专利名称：一种具有抗肿瘤活性的熊果酸哌嗪类衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种熊果酸哌嗪类衍生物及其制备方法，具体说是一种具有抗肿瘤活 性的熊果酸哌嗪类衍生物及其制备方法。
背景技术：
熊果酸(Ursolic acid，UA)，又名乌索酸、乌苏酸，属五环J萜类化合物，化学名
(3 3 ) -3-Hydroxyurs-12-en-28-oic acid,其相对分子量为 456. 68，分子式为 C3(lH4803，它以 游离或糖苷的形式，广泛分布于自然界中。药理学研究发现，熊果酸具有广泛的生物学效 应，熊果酸具有多种生物学活性，如抗癌、抗HIV、抗肝损伤、抗疟、抗炎抑菌等，其中尤以抗 癌活性最为显著，其抗癌谱广，不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用，而且对多种肿瘤细胞 体内、外均有抑制作用。其副作用小，毒性低，显示出较大的临床应用潜力。
熊果酸的化学结构式为
III。 目前，国内外对熊果酸的研究报到多集中在熊果酸的分离提取工艺和药理学研 究方面，而对熊果酸的结构修饰方面研究较少。由于熊果酸的显著抗癌作用使得这一方 面的研究较为深入。如王涛等的“熊果酸抗肿瘤作用及其机制研究进展”(《药物生物技 术》，2008, 15 [2])；刘训华等的“熊果酸的抗肿瘤作用”(《江苏医药》，2007，33 [2])；夏国豪 等的“熊果酸抗肿瘤作用研究进展”(《国外医学肿瘤学分册》，2002，29[6]);等等。多数研 究者认为，熊果酸能通过化学预防、抗突变、细胞毒作用、抗肿瘤血管生成及诱导肿瘤细胞 分化、凋亡等来抑制肿瘤的发生、入侵与转移。国内的白育军等增加熊果酸A环的含氧取代，进行结构修饰，合成6种母核修 饰物(《华西药学杂志》，2003，18 [2])；纵伟等利用环糊精，采用饱和水溶液法包合熊 果酸，解决了熊果酸水溶性差的问题(《熊果酸环糊精包合物制备工艺研究》，2008， 29[1]);孟艳秋等开发了熊果酸修饰含氨基化合物等系列衍生物等多项专利。本发明 的立足点在于研发一种具有抗癌活性的熊果酸哌嗪类衍生物N-[3 0 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪，国内外未见其报道。
发明内容
本发明的目的是以熊果酸为先导化合物，合成具有抗癌活性的熊果酸哌嗪类衍生 物。本发明的熊果酸哌嗪类衍生物为N- [3 0 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]_ (1_羟 乙基乙氧基)哌嗪，结构式如式I所示 制备方法如下
(1)熊果酸与醋酸酐反应，生成3-0-乙酰基熊果酸；3-0-乙酰基熊果酸的结构式如式 II所示；II。 (2)3-0-乙酰基熊果酸与草酰氯反应，再与1-羟乙基乙氧基哌嗪反应得 N-[3 3 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪，结构式如式I所 所述制备方法具体步骤如下
(1)1重量份的熊果酸搅拌溶解于40-50重量份的吡啶中，滴加入2-3重量份的醋酸 酐，加入0.001-0. 02重量份的DMAP，室温下搅拌16-18 h，反应结束后，用2 N HC1调节pH 3-4，蒸除溶剂，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，干燥后的产物干法上样，柱层析纯化，无水乙 醇热溶，冷却重结晶，得白色粉末状的3-0-乙酰基熊果酸；
(2)1重量份3-0-乙酰基熊果酸溶解于30-35重量份CH2C12中，逐滴加入1_2重量份 的草酰氯，室温下搅拌反应36-48h，蒸除溶剂及反应产生的气体，得3-0-乙酰基UA酰氯中 间体的粗品，直接进入下一步反应；在上述中间体的粗品中加入20-30重量份的CH2C12，三 乙胺调节溶液PH 8-9，加入2-3重量份的1-羟乙基乙氧基哌嗪，室温下搅拌反应3-5h，反 应结束后，反应液中加5-10重量份的水，以2N HC1调节pH3-4，过滤，水洗滤饼至滤液pH为 中性，干燥；干燥后的产物干法上样，柱层析纯化，无水乙醇热溶，冷却重结晶，得白色粉末
4状N_[3 0 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪。 此外，N-[3 0-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪还
可与NaOH发生水解反应，进一步生成衍生物，结构式如式IV所示 具体步骤如下
称取1重量份的N-[3 0 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌 嗪，溶于20-30重量份的CH30H-THF (1 1. 5 v :v)中，加入1-1. 5重量份的4N NaOH，室温 下搅拌反应3. 5-4h，反应完全，向混合物中加入5-10重量份的水，2 N HC1调pH 3_4，减压 蒸除溶剂，水洗沉淀至中性，柱层析纯化，无水乙醇热溶，冷却重结晶，得衍生物IV。根据上述方法可以制得一系列熊果酸哌嗪类衍生物，制备方法如下，具体步骤同 上
(1)熊果酸与醋酸酐反应，生成3-0-乙酰基熊果酸；
(2)3-0-乙酰基熊果酸与草酰氯反应，再与N-2-羟乙基哌嗪反应得衍生物V。(3)衍生物V与NaOH发生水解反应，进一步生成衍生物VI。其中所述衍生物V、VI结构式如下
上述所合成的一系列熊果酸哌嗪类衍生物可用于抗肿瘤药物的制备。
本发明的优点在于，本发明对天然产物熊果酸进行结构改造，得到乙酰 氧基_熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪(I)及其系列哌嗪类化合物(IV、 V、VI)，体外细胞增殖抑制实验表明，化合物I、IV和V对所测肿瘤细胞株H印G2、BGC823、 SH-SY5Y、Hela的增殖抑制作用优于熊果酸，而对人胚肺成纤维细胞HELF的毒性作用则低 于熊果酸。其中化合物I的效果最好。
图1为本发明中N_[3 乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧 基)哌嗪(化合物I)和N-[30-羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪 (化合物IV)的合成路线；
图2本发明中N- [3 0 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(N-2羟乙基)哌嗪(化 合物V)和N-[3 0 -羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(N-2羟乙基)哌嗪(化合物VI)的合 成路线。
具体实施例以下为本发明的具体实施例子以及对比实施例可以进一步清楚地了解本发明，但 是它们不是对本发明的限定
实施例1
3-0乙酰基熊果酸(化合物II)的制备
称取0. 7062 g熊果酸，加入30 ml吡啶，搅拌溶解后滴加入1. 8 ml醋酸酐，加入少量 的DMAP，室温下搅拌16 h，反应结束后，用2 N HC1调pH 3_4，蒸除溶剂，抽滤，水洗滤饼至 中性，常压100°C干燥，干燥后的产物干法上样，柱层析纯化(石油醚(60-90°C)乙酸乙酯 =3 1 )，无水乙醇热溶，冷却重结晶，得3-0乙酰基熊果酸。性状白色粉末；产率86.17% ；mp 286-288°C。IR数据(KBr，cnT1)及其归属u 3293 (0-H伸缩振动)，2927 (C-H伸缩振动)， 1736 (s，C=0伸缩振动)，1370 (UA A区特征吸收)，1245 (s，C-0-C不对称伸缩振动)cm—1。ESI-MS :m/z 497. 5 [M_H]+，521. 5 [M+Na] +。1H NMR (400MHz, CDC13) 8 :5. 23 (t，lH，H—12，/=2. 8Hz )，4. 49 (t，lH，H_3， J=7. 2Hz),2. 17 (d，lH，H-18，/=10. 8Hz)，2. 04 (s，3 H, CH3C00), 1. 06 (s，3 H, CH3),0. 97 (s，3H，CH3),0. 94 (s，3 H，CH3)，0.92 (s, 3H, CH3), 0. 82 (d, 3 H，CH3，/=6. 4Hz)，0. 78 (s, 3 H, CH3)，0. 76 (s，3 H, CH3)。实施例2
N-[3 0 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪(化合物I)的 制备
称取0.2837 g 3-0乙酰基熊果酸溶解于20 ml CH2C12中，分批次、逐滴加入草酰 氯0.53 ml，室温下搅拌反应36 h，蒸除溶剂及反应产生的气体，得3_0_乙酰基UA酰氯 中间体的粗品，直接进入下一步反应。在上述中间体中加入20 ml CH2C12，三乙胺调节溶 液pH 8-9，加入1-羟乙基乙氧基哌嗪0. 5703g，室温下搅拌反应4 h，反应结束后，反应 液中加入10 ml蒸馏水，以2N HC1调pH3-4，过滤，水洗滤饼至滤液pH为中性，干燥。柱层析纯化(氯仿丙酮=3:1)，无水乙醇热溶，冷却重结晶，得N-[30-乙酰氧基-熊果 烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪。性状白色粉末；产率37.87% ；mp 105-107°C。IR数据(KBr, cm—1)及其归属u 3446 (0-H伸缩振动)，2945 (C-H伸缩振动)， 1734 (s，C=0伸缩振动)，1633 (s，C=0伸缩振动，酰胺I峰)，1370 (UA A区特征吸收)，1246 (C-0-C不对称伸缩振动)cnT1。LC-MS :m/z 656. 1 [M+H] +，677. 6 [M+Na] +。1H 匪R (400MHz, CDC13) 8 :5. 21 (s，lH，H_12)，4.48 (t, 1H, J =4. 0Hz, H_3)， 3. 71 3.61 (m，8H，4XC迅)，2. 58 (t，2H，/=5. 2Hz，_N(C 迅)2)，2. 48 (br,4H, -N (CH2CH2) 2),
2.04 (s, 3 H, CH3C0), 1. 06 (s,3H,CH3),0. 93 (d, 3 H，CH3，/=6. 0Hz)，0. 86 0. 84 (m, 9H, 3XCH3),0.84 (s, 3 H, CH3),0. 73 (s, 3 H, CH3)。实施例3
N- [3 0 -羟基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪(化合物VI)的制
备
称取 I 0. 3128g，溶于 20ml CH30H_THF (1:1.5 v :v)中，加入 2. 0ml 4N NaOH，室温下 搅拌反应3. 5 h，反应完全，向混合物中加入适量的水，2 N HC1调pH 3-4，减压蒸除溶剂，水 洗沉淀至中性，柱层析纯化(氯仿丙酮=1 1 )，乙醇热溶，冷却重结晶，得N-[3 0 -羟基-熊 果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪(VI)。性状白色粉末；产率87.26% ；mp :111_113°C。IR 数据(KBr, cm"1)及其归属u :3414(0_H 伸缩振动)，2925(C_H 伸缩振动)，1616 (s，C=0伸缩振动，酰胺I峰)，1376 (UA A区特征吸收)，1227 (UA B区特征吸收)，cm—1。LC-MS :m/z 613. 6 [M+H]+，635. 6 [M+Na] +。1H 匪R (400MHz，CDC13) S :5. 21 (s，1H，H-12)，3. 71 (t,2H,/=4. 4Hz, C^C^OH),
3.71 3.61 (m，8H，4XCH2)，2. 58 (t，4H，/=5. 2Hz，_N (C^) 2)，2. 49 (br,4H, -N (CH2CH2) 2), 1. 05 (s，3H，CH3)，0. 94 0. 93 (m，6 H，2 X CH3)，0. 88 0. 85 (m, 9H，3 X CH3)，0. 76 (s, 3 H,
CH3) 0实施例4
N-[3 0 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(N-2羟乙基)哌嗪(V)的制备 称取0.5014 g I溶解于20 ml CH2C12中，分批次、逐滴加入草酰氯0. 61 ml，室温下搅 拌反应36 h，蒸除溶剂及反应产生的气体，得3-0-乙酰基UA酰氯中间体的粗品，直接进入 下一步反应。在上述中间体中加入20 ml CH2C12，三乙胺调节溶液pH 8_9，加入N_2_羟乙 基哌嗪0. 19g，室温下搅拌反应3 h，反应结束后，反应液中加入10 ml蒸馏水，以2N HC1调 PH3-4，过滤，水洗滤饼至滤液pH为中性，干燥。柱层析纯化(氯仿丙酮=3:1)，乙醇热溶， 冷却重结晶，得N-[3 0 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(N-2羟乙基)哌嗪(V)。性状白色粉末；收率46.81% ；mp :196_198°C。IR数据(KBr，cm—1)及其归属u 3417 (0_H伸缩振动)，2943 (C-H伸缩振动)， 1724 (s，C=0伸缩振动)，1595 (s，C=0伸缩振动，酰胺I峰)，1368 (UA A区特征吸收)，1251 (C-0-C不对称伸缩振动)cnT1。LC-MS :m/z 611. 6 [M+H]633. 6 [M+Na] +。
1H 匪R (400MHz, CDC13) 6 5. 22 (s，lH，H_12)，4.48 (t, 1H, J =6. 0Hz, H_3)， 3. 63 (t,2H,/=5. 2Hz,CH20H),3. 22 (t，lH，/=3. 2Hz，H_3)，2. 55 (t，2H，/=5. 2Hz，_N(C迅)2)，
2.47 (br,4H,-N(CH2CE,)2),2. 04 (s, 3 H, CH3CO), 1. 07 (s，3 H，CH3)，0.95 (s，3H, CH3), 0. 93 (d, 3 H，/=6. 4Hz，CH3)，0. 91 (s, 3H, CH3),0. 86 (d, 3H,/=6. 4Hz, CH3),0. 85 (s, 3 H, CH3),0. 75 (s, 3 H, CH3)。实施例5 衍生物(VI)的制备
称取 V 0. 6128g，溶于 25ml CH30H_THF (1:1.5 v :v)中，加入 4. 0ml 4N NaOH，室温下 搅拌反应4 h，反应完全，向混合物中加入适量的水，2 N HC1调pH3-4，减压蒸除溶剂，水洗 沉淀至中性，柱层析纯化(氯仿丙酮=1:1)，乙醇热溶，冷却重结晶，得N-[30-羟基-熊果 烷-12-烯-28-酰]-(N-2羟乙基)哌嗪(VI)。性状白色粉末；产率81.38% ；mp 208-210°C。IR数据(KBr，cnT1)及其归属u 3380 (0-H伸缩振动)，2926 (C-H伸缩振动)， 1635 (s，C=0伸缩振动，酰胺I峰)，1368 (UA A区特征吸收)cm—1。LC-MS :m/z 570. 0[M+H]+，591. 5[M+Na] +。1H 匪R (400MHz, CDC13) 8 :5. 22 (s，lH，H_12)，3.63 (t,2H,/=6. 0Hz, CH20H),
3.22 (t，lH，/=3. 2Hz，H-3)，2. 55 (t, 2H, /=5. 2Hz, -N(CE,) 2), 2. 47 (br,4H, -N (CH2CE,) 2), 2. 17 (t, 1H, /=3. 6Hz , H-18), 1. 07 (s,3H, CH3),0. 98 (s,3H, CH3),0. 94 (d, 3 H, CH3, /=6. 0Hz)，0. 91 (s，3H，CH3)，0. 87 (d, 3 H，CH3，/=6. 4Hz)，0. 77 (s,3H, CH3),0. 75 (s，3H，
CH3) 0实施例6
熊果酸(UA，III)及其衍生物(化合物I、II、IV、V、VI)的体外抗癌活性一MTT法检测药 物对细胞的增殖抑制作用
(1)取处于对数生长期状态良好的细胞一瓶，胰蛋白酶消化，制成5 X 104个/ml的细胞悬液。(2)细胞悬液移入96孔板，每孔lOOul，周围一圈用PBS填充，置37°C，5% C02培 养箱中培养24 h。(3)移去旧培养基，加入受试衍生物(用培养基将受试衍生物存储液稀释，设定不 同作用浓度)，每孔100ul，另设空白对照组、UA对照组(UA 60umol/L或20umol/L)和紫杉 醇对照组(60 umol/L或20umol/L)，每组设6个复孔。药物作用24 h后，吸弃含药培养基， 于每孔中加入无血清、无酚红1640培养基100ul，再加入MTT溶液10ul，继续孵育4 h，终止培养。(4)小心吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入150ul DMS0，振荡10 min，于490 nm
波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(0D值)，计算细胞的增殖抑制率抑制率(％)=(1_用 药组平均0D值+空白对照组平均0D值)X 100%，应用SPSS16. 0软件进行数据处理并计算 癌细胞增殖的半数抑制浓度(IC5(I)，结果见表1。表1熊果酸哌嗪类衍生物对不同肿瘤细胞的增值抑制作用
職is t,:cmraei L'A
ic50结果显示，所合成的ua哌嗪类衍生物对不同的肿瘤细胞均具有一定的增殖抑制作 用，化合物I、IV、V的抑制作用要优于UA，而且它对正常细胞的毒副作用略低于UA，说明化 合物I、IV、V具有较好的抗癌活性潜力，可作为抗癌候选药物进行进一步的研究。
权利要求
一种熊果酸哌嗪类衍生物，其特征在于所述熊果酸衍生物为N [3β 乙酰氧基 熊果烷 12 烯 28 酰] (1 羟乙基乙氧基)哌嗪，结构式如式I所示 I。201010240154X100001dest_path_image002.jpg
2.中如权利要求1所述的熊果酸哌嗪类衍生物的制备方法，其特征在于(1)熊果酸与醋酸酐反应，生成3-0-乙酰基熊果酸；3-0-乙酰基熊果酸的结构式如式II所示 (2)3-0-乙酰基熊果酸与草酰氯反应，再与1-羟乙基乙氧基哌嗪反应得N-[3 0-乙酰 氧基_熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪，结构式如式I所示。
3.根据权利要求2所述的熊果酸衍生物的制备方法，其特征在于所述制备方法具体 步骤如下(1)1重量份的熊果酸搅拌溶解于40-50重量份的吡啶中，滴加2-3重量份的醋酸酐， 再加入0.001-0. 02重量份的DMAP，室温下搅拌16-18 h，反应结束后，用2 N HC1调节pH 3-4，蒸除溶剂，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，干燥后的产物干法上样，柱层析纯化，无水乙 醇热溶，冷却重结晶，得白色粉末状的3-0-乙酰基熊果酸；(2)1重量份3-0-乙酰基熊果酸溶解于30-35重量份CH2C12中，逐滴加入1_2重量份 的草酰氯，室温下搅拌反应36-48h，蒸除溶剂及反应产生的气体，得3-0-乙酰基UA酰氯中 间体的粗品，直接进入下一步反应；在上述中间体的粗品中加入20-30重量份的CH2C12，三 乙胺调节溶液PH 8-9，再加入2-3重量份的1-羟乙基乙氧基哌嗪，室温下搅拌反应3-5h， 反应结束后，反应液中加5-10重量份的水，以2N HC1调节pH3-4，过滤，水洗滤饼至滤液pH 为中性，干燥；干燥后的产物干法上样，柱层析纯化，无水乙醇热溶，冷却重结晶，得白色粉 末状N-[3 0 -乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪。
4.一种如权利要求1所述的熊果酸哌嗪类衍生物或由权利要求2或3所述制备方法制 备的熊果酸哌嗪类衍生物，用于抗肿瘤药物的制备。
全文摘要
本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的熊果酸哌嗪类衍生物及其制备方法。所述熊果酸哌嗪类衍生物衍生物为N-[3β-乙酰氧基-熊果烷-12-烯-28-酰]-(1-羟乙基乙氧基)哌嗪(化合物I)。通过熊果酸与醋酸酐反应，生成3-O-乙酰基熊果酸，3-O-乙酰基熊果酸与草酰氯反应，再与1-羟乙基乙氧基哌嗪反应得化合物I。制备的熊果酸哌嗪类衍生物用于抗肿瘤药物的制备，对肿瘤细胞的增殖抑制作用优于熊果酸，而对人胚肺成纤维细胞HELF的毒性作用则低于熊果酸。
文档编号A61P35/00GK101891794SQ20101024015
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者林凤屏, 邵敬伟 申请人:福州大学