相色谱图，纯化后的rhIL_15显示仍为单一峰。
具体实施例本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发 明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领 域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本 发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改 变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。实施例1制备rhIL-15试验材料DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶均为GIBCO公司产品；大肠杆菌宿主菌DH5a，BL21(DE3)菌株(购自Invotrogen公司)；pVB220 载体(购自Novagen公司)1引物的设计与合成根据报道的hILl-15的基因序列设计一对引物，上游引物 Pl 5‘ -CctcgagTTCATGAACTGGGTGAATGTAATAAG-3‘,包括起始密码子 ATG，外设 Xho I 酶切位 点；下游引物P2 :5，-CGGATCCttaTTAAGAAGTGTTGATGAAGATTTG-3，，将终止密码子变成原核 系统高频使用的强终止子TAAjhSBamH I酶切位点，引物由北京雷默生物技术有限公司 合成和纯化。2富含IL_15mRNA单个核细胞的制备及总RNA提取，采用常规密度梯度离心方法分 离正常人外周血白细胞，培养与含10%小牛血清、青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液中， 加入细菌脂多糖5 μ g/ml和干扰素-Y 500u/ml，培养4h，弃去悬浮细胞，收获帖壁的单个核 细胞，经异硫氰酸胍法提取细胞总RNA，采用甲醛变形琼脂糖凝胶水平电泳鉴定RNA。3RT-PCR反应逆转录反应取细胞总RNA 5-10 μ g作为模板，加入DTTlOmmol、 M-MLV200u、4xdNTP (每种)0. 5mmo 1、下游引物 P250pmo 1，总反应体积 20 μ 1、37 °C 作用 lh, 95 °C IOmin 灭活 M-MLV ;PCR 反应在 RT 反应物 20 μ 1 中，加入 MgCl2 2mmol、4xdNTP 0. lmmol、上游引物P150pmol、95°C、5min，加入TaqDNA聚合酶2u。PCR反应条件94°C lmin、 58°C lmin、72°C lmin，循环 35 次，72°C延长 7min。扩增得到 IL_15cDNA 序列。4IL-15重组表达载体构建将RT-PCR扩增后的IL_15cDNA用XhoI和BamHI双酶 切后，经低熔点琼脂糖电泳纯化回收片段，再在T4DNA连接酶的作用下与同样酶切的pBV220 载体连接，转化入DH5 α大肠杆菌，在含氨苄青霉素的选择性培养基上筛选阳性克隆。5将rhIL-15表达载体转化大肠杆菌宿主菌BL21 (DE3)，筛选阳性转化子，将阳性 的克隆菌株接种于2ml含氨苄青霉素的LB培养液中，30°C活化后，1 100接种，扩增至 OD600 = 0. 4-0. 6时，于37°C诱导培养4h，5000r/min离心5min收集菌体，超声波破碎菌体， 收集包涵体，然后通过变性_复性_层析的方法纯化rhIL-15，最后获得95 %以上纯度的 rhIL-15。纯化的rhIL-15经氨基酸分析，其N端的10个氨基酸序列结果表明，样品中除部 分N端多出1个甲硫氨酸外(转录时的起始密码子)，氨基酸序列与天然的人IL-15相同， 纯化后的rhIL-15的比活为2X 107U/mg.实施例2rhIL_15对Ehrlich恶性腹水癌细胞和免疫细胞有丝分裂指数的影响Ehrlich腹水癌细胞转染后的小鼠，随着瘤龄增长，胸腺组织逐渐萎缩，胸腺淋巴 母细胞转化率、有丝分裂指数级淋巴转化反应均下降，与此同时，癌细胞有丝分裂速度加 快，每克体重的癌重(含腹水)及每克癌肿的细胞数则不断增加。试剂rhIL_2(市售，购于深圳晶美生物工程有限公司)，rhIL_15(自制)； Ehrlich腹水癌细胞购自北京肿瘤研究所，由本公司保存；Balb/c裸鼠购自购自中国医 学科学院动物实验中心4_5周龄，体重(17-20g)，雌雄各半；RPMI1640培养基购自美国 Gibco公司；胎牛血清购自Invitrogen公司。小鼠模型建立=Ehrlich腹水癌细胞(EAC)用10 %的FBS、RPMI1640培养基在 37°C、5 %的CO2孵育箱进行培养，待细胞生长至对数生长期时，用0. 25 %的胰酶消化并收 集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后重悬，每只裸鼠(Balc/c小鼠)于腹腔注射重悬液 0. 2ml (IXlOVmL)0正常和荷瘤小鼠均设计对照组和实验组，每组10只。实验组在小鼠右 前肢肌注rhIL-15 (5 X IO4U/次)，隔日一次，共7次，对照组在相应部位肌注等量的无菌生牀巴正 荷瘤鼠
癌细正常鼠
^荷瘤鼠 从上表结果可以看出，正常鼠经注射rhIL-15后，其胸腺淋巴细胞有丝分裂指数 明显增加，MI值分别为(1. 15士0. 17) %和8. 27士 1. 26%，差异具有显著性(P < 0. 01)，小 鼠核瘤后，则胸腺淋巴细胞有丝分裂指数显著下降，而当注射rhIL-15后，胸腺淋巴细胞有 丝分裂指数显著升高，MI值分别为(0.21 士0.02)%和6. 92士0.68%，差异具有显著性(P <0.01)；癌细胞移植到小鼠体内后，细胞持续增长，癌细胞有丝分裂指数较高，一场的有 死分裂相增多，注射rhIL-15后，荷瘤小鼠有丝分裂指数要较对照组(注射等量生理盐水) 低，但差异无显著性(P>0.05)。15天后，正常组小鼠无死亡数量，荷瘤组经给予等量生理 盐水，10只小鼠中有6只死亡，而经注射给予rhIL-15，其10只小鼠中死亡数量为2只，死 亡比例明显低于未给药组。实施例3重组人白介素15对移植U14腹水瘤小鼠的影响健康的远交系Km小鼠，雌性，体重24_29g，购自北京大学动物实验中心提供；小鼠 宫颈瘤14号(U14)由中国医学科学院基础医学研究所病理室提供，经615近交系小鼠腹腔 传代。小鼠腹水瘤模型的建立在无菌条件下，从腹腔移植U14瘤株第10天的615小鼠腹
理盐水(0. 2ml)。有丝分裂指数的测定在小鼠末次给药后第一天取材测定，取材前2小时腹腔注射秋水仙碱(剂量为 4mg/g.体重)，颈椎脱臼处死小鼠，分别去除EAC细胞和胸腺细胞，置于BSS生理盐水中制 成但细胞悬浮液，按常规空气干燥法制片，每个样本重复15片，用pH6. 8的1 % Giemsa染色 液染色，经清水漂洗，干燥后镜检。制好的玻片标本于光镜下随机观察计数500-1000个有核细胞(包括有丝分裂相 细胞)，按下式求出分裂细胞占观察细胞综述的百分率，即为各样本的有丝分裂指数，结果 见表1。
MI%=應啲細腿χ1000/ο
观察的细胞总数表lrhIL-15对Ehrlich恶性腹水癌细胞和免疫细胞有丝分裂指数的影响
ZZi观察细胞有丝分裂Λ/ΓΤ,-_^η、0/ ZZ^
组别总数细胞个数ΜΙ(Η⑵)％ P值
rrrj frr| frrj frrj Trrj ΠΗ^
自资资资绍资资资 照验照验照验照验 对实对实对实对实腔中抽出粘稠腹水2ml，以无菌生理盐水稀释，取样，证实为活瘤细胞后，给每只Km小鼠腹 腔注入0.2ml (约3X IO7瘤细胞)。腹腔移植瘤细胞24h后，将小鼠随机分为对照组(腹腔 注射给予等量生理盐水)，rhIL-15低剂量组2 X IO4U/次、中剂量组5 X IO4U/次、高剂量组 8 X IO4U/次3个实验组，共4组，每组10只，腹腔给药，1次/天，每周连续6天停药一天， 连续给药4周。疗效指标1末次给药后统计各组小鼠用药前后胸围、体重的变化和生存期，采用 百分率比较，结果见表2。表2rhIL_15给药4周后对U14腹水瘤生存期、体重及腹围变化的影响( 士 S ) 从上表结果可知，注射给予不同剂量的rhIL-15均可一定程度地延长U14腹水瘤小 鼠的存活期，给予生理盐水的组，其四周后存活比例为0/10，而rhIL-15低、中、高三个剂量 注射给予4周后的存活比例分别为3/10、5/10、6/10，存活期显著高于生理盐水组。从给药 前后体重和腹围变化情况可以分析，对照组和低剂量rhIL-15组体重略微下降，腹围增长， 说明瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，引起消瘦或恶质瘤，而腹围的增加提示腹水增多，rhIL-15 中、高剂量组体重较给药前要稍微高，而腹围增长率相对较低，间接反映了腹腔内肿瘤组织 增长受到抑制，腹水体积增长率小。疗效指标2实验前24小时将U14细胞进行传代培养，以Hank，s液洗3次，用PRMI-1640培养 液调整细胞浓度为4X 105mL-l无菌取脾，制备脾细胞悬液，以Hank，s液洗3次，用PRMI-1640培养液调整细胞浓 度为4X 107mL-l，作为靶细胞。1000r/min离心lOmin，调整细胞浓度为2 X IO7HiL-I，作为效 应细胞。取靶细胞和效应细胞各ΙΟΟμ 1(效靶比50 1)，加入U型96孔培养板中，靶细 胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μ 1，靶细胞最大释放孔加靶细胞和体积分数为
的ΝΡ40各100 μ 1 ；上述各项均设3个平行孔，于37°C，体积分数5 %的C02培养箱中培养 4h,然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清液100 μ 1置平底96孔培养 板中，同时加入LDH基质液100μ 1，反应3min，每孔加入lmol/1的HC130 μ 1，在酶标仪上 490nm处测定OD值。NK细胞活性=(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔 0D) X 100%NK细胞活性见表3表3rhIL_15对小鼠NK细胞活性的影响 与模型对照组相比，*P < 0. 05，< 0. 01从上表结果可知，给予不同剂量的rhIL-15后，均可不同程度提高小鼠脾脏NK细 胞活性，差异具有显著性(P < 0. 05或P < 0. 01)，并呈剂量增长关系，高剂量组脾脏NK细 胞活性略低于正常对照组，但差异无显著性，而模型对照组的脾脏NK细胞活性显著要低于 正常对照组，说明rhIL-15可以提高荷腹水瘤U14小鼠的NK细胞活性，增强荷瘤小鼠的免 疫功能。疗效指标3对脾脏组织中T淋巴细胞亚群⑶4+、⑶8+的影响小鼠脾细胞悬液的制备无菌取出小鼠脾脏置于盛有IOml Hank’ s液的平皿中并 将脾剪碎，用200目网注射器针芯研磨后1300rpm/min离心6min，在沉淀中加4ml裂解液， 5min裂解，再加Hank，s液至IOml离心，然后用Hank，s液再洗2次后用500 μ IPBS (含 0. l%NaN3)溶解，最后吸少量悬液做20倍稀释，台盼蓝染色计数细胞，使细胞 浓度达IO6个/ml左右。吸取100 μ 1脾细胞放入离心管中，然后加入1 μ 1的⑶4-ΡΕ和⑶8-FITC抗体避光 孵育30min，用PBS洗后离心，加含多聚甲醛的PBS500y 1固定，最后通过BD FACSlibar 流式细胞仪(美国BD公司)及配套原装BD test试剂盒，检测CD4、CD8阳性表达率，结果 见表4。表4重组人白介素15(rhIL_15)对脾T淋巴细胞亚群⑶4+、⑶8+的影响( 与对照组相比，*P< 0. 05，**P < 0. 01。从上表结果可以看出，给予不同剂量的重组人白介素15，可以显著提高移植U14腹 水瘤小鼠脾脏组织中T淋巴细胞亚群⑶4及其⑶4/⑶8的值，与对照组相比，差异具有显著 性，其中中高剂量组与对照组相比差异具有及显著性(P < 0. 01)、但各剂量组对CD8基本没 有影响，说明给予U14腹水瘤小鼠不同剂量的rhIL15，可以显著提高小鼠的细胞免疫能力。实施例4重组人白介素15对肝癌H22腹水瘤小鼠生存期与生命延长率的影响临床上癌性腹腔积液是晚期肝癌常见的并发症，它的产生直接影响患者的生活质 量和生存期，晚期肝癌腹水患者，2-12个月后，大多死亡。本实验采用昆明小鼠腹腔接种 H22细胞，建立肝癌腹水模型，以研究rhIL-15对肝癌腹水的影响。
昆明小鼠，雌雄各半，体重(19士0.5) g，购于北京大学动物实验中心；H22细胞购 自北京肿瘤研究所。H22细胞用10%的FBS、RPMI1640培养基在37°C、5%的CO2孵育箱进行培养，待 细胞生长至对数生长期时，用0. 25%的胰酶消化并收集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤 后重悬，用生理盐水调节细胞密度约为5 X 107个/ml，锥虫蓝染色镜检细胞存活率> 95 %， 小鼠腹腔注射细胞悬浮液，0. 2ml/只，接种后，随机分成4组，10只/组，即空白对照组(注 射给予等量的生理盐水)、rhIL-15低剂量组2 X IO4U/次、中剂量组5 X IO4U/次、高剂量组 SXlO4U/次，腹腔注射，给药体积0. 2ml/只，1次/天，直到实验结束。结果发现，空白对照组小鼠在第13-18天全部死亡，治疗组从第17天开始出现死 亡小鼠，40天后最终各治疗组小鼠均死亡，在此以各组小鼠平均生存期和生命延长率作为 治疗评价指标，各组小鼠生存期见表5。表5各组小鼠荷瘤生存期与生命延长率比较 从上表结果可以看出，给予不同剂量的rhIL-15，均可不同程度地延长小鼠生存期 (相对空白对照组)，三个剂量组对小鼠生命延长率分别为31. 3%,62. 5%和87. 5%，但40 天后各组小鼠均全部死亡，提示rhIL-15可延长肝癌H22腹水瘤的生存期。
权利要求
重组人白细胞介素15在具有治疗和缓解恶性腹水瘤药物中的应用。
2.含有重组人白介素15的药物组合物在制备具有治疗和缓解恶性腹水瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及重组人白介素15(rhIL-15)以及含有重组人白介素15的药物组合物在制备具有治疗恶性腹水瘤药物中的应用，经体内药理实验证明，恶性腹水模型小鼠注射给予rhIL-15后，可显著延长其生存期。
文档编号A61P35/00GK101912599SQ20101024038
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者侯建华, 周德胜, 张春丽, 熊国裕 申请人:北京凯因科技股份有限公司;北京凯因生物技术有限公司