专利名称：犬瘟热弱毒疫苗株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及弱毒疫苗株，尤其涉及涉及一株犬瘟热病毒强毒株CDV-YB以及由该 强毒株传代致弱的弱毒疫苗株，本发明还涉及该弱毒疫苗株在制备预防或治疗犬瘟热生物 制品中的用途，属于犬瘟热的防制领域。
背景技术：
犬瘟热是一种犬类等动物的急性传染病，幼龄动物多为急性、致死性经过，成年动 物可呈慢性持续性感染，临诊以双相热型、粘膜卡他、中枢神经症状及足垫肿胀为主要特 征。该病自1926年被发现以来几乎呈世界性分布，是当前对我国养犬业、毛皮动物养殖业 和野生动物保护业危害最大的疾病之一，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，经济损失惨 重。近年来，包括大熊猫、小熊猫以及狮、虎、豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的 称猴属和鳍足目海豹科等多种动物均有CD自然发病的报道，甚至人也有CDV感染的病例， 并且CDV自然感染的动物范围还有不断扩大的趋势，其危害也越来越大(蔡宝祥.家畜传 染病学(第三版)·北京中国农业出版社.2001，347-351.)。国外为预防与控制该病，已研制出多种商品用单苗与联苗；国内已有犬用五联苗 (狂犬病、犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒2型病和细小病毒病)、犬用三联苗(犬瘟热、狂犬病 和犬细小病毒)研制成功的报道。哈尔滨兽医研究所也研制成功犬瘟热单苗。但目前以上 疫苗存在造价昂贵，抗原针对性不强等缺点，因此，开发一种新型高效的⑶疫苗已迫在眉睫。
发明内容
本发明目的之一是提供一株由犬瘟热病毒强毒株传代致弱的弱毒疫苗株 (CDV-YBR)。本发明目的之二是将上述弱毒疫苗株应用于预防或治疗犬瘟热病。本发明目的是通过以下技术方案来实现的犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定本发明对来自吉林省延边地区发病犬，临床上 表现为体温升高，眼、鼻流脓性分泌物的自然发病而死的犬，取肠内容物为病料，接种于鸡 胚成纤维细胞(CEF)进行病毒的分离，并对分离株进行了形态学特征、血凝特性、动物感染 及RT-PCR鉴定。结果表明病料接种CEF细胞产生明显的细胞病变(CPE)，电镜负染观察接 毒细胞培养物见有典型的副粘病毒粒子。分离株不凝集鸡和人“0”型红细胞，动物感染试 验的接种犬出现明显的临床症状和病理变化。用RT-PCR技术检测病毒细胞培养液，扩增出 的片段长为600bp，与预期设计的长度相同，由此确证分离株为犬瘟热病毒，命名为CDV-YB 株。本发明犬瘟热病毒弱毒株(CDV-YBR)的培育将分离的犬瘟热病毒(CDV-YB株) 通过连续接种鸡胚成纤维细胞(CEF)传代至70代，之后转在Vero细胞上传20代，然后继 续在鸡胚成纤维细胞(CEF)上传至105代。在传代过程中，病毒的滴度逐渐提高，毒株越来越适应CEF和Vero细胞。但病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐减低；通过形态 学鉴定、纯净性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验，结果验证了培育的CDV-YB弱 毒株(CDV-YBR)具有典型的副粘病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染。本发明将所分离的犬瘟热病毒弱毒株(CDV-YBR)提交专利认可机构保藏，其微生 物保藏号是=CGMCC No. 3810 ；分类命名为犬瘟热病毒；保藏时间是2010年5月14日；保 藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明将所分离的⑶V-YB株通过在CEF和Vero上传代、克隆，培育了⑶V-YB致弱 毒株(CDV-YBR株)，致弱评价试验证明了致弱毒株培育成功；同时，通过对病毒的形态学观 察、纯粹性检验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验结果验证了本发明所培育的CDV-YBR 株具有典型的副粘病毒粒子特征，纯净无外源病毒污染；从免疫效力试验结果可以看出，本 发明犬瘟热病毒弱毒疫苗株(CDV-YBR)对同源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力。由此 可见，CDV-YBR株具有良好的免疫原性，可以对犬的犬瘟热病毒感染提供较好的免疫保护作 用，是理想的疫苗候选毒株，本发明弱毒疫苗株CDV-YBR可制备成单苗或联苗(活疫苗或灭 活疫苗)，可有效预防或治疗犬瘟热。本发明弱毒疫苗株CDV-YBR遗传性稳定，有免疫持久、 效果好、安全可靠、保存期长等优点。
图1犬瘟热病毒(⑶V-YB)分离株的病毒粒子电镜照片。图2A 犬瘟热病毒(⑶V-YB)分离株的荧光照片；B 阴性对照。图3犬瘟热病毒(CDV-YB)分离株电泳结果；1 :M :DL2000 Marker ；2 阳性对照3 CDV-YB分离株；4:阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1犬瘟热病毒(⑶V-YB)分离株的分离鉴定1.1试验材料1.1.1 病料来自吉林省延边地区发病犬，临床上表现为体温升高，眼、鼻流脓性分泌物，病犬 经大量抗生素治疗无效，采集肠内容物作病毒分离。1. 1.2细胞、营养液及试剂鸡胚成纤维细胞由本实验室制备，细胞生长液及维持液分别为含10%和2%犊牛 血清的MEM营养液以及无血清的DMEM ；FITC标记的羊抗兔二抗、凝胶回收试剂盒均购自宝 生物工程有限公司，CDV A75-17株和5804株购自ATCC。1.1. 3试验动物2 4月龄健康幼犬(⑶V抗体效价< 1:2)。
1. 2 方法1. 2. 1病料处理分别取上述病料，加入无血清DMEM，离心取上清，微孔滤膜除菌，加抗生素后，菌检 阴性者-20°C保存，以备病毒分离用。1. 2. 2病毒分离将冻存处理的病料按培养量的10%接种CEF单层，33°C吸附lh，加入维持液继续 培养，逐日观察细胞病变(CPE)，将出现CPE的细胞瓶，反复冻融3次，继续传代。2病毒的鉴定2. 1电镜观察传三代后的细胞培养液冻融3次，5000r/min离心IOmin取上清，用0. 5%的磷钨 酸负染后，电镜观察。2. 2病毒的生物学特性2. 2. 1病毒理化特性试验取病毒的鸡胚成纤维细胞第5代培养物，分成4瓶，按常规方法分别进行耐热性、 耐酸性、乙醚敏感性及病毒核酸型鉴定试验。2. 2. 2病毒血凝特性试验按常规方法配0. 5%鸡血红细胞和0. 5%人“0”型血红细胞悬液，取上清病毒液待 检。血凝试验采用微量血凝法测定细胞培养物对鸡和人“0”型血红细胞的HA效价。2. 3间接免疫荧光试验(IFA)将分离的病毒接种于96孔板的CEF细胞，接毒后96h，PBS洗涤1次，用预冷的丙 酮乙醇(3 2)固定8min，用兔抗⑶V阳性血清作为一抗，37°C作用45min，用FITC标记 的羊抗兔IgG作为二抗，在荧光倒置显微镜下观察，同时设未接毒的正常CEF细胞作对照。2. 4RT-PCR 鉴定2. 4. IRNA 的提取取250 μ 1冻融的病毒液，加入750 μ 1的TRIzol试剂，混勻后室温放置5min，加 Λ 200 μ 1氯仿，剧烈振荡15s，室温放置IOmin, 4°C 10000r/min离心lOmin，小心吸取上层 水相转移到另一离心管内，加入等体积的异丙醇后室温放置10min，4°C 10000r/min离心 IOmin,弃上清，沉淀中加入预冷的75%乙醇lmL，4°C 10000r/min离心lOmin，弃上清，干燥， 将沉淀溶于40μ1 DEPC水中，用于反转录。2. 4. 2引物的设计与合成引物设计根据CDV的M蛋白基因同源性分析，选择保守区域作为PCR扩增的靶序 列，设计和筛选出 了一对引物，Pl :5，-AAA TCC TGT GTT ACC CGC TC-3，；p2 :5，-ACG TCC TGG ACC CTA AGT TTT G-3’ .扩增片段为600bp，引物由宝生物(大连)有限公司合成。2. 4. 3病毒cDNA链的反转录按照鼠源反转录酶(M-MLV)的说明书进行操作，采用20 μ 1反应体系RNA7 μ 1、 1 XRT-Buffer 4 μ l.dNTP 6 μ l、pll μ 1、M_MLV 1 μ l.RNase inhibitorl μ 1，42°C水浴 lh， 70°C lOmin，置-20°C备用。2. 4. 4PCR扩增病毒的cDNA片段反应体系25μ 1 分别加入反转录产物2μ l、10XPCR_buffer 2. 5 μ 1, dNTP2 μ 1、Pl和p210pmol/L各1 μ 1，DNA聚合酶0. 25 μ 1，用去离子水补至25 μ 1，于PCR仪上 进行反应。PCR程序为94°C预变性30s，53. 5°C退火45s，72°C延伸45s，35个循环；72°C延 伸lOmin，反应结束后取产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。2. 5 测序用凝胶回收试剂盒回收目的片段，将其克隆入pMDIS-T载体中，构建重组质粒，经 PCR鉴定后交由宝生物工程有限公司测序，基因序列与GenBank中其它⑶V序列进行比较分 析。2. 6分离病毒株对幼犬的感染试验选择野毒株A75-17、5804与分离的⑶V-YB做幼犬感染试验，将40只2 4月龄犬 随机分为4组，每组10只，分开饲养，1 3组分别皮下接种A75-17、5804和分离的⑶V-YB 株，剂量为Iml/犬(含400TCID5Q)，第4组皮下接种灭菌生理盐水作为对照组，Iml/犬。观 察21d，记录各犬的临诊症状、发病和死亡情况及剖检变化。3 结果 3. 1病毒的分离结果应用鸡胚成纤维细胞分离病毒第一代，未见典型CPE，盲传至第三代2d (33°C )时 可见细胞圆缩，4d可见大量细胞融合性变化，胞浆空泡化，部分细胞坏死脱落，继续传3代 后出现了规律性细胞融合病变。3. 2电镜观察结果病毒主要在胞浆内增殖，在细胞膜表面装配，以出芽方式由细胞膜向外释放。在胞 浆内和细胞外可见大量不同形态的病毒颗粒。成熟的病毒粒子可见囊膜，囊膜上可见纤突 样结构。电镜负染观察病毒形态，可见典型的副黏病毒特征样的病毒粒子，见图1。3. 3病毒的生物学特性结果3. 3. 1病毒理化特性试验结果该分离株经乙醚、酸、热处理后，TCID5tl与对照组分别降低3. 2,2. 7,3. 1 ；病毒对乙 醚敏感，说明病毒有囊膜，对酸、热的抵抗力差；病毒经BUDR作用后，病毒的增殖未受影响， 说明病毒的核酸型为RNA。上述理化特性符合CDV的基本特征。3. 3. 2病毒血凝特性试验结果在37°C下分离株对0. 5%的鸡和人“O”型血红细胞 均无凝集性。3. 4荧光抗体试验结果在对照成立的前提下，接种病毒的CEF细胞出现特异性的 亮绿色荧光。见图2。 3. 5RT-PCR 鉴定结果利用合成的引物对分离株病毒进行RT-PCR扩增，结果得到与预期片段相符的核 酸电泳带(600bp)，见图3。3. 6序列测定结果对⑶V-YB分离株的PCR产物克隆后测序，将所得序列与GenBank中⑶V序列进 行比较分析，证明所得病毒序列为CDV病毒序列。根据所测得的M蛋白基因部分序列，与 GenBank中其余9个⑶V株的M蛋白基因序列进行比较，⑶V-YB株与⑶V美国野毒株A75-17 株的核苷酸同源关系较近，可达到94. 7%。3. 7分离病毒株(⑶V-YB)对幼犬的感染试验
幼犬经野毒株A75_17、5804和分离的⑶V-YB接种后，发病率均为100%，死亡数在 4/10 6/10之间，其中⑶V-YB的致死亡率达4/10。对照犬均正常，无临床反应和变化，见 表1。临床症状主要表现为双相热、腹泻、精神沉郁、流鼻涕等主要症状，见表2。表1 ⑶V-YB对幼犬的感染试验 (+代表出现该种症状，“代表不出现该种症状)实验结论4. 1根据电镜观察、中和试验和动物感染动物试验结果，证实了本发明所分离的病 毒毒株是CDV。
4. 2应用RT-PCR技术及测序分析进一步证实了所分离的病毒是⑶V。4. 3根据所测得M蛋白基因部分序列，与GenBank中的2个流行的野毒株核苷酸同 源关系比较及CDV-YB对幼犬的感染试验结果鉴定该毒株是CDV强毒株。4. 4⑶V-YB株毒力要强于其余2个毒株。4. 5发病犬的临床症状不尽相同，只有少数犬具有所有的临床症状。实施例2犬瘟热病毒弱毒疫苗株CDV-YBR的培育1材料和方法1.1试验材料试验动物为2 4月龄的健康犬(⑶V抗体效价< 1 2)；抗犬瘟热病毒特异性 血清、红细胞悬液由本实验室制备，强毒为⑶V-H第7代(实施例1所分离)。1. 2⑶V-YB弱毒株的培育与鉴定1. 2. ICDV-YB弱毒株的培育通过CEF细胞传代⑶V-YB至70代，之后转在Vero细胞上再传20代，之后又回到 CEF细胞传代CDV-YB至105代。1. 2. 2⑶V-YB弱毒株的形态学观察将收获的CDV-YB 5、10、20、30、50、70、90、100、105 代次病毒细胞培养物 5000r/ min离心30min，取上清经2000rpm超速离心，4°C离心2h，沉淀用适量的PBS (pH7. 0)悬浮， 磷钨酸负染电镜观察。1. 2. 3CDV-YB的纯净性检验取CDV-YB的5、10、20、30、50、70、90、100、105代次毒，按现行《中华人民共和国兽
药典》附录进行，应无细菌、霉菌和支原体污染。1. 2. 4病毒含量测定取病毒的5、10、20、30、50、70、90、100、105代培养物，分别做10倍系列稀释后，各
取10_4、10_5、10_6、10_7四个稀释度，接种CEF单层。每个稀释度接种4瓶，每瓶lml。观察 5d，记录各稀释度病变细胞瓶数，按照Reed-Muench法计算TCID5(1。1.2. 5病毒的特异性检验分别取CDV-YB 的 5、10、20、30、50、70、90、100、105 代次毒，用 MEM 液稀释成 100TCID5Q/ml，与等量抗犬瘟热特异性血清混合，置37°C水浴中和lh，接种CEF，每瓶lml。 观察5d，逐日记录细胞CPE。同时设不中和的病毒对照组2瓶。1. 2. 6外源病毒检验1. 2. 6. 1致细胞病变外源病毒的检验分别取CDV-YB 的 5、10、20、30、50、70、90、100、105 代次毒，将 CDV-YB 用 MEM 液稀 释成100TCID5(1/0. 1ml，与等量抗犬瘟热病毒特异性血清混合，置37°C水浴中和lh，取2个 方瓶(IOml容量)的MDCK细胞，接种中和后的病毒液lml，在37°C下吸附lh，观察5 7d， 检查是否出现由接种物引起的CPE，同时设未中和的病毒接种细胞2瓶为对照。1. 2. 6. 2致红细胞吸附的外源病毒检验将上述接种中和病毒的细胞培养瓶，用PBS洗涤细胞单层3次，加入红细胞悬 液，在4°C培养30min，用PBS洗涤，检查红细胞吸附情况。1. 2. 7CDV-YBR株致弱评价试验
50只2 4月龄犬随机分成10组，每组5只，1 9组犬分别用⑶V-YB的5、10、 20、30、50、70、90、100、105代次毒接种，各代次病毒105_ 5TCID50/犬，观察21d，记录临床发病 数。同时设第10组为对照5只犬，接种相同剂量的灭菌生理盐水。1. 2. 8⑶V-YBR株免疫效力试验15只2 4月龄犬随机分成A组、B组和C组，A组、B组各5只为试验组，C组5 只作为对照，A组、B组犬用CDV-YB的90、105代次毒接种，接种剂量为104_tlTCID5tl/犬，C组 接种灭菌生理盐水lml。21天后，A、B、C组犬皮下攻击同源强毒，剂量为200TCID5Q/犬。攻 毒后观察21天，记录临床保护数。2实验结果2. 1⑶V-YB弱毒株的培育及形态学观察将CDV-YB的5、10、20、30、50、70、90、100、105代次毒细胞培养物负染电镜标本中，
可见到典型副粘病毒粒子，直径为100 300nm，表面有厚约7. 5 8. Onm的双层轮廓的囊 膜，内部由直径约15 17nm拉链状核衣壳螺旋体构成。电镜切片样品能在感染细胞浆中 见到病毒包涵体和副粘病毒粒子。2. 2CDV-YB的纯粹性检验细菌、霉菌与支原体检验按现行《中华人民共和国兽药 典》附录所述方法进行，无细菌、霉菌及支原体生长。2. 3病毒含量测定CDV-YB的5、10、20、30、50、70、90、100、105代次毒的病毒含量。2. 4病毒的特异性检验⑶V-YB的各代毒中和后接种CEF，观察5d，细胞均无CPE ； 对照组2瓶细胞在90 120h出现典型的CPE。2. 5外源病毒检验2. 5. 1致细胞病变的外源病毒检验各代次病毒中和后接种CEF，经观察均无CPE产 生，对照组细胞出现明显的CPE。2. 5. 2各代次病毒均不能凝集鸡外周血红细胞，说明病毒液中不含能使鸡外周血 红细胞凝集的其它病毒。2. 6CDV-YBR株致弱评价试验⑶V-YB毒株经CEF传代后对犬的致病力逐渐减弱。⑶V-YB第5代和第10代毒对 犬的致病力均为100%，死亡率由60%降至40%，发病犬出现体温升高平均在41°C左右、 支气管炎、腹泻、结膜炎等临床症状；CDV-YB从20代到70代毒对犬的致病力由80%降至 20%，死亡率也由20%降至0。⑶V-YB从90代到105代毒对犬的致病力和死亡率均为0， 对照犬均正常。因此本发明将CDV-YB的90代毒确定为CDV-YB的致弱候选毒株，将其命名 为CDV-YBR株，其微生物保藏号是CGMCC No. 3810。2. 7CDV-YBR株免疫效力试验免疫组(A、B组)犬在接种⑶V-YBR株后21d，皮下攻同源强毒，观察21天无发病 现象，也无死亡发生，见表3。而对照组(C组)犬则有100%发病，死亡率为60%。发病犬 表现为体温升高可达到41°C、结膜炎、腹泻、抽搐等临床症状。表3⑶V-YBR株免疫效力试验 3实验结论CDV-YB株通过在CEF和Vero上传代、克隆，培育了 CDV-YB致弱毒株(CDV-YBR 株)，致弱评价试验证明了致弱毒株培育成功；同时，通过对病毒的形态学观察、纯粹性检 验、病毒的特异性和外源病毒检验等试验结果验证了培育的CDV-YBR株具有典型的副粘病 毒粒子特征，纯净无外源病毒污染；从免疫效力试验结果可以看出，CDV-YBR株对同源强毒 攻击的犬可以提供很好的保护力。由此可见，CDV-YBR株具有良好的免疫原性，可以对犬的 犬瘟热病毒感染提供较好的免疫保护作用，是理想的疫苗候选毒株。
权利要求
一株犬瘟热病毒(Canine distemper virus)弱毒疫苗株，其特征在于，微生物保藏号是CGMCC No.3810。
2.权利要求1所述的犬瘟热病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗犬瘟热药物中的用途。
3.一种预防或治疗犬瘟热的疫苗组合物，其特征在于由权利要求1所述的有效量的 犬瘟热病毒弱毒疫苗株和药学上可接受的载体或辅料组成。
全文摘要
本发明公开了犬瘟热弱毒疫苗株及其应用。本发明将所分离的犬瘟热强毒株通过传代、克隆，培育了犬瘟热弱毒疫苗株，其微生物保藏号是CGMCC No.3810。本发明犬瘟热病毒弱毒疫苗株对同源强毒攻击的犬可以提供很好的保护力，具有良好的免疫原性，可以对犬的犬瘟热病毒感染提供较好的免疫保护作用。本发明弱毒疫苗株可制备成单苗或联苗(活疫苗或灭活疫苗)，可有效预防或治疗犬瘟热。本发明弱毒疫苗株遗传性稳定，具有免疫持久、效果好、安全可靠、保存期长等优点。
文档编号A61P31/14GK101914503SQ20101024496
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者刘大飞, 刘立奎, 张洪英, 曲联东, 王牟平 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所