专利名称：犬细小病毒弱毒疫苗株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株病毒弱毒疫苗株，尤其涉及一株由犬细小病毒强毒株CPV-YN传 代致弱的弱毒疫苗株CPV-YNR，本发明还涉及该弱毒疫苗株在制备预防或治疗由犬细小病 毒所致疾病的药物中的用途，属于犬细小病毒的防制领域。
背景技术：
犬细小病毒于1978 年首次被发现(AppelM J, Scott Fff, CarmichaelL E.Isolation and immunization studies of a canine parco-like virus from dogs withhaemorrhagic enteritis. Vet Rec，1979，105 (8) : 156-159.)，此后本病流行于世界各 地，我国于1982年证实存在犬细小病毒感染(梁士哲，渠川玫，魏喜仁，等.犬传染性肠炎 的研究I-腹泻犬粪便中检出的细小病毒颗粒.上海畜牧兽医通迅，1982，2 (4) :172.)，次年 徐汉坤等正式报道了本病的流行(徐汉坤，郭保发，金淮，等.血凝和血凝抑制试验在犬群 暴发犬细小病毒肠炎中的应.中国畜禽传染病，1983(4) :43-45.)。犬细小病毒是引起犬急 性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎的病原(A fshar A. . Canine Parvovirus infection-a review. Vet Bull，1981，51 :605_612.)，主要危害幼犬，特别是2 6月龄犬。该病发病急， 病程短，死亡率高，传染性强，对实验犬，军犬，警犬等犬群以及宠物犬均具有很大的危险 性。国外为预防与控制该病，已研制出多种商品用单苗与联苗；国内已有犬用五联苗 (狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒2型病和细小病毒病)、犬用三联苗(犬瘟热、狂犬病 和犬细小病毒)研制成功的报道。哈尔滨兽医研究所也研制成功犬瘟热单苗。但目前以 上疫苗存在造价昂贵，抗原针对性不强等缺点，因此开发一种新型高效的⑶疫苗已迫在眉睫。
发明内容
本发明目的之一是提供一株由犬细小病毒强毒株传代致弱的弱毒疫苗株。本发明目的之二是将上述弱毒疫苗株应用于预防或治疗由犬细小病毒所致的各 种疾病。本发明目的是通过以下技术方案来实现的犬细小病毒强毒株的分离与鉴定2002年冬季哈尔滨市道外区某养殖场的犬群 暴发流行病，患病犬表现为呕吐，腹泻，粪便呈红色胶冻状或水样，病死率较高。剖检可见肠 管膨大，肠壁上充血或出血，肠道内充满着胶冻状内容物或血水，4 6周龄幼犬剖检后可 见心室扩张，怀疑为犬细小病毒感染引起的出血性肠炎和心肌炎。通过CRH(细胞分离病 毒，对分离毒进行形态学观察，血凝、血凝抑制、特异性鉴定、动物回归试验及生物学鉴定， 证明分离的病毒为犬细小病毒，命名为CPV-YN株。本发明犬细小病毒弱毒株CDV-YBR的培育将本发明分离的犬细小病毒(CPV-YN 株)通过连续同步接种CRH(细胞传代至110代，在传代过程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来越适应CRFK细胞。与之相反，病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐减 低；通过形态学鉴定、纯粹性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验结果验证了培育 的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的细小病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染。本发 明将所分离的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)提交专利认可的机构保藏，其微生物保藏号是 CGMCCNo. 3841 ；分类命名为犬细小病毒；保藏时间是2010年5月14日；保藏单位是中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所。本发明将所分离的犬细小病毒强毒株CPV-YN通过在CRFK细胞上传代，培育了 CPV-YN致弱毒株(CPV-YNR)，致弱评价试验证明了致弱毒株培育成功。通过对致弱毒株病 毒的形态学观察、纯净性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验结果验证了本发明所 培育的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的细小病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染。免 疫效力试验结果表明，本发明犬细小病毒弱毒疫苗株(CPV-YNR)对同源强毒攻击的犬可以 提供很好的保护力。安全性和免疫原性试验结果表明，本发明弱毒疫苗株CPV-YNR株对同 源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力。由此可见，CPV-YNR株具有良好的免疫原性，本发 明弱毒疫苗株CPV-YNR可制备成单苗或联苗(活疫苗或灭活疫苗)，可有效预防或治疗犬瘟 热。本发明弱毒疫苗株CPV-YNR遗传性稳定，有免疫持久、效果好、安全可靠、保存期长等优 点ο
图1本发明将所分离的犬细小病毒强毒株CPV-YN的病毒电镜照片。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1犬细小病毒强毒分离株(CPV-YN)的分离鉴定1材料和方法1.1 材料1. 1. 1病料哈尔滨市道外区谊农综合养殖场的发病死亡犬。1. 1. 2细胞CRFK(65 95代下同)，购自中国兽医药品监察所，按常规方法培养。1.1. 3试验动物选用2 4月龄幼犬(CPV抗体效价彡1 2)，购自哈尔滨医科大 学实验动物学部，经驱虫和1周观察后，确定健康备用。1. 1. 4血清CPV标准阳性血清(抗体效价彡1 16), CPV阴性血清，由哈尔滨兽 医研究所提供。1.2分离方法1. 2. 1病毒的分离5份 患病犬带血粪便病料用MEM细胞营养液制成1 9的悬液， 混勻，5000r/min离心lOmin，取上清，0. 22 μ m微孔滤膜过滤，置_20°C保存。1. 2. 2病毒的培养处理的样品按培养液体积同步接种CRFK细胞(购自中国兽医药品监察所)，37°C静止培养，同时设正常细胞对照。每天观察细胞贴壁生长情况和细胞病 变，若无CPE，则于培养的第4 5天收取上清，细胞继续按常规传代培养，至第5代仍无病 变视为阴性，出现细胞病变的经-20°C冻融3次后收毒，置-20°C保存。1.2. 3病毒的鉴定
1. 2. 3. 1 电镜观察取培养72h的CPV第五代细胞培养液作负染色，电镜观察病毒形态。1.2. 3.2耐酸性试验取CPV第5代细胞培养物，调pH至3.0，于37°C下作用2h后，与pH为7. 2的细胞 培养物同时分别接种CRFK，在37°C培养96h，收获后测定其病毒含量，观察该培养物抗酸能 力。1.2. 3.3耐热性试验取CPV的第5代细胞培养物，置56°C水浴中作用不同时间，取出后分别接种CRH(， 37°C培养96h，收获后测定其病毒含量，观察该培养物耐热能力。1.2. 3. 4耐乙醚试验取CPV的第5代细胞培养物，加乙醚至20%，在4°C作用24h后取出，去掉乙醚，接 种CRFK，37°C培养96h，观察该培养物对乙醚的耐受能力。1.2. 3. 5核酸型鉴定将加有5-溴脱氧尿苷(BUDR)的CPV第5代细胞培养物，接种CRFK，37°C培养96h， 收获后测定其病毒含量，观察两组病毒增殖情况，确定病毒核酸的类型。1. 2. 3. 6 血凝(HA)试验取CPV毒株第5代细胞培养物用1 %猪红细胞(RBC)进行HA试验。1. 2. 3. 7病毒含量测定将CPV的第5代细胞培养物作10倍系列稀释，取10_6、10_5、10_4三个稀释度，分别 接于6瓶CRFK悬液内，每瓶Iml。于37°C培养96h，观察CPE，按Reed-Muench法计算其病
毒含量。1. 2. 3. 8特异性测定将CPV第5代毒用MEM液稀释成IOOTCID5ci，与等量抗犬细小病毒特异性血清混合， 置37°C水浴中和Ih后，同步接种CRFK，每瓶lml，观察5d，逐日记录CPE。同时设CPV 5代 毒同步接种CRH(对照。1.2. 3.9动物感染试验将6只2 4月龄犬随机分成2组，对照组2只，实验组4只，试验组动物口服分 离细胞培养病毒1ml，对照组犬口服细胞培养液lmL，每天观察临床表现，每天测体温2次， 观察14d，并对死亡犬观察剖检变化。2实验结果2. ICPV分离与培养接种第5代病毒的细胞，在72h左右开始出现肿胀、圆缩、凝聚成团，并在细胞核 内形成圆形和椭圆形嗜酸性、大小不等的包涵体等规律性细胞病变，该分离病毒命名为 CPV-YN 株。2.2CPV毒株的鉴定
2. 2. 1电镜观察在培养72h的病毒培养物负染电镜标本中，可见到多数为空芯，少数为实芯、直径 为20nm、呈圆形的细小病毒粒子，见图1。2. 2. 2耐热性试验CPV-YN第5代细胞培养物经56°C处理30min和60min，TCID50基本无变化，说明分 离的病毒具有耐热性。
2. 2. 3耐酸性试验CPV-YN5培养物经pH3. 0处理，TCID5q为IO5_7/0. Iml与对照无明显差别，说明分离 的CPV-YN对pH3. 0有一定的抵抗力。2. 2. 4耐乙醚试验经乙醚处理的试验组与未处理的对照组的TCID5tl无明显差别，说明该分离毒对 20%乙醚具有一定耐受力。2. 2. 5核酸型鉴定CPV-YN5经BUDR处理后，病毒含量为102 9TCID5(1/lml，说明BUDR使病毒增殖受到 了明显抑制，表明该分离病毒是DNA病毒。2. 2. 6HA试验CPV-YN5细胞培养物的HA效价为1 256。2. 2. 7病毒含量测定测定第5代病毒培养物的病毒含量，其结果为106_OTCID5tlA). 1ml。2. 2. 8病毒特异性试验中和后的CPV-YN第5代培养物接种CRFK，观察5d，细胞无CPE，对照组在90 120h出现典型的CPE。2. 2. 9动物感染试验用细胞分离病毒液感染健康犬6d后，试验组4只幼犬有2只先后发病。2只临床 表现为精神不振、食欲减退、呕吐，发热，次日发病幼犬精神高度沉郁，食欲废绝，剧烈呕吐、 腹泻，排出暗红色、有强烈腥臭味的粪便，严重脱水，体温稍高，第7d死亡1只。剖检病死幼 犬发现；肠道粘膜出血、脱落，心脏肿大、发炎，其他器官无特征性变化。对照组2只幼犬临 床上无任何异常。3实验小结3. 1对分离毒的培养和电镜观察表明，CPV-YN株同步接种CRFK，CPE出现比较规 律，即接毒后72h，细胞开始圆缩、凝集成团；在电镜下，分离毒为散在实芯和空芯、直径为 20nm、圆形、无囊膜的颗粒，通过动物回归试验也证明了分离的是CPV。3. 2分离毒能凝集猪红细胞与CPV标准阳性血清呈特异性结合反应。分离毒有耐 酸(pH3.0)、耐热(56°C 60min)与抗乙醚的理化学特性。3. 3对爆发流行的犬细小病毒用CRH(传代表明，不同代次的分离毒，其CPE出现时 间比较规律，毒价较高也比较稳定，说明分离毒株用CRFK传代，稳定性良好且毒力较强。实施例2犬细小病毒弱毒疫苗株CPV-YNR的培育1. 1试验材料试验动物为2 4月龄的健康犬(CPV抗体效价< 1 2)；抗犬细小病毒特异性 血清、0. 2%红细胞悬液由本实验室制备，强毒为实施例1所分离的的CPV-YN 6代。
1. 2CPV-YN弱毒株的培育与鉴定1. 2. ICPV-YN弱毒株的培育通过CRFK细胞传代CPV-YN至110代。1. 2. 2CPV-YN弱毒株的形态学观察将收获的CPV-YN 5、10、20、30、50、70、90、100、105、110 代次病毒细胞培养 物5000r/min离心30min，取上清经20000rpm超速离心，4 °C离心2h，沉淀用适量的 PBS(pH7. 0)悬浮，磷钨酸负染电镜观察。1. 2. 3CPV-YN的纯静性检验取CPV-YN的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代次毒，按现行《中华人民共和
国兽药典》附录进行，应无细菌、霉菌和支原体污染。1. 2. 4病毒含量测定取病毒的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代培养物，分别做10倍递进稀释
后，各取10_4、10_5、10_6、10_7四个稀释度，同步接种0^细胞。每个稀释度接种4瓶，每瓶 Iml。观察5d，记录各稀释度病变细胞瓶数，按照Reed-Muench法计算TCID5(1。1.2. 5病毒的特异性检验分别取CPV-YN 的 5、10、20、30、50、70、90、100、105、110 代次毒，用 MEM 液稀释 成100TCID5(1/0. 1ml，与等量抗犬细小病毒特异性血清混合，置37°C水浴中和lh，同步接种 CRFK，每瓶lml。观察5d，逐日记录CPE。同时设不中和的病毒对照组2瓶。1. 2. 6外源病毒检验1. 2. 6. 1致细胞病变外源病毒的检验分别取CPV-YN 的 5、10、20、30、50、70、90、100、105 代次毒，将 CPV-YN 用 MEM 液稀 释成100TCID5(1/0. 1ml，与等量抗犬细小病毒特异性血清混合，置37°C水浴中和lh，取2个 方瓶(IOml容量)的CRH(细胞，接种中和后的病毒液lml，在37°C下吸附lh，观察5-7d，检 查是否出现由接种物引起的CPE，同时设未中和的病毒接种细胞2瓶为对照。1. 2. 6. 2致红细胞吸附的外源病毒检验将上述接种中和病毒的细胞培养瓶，用PBS洗涤细胞单层3次，加入0. 2%红细胞 悬液，在4°C培养30min，用PBS洗涤，检查红细胞吸附情况。1. 2. 7CPV-YNR株致弱评价试验55只2 4月龄犬随机分成11组，每组5只，1 10组犬分别用CPV-YN的5、10、 20、30、50、70、90、100、105、110 代次毒接种，各代次病毒稀释为 IO5.5TCID50/lml, lml/犬。观 察21d，记录临床症状和发病数，设对照5只犬，并接种相同剂量的灭菌生理盐水。1. 2. 8CPV-YNR株免疫效力初步评价20只2 4月龄犬随机分成A组、 组、C组和D组，A组、B组和C组均5只，D组5 只作为对照，A、B、C组犬分别用CPV-YN的90、105、110代次毒接种，接种剂量为IO4 tlTCID5ci/ 犬，D组接种灭菌生理盐水lml。21d后，4组犬皮下攻击同源强毒，剂量为200TCID5Q/犬。 攻毒后观察21d，记录临床保护数。2 结果2. ICPV-YN弱毒株的培育及形态学观察将CPV-YN的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代次毒细胞培养物负染电镜标
本中，可见到多数为空芯，少数为实芯、直径为20nm、呈圆形的病毒颗粒，未观察到其它病毒的存在。2. 2CPV-YN的纯净性检验细菌、霉菌与支原体检验按现行《中华人民共和国兽药 典》附录所述方法进行，无细菌、霉菌及支原体生长。2. 3 病毒含量测定 CPV-YN 的 5、10、20、30、50、70、90、100、105、110 代次毒的病毒含量。2. 4病毒的特异性检验CPV-YN的各代毒中和后接种CRFK，观察5d，细胞均无CPE ； 对照组2瓶细胞在90 120h出现典型的CPE。2. 5外源病毒检验2. 5. 1用细胞检验结果各代次病毒中和后接种CRFK细胞，经观察均无CPE产生，对照组细胞出现明显的 CPE。2. 5. 1红细胞吸附试验各代次病毒均不能凝集鸡外周血红细胞，说明病毒液中不含能使鸡外周血红细胞 凝集的其它病毒。2. 6CPV-YNR株致弱评价试验CPV-YN毒株经CRFK传代后对犬的致病力逐渐减弱。CPV-YN第5和第10代次毒对 犬的致病力均为100%，但死亡率开始出现下降，发病犬出现体温升高平均在41°C左右、鼻 流清液、排稀便等临床症状；CPV-YN第20、30、50代次毒对犬的致病力由80%下降到20%， 从50代开始感染犬不出现死亡。从80代开始到110代CPV-YN对犬的发病率和死亡率都 降到0。对照犬均正常，见表2。2.7CPV-YNR株免疫效力初步评价免疫组(A、B、C组)犬在接种后21天，皮下攻同源强毒，观察21天无发病现象，也 无死亡发生。而对照组(D组)犬则有100%发病，死亡率为40%。发病犬表现为体温升高 平均在40。C左右、呕吐、排番茄汁样便等临床症状，详见表1。表ICPV-YNR株免疫效力试验
权利要求
一株由犬细小病毒(Canine parvovirus)强毒株CPV YN传代致弱所得到的弱毒疫苗株，其特征在于，其微生物保藏号是CGMCC No.3841。
2.权利要求1所述的犬细小病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗由犬细小病毒所致疾 病药物中的用途。
3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于所述的由犬细小病毒所致疾病包括犬急 性出血性胃肠炎或幼犬急性心肌炎。
4.一种预防或治疗由犬细小病毒所致疾病的疫苗组合物，其特征在于由权利要求1 所述的有效量的犬细小病毒弱毒疫苗株和药学上可接受的载体或辅料组成。
5.按照权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于所述的由犬细小病毒所致疾病包 括犬急性出血性胃肠炎或幼犬急性心肌炎。
全文摘要
本发明公开了犬细小病毒弱毒疫苗株及其应用。本发明将所分离的犬细小病毒强毒株通过细胞上传代，培育了犬细小病毒弱毒疫苗株，其微生物保藏号是CGMCC No.3841。安全性和免疫原性试验结果表明，本发明弱毒疫苗株CPV-YNR株对同源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力，具有良好的免疫原性，本发明弱毒疫苗株CPV-YNR可制备成单苗或联苗，可有效预防或治疗由犬细小病毒所致疾病。本发明弱毒疫苗株CPV-YNR遗传性稳定，具有免疫持久、效果好、安全可靠、保存期长等优点。
文档编号A61P9/00GK101942419SQ201010244838
公开日2011年1月12日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者刘大飞, 刘立奎, 张洪英, 曲联东, 王牟平 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所