专利名称：用于心肌梗死动物中自体脂肪干细胞移植模型构建方法
技术领域：
本发明涉及动物模型技术领域，是一种用于心肌梗死动物中自体脂肪干细胞移植 模型构建方法。
背景技术：
缺血性心脏疾病——心脏肌肉供血不足——是世界的首要死亡原因，包括大多数 低收入和中等收入国家。对于缺血性心脏病，现今的治疗策略包括恢复心脏再灌注和药物 改善慢性疾病症状，而干细胞和祖细胞的发现对治疗缺血性心脏病已经变革了实验研究并 引领了对临床研究的探索。近来脂肪源干细胞成为其热点之一，然而，大多数动物实验均基 于同种异体的脂肪干细胞治疗心脏缺血性疾病。如Katja、Gwak等的研究，究其原因，很大 一部分是自体脂肪干细胞治疗缺血性疾病的动物模型尚未成熟，众所周知，由于细胞来源 于自身，这将从根本上解决同种异体器官移植中免疫排斥问题，也从根本上解决供体来源 不足的问题。故自体干细胞移植的意义比异体移植大很多，因此备受人们的关注和重视。有研究者认为，由于脂肪干细胞具有来源丰富，收集细胞量大、患者易于接受、细 胞分离简单等众多优点，有可能会成为继骨髓间充质干细胞之后下一个运用于临床的干细 胞，然而，目前关于脂肪干细胞治疗的研究仍处在探索阶段，这些研究许多是基于移植大鼠 同种异体的脂肪干细胞于心脏梗死区域，究其原因很大一部分是由于大鼠自体脂肪干细胞 移植治疗心肌梗死的动物模型的建立尚不成熟，鉴于上述原因，大鼠自体脂肪干细胞治疗 心肌梗死的动物模型是十分有必要的。尤其是在21世纪，干细胞移植治疗缺血性疾病的研 究方兴未艾，作为治疗缺血性疾病的动物实验平台，大鼠自体脂肪干细胞治疗心肌梗死疾 病模型的建立将发挥重大的科研价值。
发明内容
本发明提供了一种可用于大鼠心肌梗死的动物模型中自体脂肪干细胞移植的模 型构建方法，克服了上述现有技术存在的问题，其具有廉价易得，操作简单，心梗成功率高， 效果可靠等优点。本发明的技术方案是通过以下措施来实现的一种用于心肌梗死动物中自体脂肪 干细胞移植模型构建方法，其按下述步骤进行
步骤一 2%戊巴比妥钠、10%水合氯醛、阿托品按3 2 1体积比例混合配置成麻醉 复合溶液；
步骤二 分别从大鼠腹股沟及肩胛骨提取大鼠自体脂肪，其具体步骤如下 将上述麻醉复合液进行腹腔注射，腹股沟组大鼠以第二乳头为标志向下至大鼠膝关节 备皮，固定于大鼠手术板，75%酒精消毒备皮区域后移至超净台紫外线照射30分钟，遮蔽双 眼，医用碘伏消毒手术区域，沿腹股沟中点行X型开口，眼科镊及眼科剪配合提取脂肪，操 作完成后缝合皮肤；肩胛骨组以第二乳头为标志向头部方向备皮至颈部，采用T型切口提 取脂肪，眼科镊及眼科剪配合提取脂肪，操作完成后缝合皮肤；术后腹腔注射40U青霉素预
3防感染；
步骤三大鼠心肌梗死模型的建立
3周后，运用上述复合麻醉剂腹腔注射麻醉后连接标准导联心电图检测，胸部及颈部备 皮75%酒精常规消毒铺巾，颈部正中横切口，行气管切开术并插管，缝合线固定后连接小动 物呼吸机，以第二乳头为标志纵行切开皮肤，钝性分离各层组织直至第3肋下缘，小动物扩 胸器撑开3、4肋间肌，充分暴露心脏，剪开心包，于肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状动 脉主干为标志，于左心耳根部下方2-3mm处进针，深度为0. 5mm左右，6/0缝合针穿过心肌表 层，肺动脉圆锥旁出针，小心结扎左冠状动脉前降支LAD ；逐层缝合，术毕腹腔注射40U青霉 素预防感染。对上述本发明的技术方案可进一步进行如下的选择或/和优化
在上述步骤三中，所述的大鼠心肌梗死是急性心肌梗死或是陈旧性心肌梗死。上述模型是多种心脏缺血性疾病模型及再生医学相关领域动物模型。本发明具有以下优点1、提取大鼠自体脂肪组织，根本上解决同种异体器官移植 中免疫排斥问题；2、具有操作简单，大鼠存活率较高，心梗成功率高，效果可靠等优点，可 作为小动物自体脂肪干细胞移植治疗心脏缺血性疾病的研究模型，适用于细胞移植和再生 医学领域。本发明首次成功建立了大鼠自体脂肪干细胞治疗心肌梗死动物模型，可进一步 用于脂肪干细胞在大鼠心肌梗死模型方面的研究，甚至对各相关领域研究均能起到积极影 响。对人自体干细胞移植治疗心肌梗死疾病的临床开展具有一定指导意义。
附图1为本发明的相差显微镜下P2代脂肪干细胞(200X)图。附图2为本发明的大鼠腹股沟组及肩胛骨组大鼠存活曲线图。附图3为本发明的超声心动图检测心功能(二尖瓣水平短轴切面)图。附图4为本发明中大鼠心肌梗死区域HE染色剂染色切片图。附图5为本发明的大鼠心肌梗死区域Masson染色剂染色切片图。
具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可依据本发明的技术方案和实际情况来确定具体 的实施方式。下面结合实施例对本发明作进一步描述
为了更好的理解本发明的实质，下面提供大鼠自体脂肪干细胞移植治疗心肌梗死模型 构建的一种实施方案，并以实验及结果来进一步说明本发明，但是这些具体实施方案不是 要以任何方式限制所要求保护的发明范围。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域 中的传统动物解剖学、细胞生物学等等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解 释。实施例1 材料与方法。一.材料。1.实验动物清洁级spreague-dawley (SD)大鼠60只，雌雄不限，体重80_120g， 由新疆医科大学实验动物中心提供。随机分为腹股沟组(30只)和肩胛骨组(30只)。
2.手术器械显微外科手术器械一套(上海手术器械厂)，基础外科手术器械若 干，医用无损伤缝合线6-0和9-0若干(上海医用缝合针厂)纱布，棉球，75%酒精，医用碘酒。3.复合麻醉剂的制备戊巴比妥钠200mg溶于IOml蒸馏水中配置成2%溶液、Ig 水合氯醛溶于IOml蒸馏水中配置成10%溶液、阿托品，按照体积比例3 2 1混合制成麻醉
复合液。二.手术方法。1.大鼠不同部位脂肪的提取吸取上述麻醉复合溶液(30ml/kg)腹腔注射麻醉， 腹股沟组大鼠以第二乳头为标志向下至大鼠膝关节备皮(图1A)，固定于大鼠手术板，75% 酒精消毒备皮区域后移至超净台紫外线照射30分钟，(遮蔽双眼)(图1C)，医用碘伏消毒手 术区域，沿腹股沟中点行X型开口，眼科镊及眼科剪配合提取脂肪(图1E)，若遇穿行脂肪区 域血管，结扎后再行脂肪提取，以防术后出血。操作完成后缝合皮肤(图1G)。肩胛骨组以 第二乳头为标志向头部方向备皮至颈部(图1B)，采用T型切口提取脂肪，余操作过程同腹 股沟组(图D、F、H)。2.大鼠脂肪干细胞提取按照zuk等方法提取脂肪干细胞，简要叙述之将脂肪 组织剪碎至l_3mm小块，加入无血清培养基，胶原酶，消化1小时，600g离心8分钟，200目筛 网过滤，接种至含有10%胎牛血清的a-MEM培养基中培养，3-5天换液，待细胞融合80%_90% 按1:3传代。获得脂肪干细胞(图2)。3.大鼠心肌梗死模型的制备3周后，SD大鼠称重，体重240_300g，运用上述复 合麻醉剂腹腔注射麻醉后连接标准导联心电图检测，胸部及颈部备皮75%酒精常规消毒铺 巾，颈部正中横切口，行气管切开术并插管，缝合线固定后连接小动物呼吸机，调整潮气量 3-5ml/100g,呼吸70次/min，以第二乳头为标志纵行切开皮肤，钝性分离各层组织直至第 3肋下缘，小动物扩胸器撑开3、4肋间肌，充分暴露心脏，无菌棉球放入左侧胸腔保护左肺， 镊子提取心包壁层，剪开心包，于肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状动脉主干为标志，于 左心耳根部下方2-3mm处进针，深度为0. 5mm左右，6/0缝合针穿过心肌表层，肺动脉圆锥 旁出针，小心结扎左冠状动脉前降支(LAD)。根据心电图I avL导联ST段弓背向上抬高大 于0. Imv以及室壁颜色变白、活动度减弱为标志确定冠脉结扎成功。取出保护左肺的棉球 后逐层缝合，关闭胸腔，待自主呼吸恢复后拔出通气导管，拉拢气管软骨并缝合。术毕腹腔 注射40U青霉素预防感染。实施例2:结果。1.大鼠存活曲线描述脂肪提取术后心梗组总存活率为85%其中腹股沟组存 活率为76. 67%，肩胛骨组存活率为93. 3% ；行冠状动脉结扎术后，心梗组总存活率为90%，其 中腹股沟组存活率为82. 6。肩胛骨组存活率为92.8%。见图3。2.大鼠心肌梗死大鼠心功能超声检测超声结果(图4)提示，结扎后四周，左室 前壁可见间断性室壁活动减弱，LVEDD、LVESD明显增大，FS EF明显下降。3.大鼠心肌梗死区域组织病理学检测LAD结扎术后4周梗死区可见纤维组织增 生明显，排列无序，明显可见炎症细胞浸润，部分心肌细胞伊红染色增强，结果见图5A (HE 染色)。MI组梗死区胶原纤维增生明显，成条索状，包绕心肌束，胶原纤维融合明显，结果见 图5B (Masson三色染色)。
权利要求
一种用于心肌梗死动物中自体脂肪干细胞移植模型构建方法，其特征在于按下述步骤进行步骤一2%戊巴比妥钠、10%水合氯醛、阿托品按3﹕2﹕1体积比例混合配置成麻醉复合溶液；步骤二分别从大鼠腹股沟及肩胛骨提取大鼠自体脂肪，其具体步骤如下将上述麻醉复合液进行腹腔注射，腹股沟组大鼠以第二乳头为标志向下至大鼠膝关节备皮，固定于大鼠手术板，75%酒精消毒备皮区域后移至超净台紫外线照射30分钟，遮蔽双眼，医用碘伏消毒手术区域，沿腹股沟中点行X型开口，眼科镊及眼科剪配合提取脂肪，操作完成后缝合皮肤；肩胛骨组以第二乳头为标志向头部方向备皮至颈部，采用T型切口提取脂肪，眼科镊及眼科剪配合提取脂肪，操作完成后缝合皮肤；术后腹腔注射40U青霉素预防感染；步骤三大鼠心肌梗死模型的建立3周后，运用上述复合麻醉剂腹腔注射麻醉后连接标准导联心电图检测，胸部及颈部备皮75%酒精常规消毒铺巾，颈部正中横切口，行气管切开术并插管，缝合线固定后连接小动物呼吸机，以第二乳头为标志纵行切开皮肤，钝性分离各层组织直至第3肋下缘，小动物扩胸器撑开3、4肋间肌，充分暴露心脏，剪开心包，于肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状动脉主干为标志，于左心耳根部下方2 3mm处进针，深度为0.5mm左右，6/0缝合针穿过心肌表层，肺动脉圆锥旁出针，小心结扎左冠状动脉前降支LAD；逐层缝合，术毕腹腔注射40U青霉素预防感染。
2.根据权利要求1所述的用于心肌梗死动物中自体脂肪干细胞移植模型构建方法，其 特征在于步骤三中，所述的大鼠心肌梗死是急性心肌梗死或是陈旧性心肌梗死。
3.根据权利要求1或2所述的用于心肌梗死动物中自体脂肪干细胞移植模型构建方 法，其特征在于模型是多种心脏缺血性疾病模型及再生医学相关领域动物模型。
全文摘要
一种用于心肌梗死动物中自体脂肪干细胞移植模型构建方法，包括配置麻醉复合溶液步骤、分别从大鼠腹股沟及肩胛骨提取大鼠自体脂肪步骤和大鼠心肌梗死模型的建立步骤。其优点如下1、提取大鼠自体脂肪组织，根本上解决同种异体器官移植中免疫排斥问题；2、具有操作简单，大鼠存活率较高，心梗成功率高，效果可靠等优点，可作为小动物自体脂肪干细胞移植治疗心脏缺血性疾病的研究模型，适用于细胞移植和再生医学领域。本发明首次成功建立了大鼠自体脂肪干细胞治疗心肌梗死动物模型，可进一步用于脂肪干细胞在大鼠心肌梗死模型方面的研究，甚至对各相关领域研究均能起到积极影响。对人自体干细胞移植治疗心肌梗死疾病的临床开展具有一定指导意义。
文档编号A61B19/00GK101947133SQ20101026252
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者单志桂, 杨毅宁, 王宝珠, 王磊, 陈邦党, 马依彤 申请人:新疆医科大学第一附属医院