专利名称：Ⅰ型犬腺病毒弱毒疫苗株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株病毒弱毒疫苗株，尤其涉及一株由I型犬腺病毒强毒株CAV-H传 代致弱的弱毒疫苗株CAV-HR，本发明还涉及该弱毒疫苗株在预防或治疗由I型犬腺病毒所 致的各种疾病中的应用，属于I型犬腺病毒的预防或治疗领域。
背景技术：
I型犬腺病毒于1925年首次被发现。1984年，在我国首次分离到该病毒，证实了 我国犬中存在I型犬腺病毒的感染(殷震，刘景华.动物病毒学(第二版).北京科学出 版社，1997,757-762.). I型犬腺病毒在临床上可导致犬传染性肝炎(Webe J. DNA vaccine. Business Week，1996，2 :6·)、狐狸和熊脑炎的发生(夏成柱，范泉水，扈荣良，等.II型犬腺 病毒自然弱毒YCA18株的实验免疫研究.中国兽药杂志，2001，35(2) :1_4)。国外为预防与控制该病，已研制出多种商品用单苗与联苗；国内已有犬用五联苗 (狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒2型病和细小病毒病)、犬用三联苗(犬瘟热、狂犬病 犬细小病毒)研制成功的报道。哈尔滨兽医研究所也研制成功犬瘟热单苗。但目前以上疫 苗存在造价昂贵，抗原针对性不强等缺点，因而研制新型高效的CD疫苗已迫在眉睫。
发明内容
本发明目的之一是提供一株由犬腺病毒强毒株传代致弱的弱毒疫苗株。本发明目的之二是将上述弱毒疫苗株应用于预防或治疗由I型犬腺病毒所致的 各种疾病。本发明目的是通过以下技术方案来实现的I型犬腺病毒强毒株的分离与鉴定从黑龙江省养殖场一发病犬体内分离出病 毒。经过对该病毒的形态特征、病毒含量、病毒的血凝性、生物学特性和致病力等方面的 鉴定，结果表明，分离的病毒为犬腺病毒I型，命名为CAV-H株，不同感染剂量结果表明， 200TCID50就可以感染试验犬，出现典型的临床症状。本发明I型犬腺病毒弱毒株CAV-HR的培育将上述分离的犬腺病毒(CAV-H株) 通过连续接种MDCK细胞传代至120代，在传代过程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来越适 应MDCK细胞。与之相反，病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐减低；通过形态学 鉴定、纯粹性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验结果验证了培育的CAV-H弱毒株 (命名为CAV-HR)具有典型的腺病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染。本发明将所分离的CAV-H弱毒株(命名为CAV-HR)提交专利认可的机构保藏，其 微生物保藏号是=CGMCC No. 3809 ；分类命名为犬腺病毒；保藏时间是2010年5月14日； 保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明将所分离的I型犬腺病毒强毒株在MDCK上传代、克隆，培育了致弱毒株 (CAV-HR)，安全性和免疫原性试验结果表明，本发明的弱毒株CAV-HR株对同源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力。由此可见，致弱毒株CAV-HR株具有良好的免疫原性，可以对犬 提供较好的免疫保护作用，是理想的疫苗候选毒株。
图1110代腺病毒电镜照片。图21型犬腺病毒强毒株的PCR扩增的电泳鉴定；1 阳性对照；M :DL2000Marker ； 2:分离株；3:阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例II型犬腺病毒(CAV-H)分离株的分离鉴定1材料与方法1. 1病料来自黑龙江省发病犬，临床上表现为体温升高，眼、鼻流水样液体，血 便，病犬在患病3d内死亡。采集肠内容物作病毒分离。1.2细胞MDCK (74 94代，下同)细胞系购自中国兽医药品监察所。1. 3试验动物选用2 4月龄幼犬(CAV抗体效价彡1:2)，由哈尔滨医科大学 实验动物学部提供，经驱虫和Iw观察后，确定健康者可用。1.4血清犬抗CAV(SN彡1 16)标准阳性血清、阴性血清由本发明人实验室自 制。1. 5病毒的分离取患病犬肠内容物捣碎后用MEM细胞营养液制成1 9的悬液， 混勻，5000r/min离IOmin，取上清，0. 22 μ m微孔滤膜过滤，置_20°C保存。1.6病毒的培养将MDCK细胞按常规方法传代。37°C静置培养。待细胞长成单层 后，弃生长液，按培养液量体积的1/10接入待分离的样品，37°C吸附30min后，加维持液继 续于37°C静置培养4 5d，每天观察有无葡萄串样细胞病变(CPE)。如无病变则于培养的 第4 5d收取上清液，细胞继续按常规传代培养，至第5代仍无病变视为分离阴性，出现细 胞病变的反复冻融3次，收毒，置-20°C条件下保存待鉴定。1. 7病毒鉴定1. 7. 1形态学鉴定将收获的第5代病毒培养物上清离心后，将收获的病毒悬液5000r/min离心 30min,取上清15000r/min超速离心，4°C离心2h，沉淀用适量PBS溶液悬浮，做磷钨酸负染 和电镜切片观察。1. 7. 2血凝试验分别采取鸡、猪、人“0”型、豚鼠、大鼠的血液，置阿氏液内保存。按常规方法制备 的红细胞悬液，置4°C备用。血凝试验选用96孔“V”型血凝板，在不同pH、不同温度条
件下按常规微量方法进行，以50%红细胞出现凝集作为判定终点。1. 7. 3病毒含量测定
取CAV第5代细胞培养物1ml，做10倍系列稀释至10_8，取10_5、10_6、10_7、10_84个 稀释度，接种4瓶MDCK单层，每瓶lml，观察5 7d，计算TCID50。1.7.4耐酸性试验取CAV第5代细胞培养物，调pH至3.0，于37°C下作用2h后，与pH为7. 2的细胞 培养物同时分别接种MDCK，在37°C培养96h，收获后测定其病毒含量，观察该培养物抗酸 能力。1.7. 5耐热性试验取CAV的第5代细胞培养物，置56°C水浴中作用30min，取出后接种MDCK，37°C培 养96h，收获后测定其病毒含量，观察该培养物耐热性能。1.7. 6耐乙醚试验取CAV的第5代细胞培养物，加乙醚至20%，在4°C作用24h后取出，去掉乙醚，接 种MDCK，37°C培养96h，观察该培养物对乙醚的耐受性能。1. 7. 7核酸型鉴定将加有5-溴脱氧尿苷(BUDR)的取CAV的第5代细胞培养物，接种MDCK，37°C培养 96h，收获后测定其病毒含量，观察两组病毒增殖情况，确定病毒核酸的类型。1.7. 8血清中和试验将CAV病毒用MEM液稀释成100TCID5(1/0. 1ml，与等量抗犬腺病毒特异性血清混合， 置37°C水浴中和lh，接种MDCK单层，每瓶lml。观察5d，逐日记录细胞病变(CPE)。同时设 CAV病毒接种MDCK单层2瓶对照。1.7. 9 致病力根据CAV第5代细胞培养物的TCID5tl，稀释病毒为400TCID5(1/ml、300TCID5(1/ml和 200TCID50/ml，每个稀释度皮下接种2 4月龄犬各5只，每只Iml，观察21d，确定CAV对犬 的致病力，同时设生理盐水对照犬5只。1.7. 10PCR 鉴定1.7. 10. 1 引物合成检索GeneBank得到3株CAV-I和3株CAV-2的基因全序列，然后用DNAStar软件 将CAV-I的序列与CAV-2的序列进行比较分析，分析结果表明，CAV-I同CAV-2相比，在E3 区有大约500bp的缺失，根据这一特点，在缺失的两端分别设计上下游引物，最终可以根据 生成的产物大小来区分CAV-I和CAV-2。用引物设计软件01igo6. 0设计一对引物上游引 物 5，-CCTTGCCTTCTACATCTAT-3，，下游引物 5，-GGACCCAGAAGTCTTGAC-3，，交由宝生物(大 连)有限公司合成。1. 7. 10. 2 病毒 DNA 制备取病毒接种细胞1瓶，三次冻融，4°C，2000r/min离心15min，吸取上清，然后 40C 10000r/min离心45min,取50 μ 1上清液，依次加入200 μ 1变性液和50 μ 1氯仿异戊 醇(24 1)，充分振荡混勻，4°C 14000r/min离心5min。取水相转移至一个新的离心管中， 加入等体积异丙醇，颠倒混勻，4°C 14000r/min离心lOmin。倒去液体，加入400 μ 1 75%乙 醇，颠倒混勻，14000r/min离心5min。弃去上清，残留液倒置用滤纸吸净，60°C烘干，得到的 DNA沉淀可直接用于PCR反应，也可放于_70°C待用。1. 7. 10. 3 扩增
反应体系25 μ 1 分别加入病毒 DNA 2 μ lUOXPCR-buffer 2. 5 μ 1、dNTP 2 μ 1、 pi和ρ2 10pmol/L各1μ 1，DNA聚合酶0. 25 μ 1，用去离子水补至25 μ 1，于PCR仪上进行 反应。PCR程序为94°C预变性5s ；94°C变性5s，55°C退火lmin，72°C延伸45s，30个循环； 72°C延伸lOmin，反应结束后取产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。2实验结果2. 1病毒分离结果犬腺病毒接种MDCK单层后，第2代细胞36h即开始肿大、变圆，逐渐形成葡萄串状 CPE, 40 48h可收获。将分离的病毒命名为CAV-H株。2. 2病毒鉴定2. 2. 1形态学鉴定将犬腺病毒的细胞培养物做电镜负染观察，可见到典型腺病毒粒子团，单个病毒 呈20面体对称结构，直径70nm左右，表面无囊膜，在衣壳的顶端有时可看到纤维突，见图 1。2. 2. 2红细胞凝集试验对动物红细胞的凝集作用CAV-H株在4°C和37°C除对大鼠和人“0”型红细胞具有 较好的凝集作用外，还对豚鼠的红细胞有凝集作用，而CAV 2型犬腺病毒不能凝集豚鼠的 红细胞，利用这一特性我们可以断定我们分离的CAV-H为I型犬腺病毒。2. 2. 3病毒含量测定按常规方法测定第5代次培养物的病毒含量，结果为105_ 5TCID5tlA). Iml02. 2. 4耐酸性试验CAV-H第五代细胞培养物经pH3. 0处理后二者没有明显差别，说明CAV-H具有一定 的耐酸性。2. 2. 5耐热性试验 CAV-H第五代细胞培养物，经56 V处理30min，TCID50变化不明显，说明该病毒具有 一定的耐热性。2. 2. 6耐乙醚试验经乙醚处理的试验组与未处理的对照组的TCID5tl差别不明显，说明该病毒对20% 乙醚有抵抗力。2. 2. 7核酸鉴定CAV-H第五代经BUDR处理后，试验组与对照组的病毒含量差异显著，实验组的病 毒含量为10L3TCID50/0. 1ml，未经BUDR处理的对照组则为IO5'5TCID50/0. lml，说明BUDR使 病毒的增殖受到抑制，表明该分离病毒是DNA病毒。2. 2. 8血清中和试验稀释的CAV-H病毒与等量抗犬腺病毒特异性血清中和后，接种MDCK单层经观察无 CPE, CAV-H病毒接种对照组均产生明显的CPE。2. 2. 10感染犬的临床症状不同剂量感染犬均发病，症状多为双相热、眼鼻流水、精神沉郁、呕吐、腹泻等症 状，呕吐物一般多为带血胃液，腹泻物为果酱样血液。但是每个犬出现的症状并不相同，见 表1。
表1犬的临床症状 (+代表出现该种症状，-代表不出现该种症状)2. 2. IlPCR 鉴定结果利用合成的引物对分离株病毒进行PCR扩增。结果得到与预期片断相符的核酸电 泳带，扩增片段大小为534bp，证明该分离株为1型犬腺病毒，见图2。4.实验结论4. 1根据电镜观察、血清中和试验、病毒的血凝性、生物学特性和致病力等方面的 鉴定，结果表明，本实验分离了犬腺病毒I型。4. 2不同剂量感染犬试验表明，200TCID5Q就能使犬发病。4. 3不同感染剂量的试验犬，临床症状有所差异。实施例21型犬腺病毒弱毒疫苗株CAV-HR的培育1材料和方法1. 1试验材料试验动物为2 4月龄的健康犬(CAV抗体效价< 1 2)；抗犬腺病 毒特异性血清、红细胞悬液由本实验室制备，强毒为CAV-H 6代。1. 2CAV-H弱毒株的培育与鉴定1. 2. ICAV-H弱毒株的培育通过MDCK细胞传代CAV-H至110代，期间进行了 3次克隆纯化。1. 2. 2CAV-H弱毒株的形态学观察将收获的CAV-H 5、10、20、30、50、70、90、110代次病毒细胞培养物5000r/min离心 30min,取上清经20000r/min超速离心，4°C离心2h，沉淀用适量的PBS (pH7. 0)悬浮，磷钨酸
负染电镜观察。1. 2. 3CAV-H的纯净性检验取CAV-H的5、10、20、30、50、70、90、110代毒，按现行《中华人民共和国兽药典》附
录进行，应无细菌、霉菌和支原体污染。1. 2. 4病毒含量测定取病毒的5、10、20、30、50、70、90、110代培养物，分别做10倍系列稀释后，各取
10-4、10-5、10_6、10-7四个稀释度，接种MDCK细胞。每个稀释度接种4瓶，每瓶Iml。观察5d， 记录各稀释度病变细胞瓶数，按照Reed-Muench法计算TCID5(1。1.2. 5病毒的特异性检验
分别取CAV-H 的 5、10、20、30、50、70、90、110 代次毒，用 MEM 液稀释成 100TCID50/0. 1 μ 1，与等量抗犬腺病毒特异性血清混合，置37°C水浴中和lh，接种MDCK，每 瓶lml。观察5d，逐日记录细胞CPE。同时设不中和的病毒对照组2瓶。1. 2. 6外源病毒检验1. 2. 6. 1致细胞病变外源病毒的检验分别取CAV-H 的 5、10、20、30、50、70、90、100 代次毒，将 CAV-H 用 MEM 液稀释成 100TCID50，与等量抗犬细小病毒特异性血清混合，置37°C水浴中和lh，取2个方瓶(IOml 容量)的MDCK细胞，接种中和后的病毒液Iml，在37°C下吸附lh，观察5 7d，检查是否出 现由接种物引起的CPE，同时设未中和的病毒接种细胞2瓶为对照。1. 2. 6. 2致红细胞吸附的外源病毒检验将上述接种中和病毒的细胞培养瓶，用PBS洗涤细胞单层3次，加入红细胞悬 液，在4°C培养30min，用PBS洗涤，检查红细胞吸附情况。1. 2. 7CAV-HR弱毒株致弱评价试验45只2 4月龄犬随机分成9组，每组5只，1 8组犬分别用CAV-H的5、10、20、 30、50、70、90、110代次毒接种，各代次病毒稀释为105 5TCID5(1/lml，lml/犬，观察21d，记录 临床发病数，设对照5只犬，接种相同剂量灭菌生理盐水。1. 2. 8CAV-HR株免疫效力试验取2 4月龄犬20只，随机平均分成4组A组、B组、C组、D组，A、B、C组各5只 为试验组，D组5只作为对照，A、B、C组犬分别用CAV-H的90、100、110代次毒接种，接种剂 量为104_tlTCID5tl/犬，D组接种灭菌生理盐水lml。21d后，A、B、C组犬和D组对照犬均皮下 攻击同源强毒，剂量为200TCID5(1/犬。攻毒后观察21d，记录临床保护数。2实验结果2. ICAV-H弱毒株的培育及形态学观察在CAV-H传代过程中经过3次克隆纯化，将CAV-H的5、10、20、30、50、70、90、110
代次毒细胞培养物负染电镜标本中，可见到典型腺病毒粒子团，单个病毒呈20面体对称结 构，直径70nm左右，表面无囊膜，但有整齐排列的壳粒。2. 2CAV-H的纯粹性检验细菌、霉菌与支原体检验按现行《中华人民共和国兽药典》 附录所述方法进行，无细菌、霉菌及支原体生长。2. 3病毒含量测定CAV-H 的 5、10、20、30、50、70、90、110 代次毒的病毒含量。2. 4病毒的特异性检验CAV-H的各代毒中和后接种MDCK，观察5d，细胞均无CPE ； 对照组2瓶细胞在90 IlOh出现典型的CPE。2. 5外源病毒检验2. 5. 1细胞检测外源病毒各代次病毒中和后接种MDCK，经观察均无CPE产生，对照 组细胞出现明显的CPE。2. 5. 2红细胞凝集试验各代次病毒均不能凝集鸡外周血红细胞，说明病毒液中不 含能使鸡外周血红细胞凝集的其它病毒。2. 6CAV-HR弱毒株致弱评价试验CAV-H毒株经MDCK传代后对犬的致病力逐渐减弱。CAV-H第5到第50代次毒对犬的致病力由100%降到20%，死亡率由40%降至0，发病犬出现体温升高平均在41°C左 右、呕吐、腹泻等临床症状；CAV-H从20代次以后的代次致病力下降，在70代到110代对犬 的致病力和死亡率均为0，对照犬均正常。2. 7CAV-HR株免疫效力试验免疫组(A、B、C组) 犬在接种后21d，皮下攻同源强毒，观察21d无发病现象，也无死亡发生。而对照组(D组) 犬则有100%发病，死亡率为40%。发病犬表现为体温升高平均在40°C左右、鼻流清液、排 稀便等临床症状，见表2。表2CAV-HR弱毒株免疫效力试验 3实验结论CAV-H通过在MDCK上传代、克隆，培育了致弱毒株，致弱毒株CAV-HR株具有良好的 免疫原性，可以对犬的腺病毒感染提供较好的免疫保护作用，是理想的疫苗候选毒株。
权利要求
一株I型犬腺病毒(Canine adenovirus)强毒株传代致弱所得到的弱毒疫苗株，其特征在于，微生物保藏号是CGMCC No.3809。
2.权利要求1所述的I型犬腺病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗由I型犬腺病毒所致 疾病药物中的用途。
3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于所述的由I型犬腺病毒所致疾病包括犬 传染性肝炎、狐狸脑炎或熊脑炎。
4.一种预防或治疗由I型犬腺病毒所致疾病的疫苗组合物，其特征在于由权利要求1 所述的有效量的I型犬腺病毒弱毒疫苗株和药学上可接受的载体或辅料组成。
5.按照权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于所述的由I型犬腺病毒所致疾病 包括犬传染性肝炎、狐狸脑炎或熊脑炎。
全文摘要
本发明公开了I型犬腺病毒弱毒疫苗株及其应用。本发明将所分离的I型犬腺病毒强毒株在MDCK上传代、克隆，培育了致弱毒株(CAV-HR)，安全性和免疫原性试验结果表明，本发明的弱毒株CAV-HR株对同源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力。本发明致弱毒株CAV-HR株具有良好的免疫原性，可制备成单苗或联苗，可有效预防或治疗由I型犬腺病毒所致疾病。本发明弱毒疫苗株遗传性稳定，具有免疫持久、效果好、安全可靠、保存期长等优点。
文档编号A61P31/20GK101914502SQ20101024496
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者刘大飞, 刘立奎, 张洪英, 曲联东, 王牟平 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所